CN105087621A - 一种海参组织蛋白酶的原核表达方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种海参组织蛋白酶的原核表达方法，包括，其中：包括对海参组织蛋白酶基因序列克隆；在获得海参组织蛋白酶基因序列克隆的基础上构建具有海参组织蛋白酶基因序列的融合表达载体，然后将融合表达载体转化到表达宿主菌进行诱导表达目标蛋白。因而本发明有采用大肠杆菌低成本表达海参组织蛋白酶、表达产物品质容易控制的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物技术领域，尤其涉及一种海参组织蛋白酶的原核表达方法。
背景技术
原胶蛋白是机体组织的结构蛋白，其诸多生理功能已被系统研究和广泛认可。随着胶原蛋白产业的快速发展，胶原蛋白酶解工艺中的关键生产要素—蛋白酶的需求也不断增长。目前较为常用的各类酶普遍存在胶原蛋白酶解效率不高的缺点，而运用基因工程技术开发新型胶原蛋白酶可以弥补这一致命缺陷，且采用生物工程技术生产的胶原蛋白酶产品品质易控、生产成本低廉。刺参具有极强的自溶能力究其本质即是组织细胞内蛋白酶对体壁组织蛋白（主要为胶原蛋白）的高效酶解作用。然而，有关刺参组织蛋白酶基因的筛选、功能研究及相关蛋白酶产品开发却尚未系统开展。本发明针对现有技术的不足，提供一种海参组织蛋白酶的原核表达方法。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术提供一种采用大肠杆菌低成本表达海参组织蛋白酶、表达产物品质容易控制的一种海参组织蛋白酶的原核表达方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种海参组织蛋白酶的原核表达方法，包括，其中：包括对海参组织蛋白酶基因序列克隆；在获得海参组织蛋白酶基因序列克隆的基础上构建具有海参组织蛋白酶基因序列的融合表达载体，然后将融合表达载体转化到表达宿主菌进行诱导表达目标蛋白；海参组织蛋白酶基因序列含有SEQ1序列。
为优化上述技术方案，采取的措施还包括：表达宿主菌为大肠杆菌。海参组织蛋白酶基因序列克隆所使用的扩增目标蛋白DNA片段的引物为增加EcoRI和NotI识别位点的
引物1：F:5’-CCGGAATTCATGCCAGACACTGTTGATT-3’；（SEQ3）
引物2：R:5’-ATAGTTTAGCGGCCGCTTAGACAGTTGGGTAACTG-3’。（SEQ4）
构建融合表达载体所使用的限制性内切酶为EcoRI和NotI，双酶切所获得的DNA序列片段长度约660bp，通过DNA连接酶作用，连接至pET32a，完成表达载体构建。宿主菌的诱导表达步骤如下：将构建完成的融合表达质粒转化到大肠杆菌，利用IPTG进行诱导表达目标蛋白。融合表达载体选自pET32a载体。pET32a载体的构建步骤如下：以添加限制性内切酶识别位点序列的引物，克隆制备海参组织蛋白酶成熟肽区域基因序列。使用内切酶，对PCR产物以及空载pET32a载体分别进行双酶切，通过电泳及胶回收纯化酶切产物。混合经过双酶切处理的组织蛋白酶基因片段及载体片段，使用DNA快速连接酶连接构建表达载体。IPTG诱导表达组织蛋白酶的温度低于30℃，IPTG浓度小于3mM，诱导表达的组织蛋白酶以非包涵体形式表达于大肠杆菌胞内。
本方法步骤如下：
1）预测蛋白结构分析
查找确定刺参组织蛋白酶基因全长序列的开放阅读框，确定编码序列并推测编码蛋白的氨基酸序列，采用生物信息学的方法进行蛋白质结构功能域分析并确定基因编码蛋白结构特征，明确结构域位置和所需表达的蛋白序列。
2）pET32a融合表达载体构建
以添加限制性内切酶识别位点序列的引物，克隆制备海参组织蛋白酶成熟肽区域基因序列。使用内切酶，对PCR产物以及空载pET32a载体分别进行双酶切，通过电泳及胶回收纯化酶切产物。混合经过双酶切处理的组织蛋白酶基因片段及载体片段，使用DNA快速连接酶连接构建表达载体。
3）大肠杆菌原核表达
将构建完成的融合表达质粒转化到表达宿主菌—BL21（DE3）大肠杆菌，利用IPTG进行诱导表达目标蛋白。通过诱导表达温度及时间双因素分析，优化组织蛋白酶原核表达的培养条件及诱导效果。
所述步骤1）中，使用NCBI网站BLASTX软件进行基因保守域分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)，使用ClustalW2对预测氨基酸序列进行特征分析(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)，利用signalP4.1在线软件，分析序列蛋白信号肽区域特征(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，利用PROSITE在线软件分析活性功能位点及结构域(http://prosite.expasy.org/scanprosite/)，采用PDBSUM数据库预测分析蛋白二级结构、二硫键、配体结合位点等结构信息，PROCAT数据库预测分析活性位点三维结构，NRL-3D数据库相似蛋白结构分析。通过软件分析，明确具有蛋白酶解功能的目标序列，确定扩增序列所使用的引物序列。
所述步骤1）中，所使用的扩增目标蛋白DNA片段的引物为增加EcoRI和NotI识别位点的
引物1：F:5’-CCGGAATTCATGCCAGACACTGTTGATT-3’；
引物2：R:5’-ATAGTTTAGCGGCCGCTTAGACAGTTGGGTAACTG-3’。
所述步骤2）中，所使用的限制性内切酶为EcoRI和NotI，双酶切所获得的DNA序列片段长度约660bp，通过DNA连接酶作用，连接至pET32a，完成表达载体构建。
所述步骤3）中，IPTG诱导表达组织蛋白酶的温度低于30℃，所用IPTG浓度小于3mM，诱导表达的组织蛋白酶以非包涵体形式表达于大肠杆菌胞内。
由于本发明采用了包括对海参组织蛋白酶基因序列克隆；在获得海参组织蛋白酶基因序列克隆的基础上构建具有海参组织蛋白酶基因序列的融合表达载体，然后将融合表达载体转化到表达宿主菌进行诱导表达目标蛋白；海参组织蛋白酶基因序列含有SEQ1序列。因而本发明具有采用大肠杆菌低成本表达海参组织蛋白酶、表达产物品质容易控制的优点。
具体实施方式
以下结合附实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例：一种海参组织蛋白酶的原核表达方法，包括，其中：包括对海参组织蛋白酶基因序列克隆；在获得海参组织蛋白酶基因序列克隆的基础上构建具有海参组织蛋白酶基因序列的融合表达载体，然后将融合表达载体转化到表达宿主菌进行诱导表达目标蛋白；海参组织蛋白酶基因序列含有SEQ1序列。表达宿主菌为大肠杆菌。海参组织蛋白酶基因序列克隆所使用的扩增目标蛋白DNA片段的引物为增加EcoRI和NotI识别位点的
引物1：F:5’-CCGGAATTCATGCCAGACACTGTTGATT-3’；（SEQ3）
引物2：R:5’-ATAGTTTAGCGGCCGCTTAGACAGTTGGGTAACTG-3’。（SEQ4）
构建融合表达载体所使用的限制性内切酶为EcoRI和NotI，双酶切所获得的DNA序列片段长度约660bp，通过DNA连接酶作用，连接至pET32a，完成表达载体构建。宿主菌的诱导表达步骤如下：将构建完成的融合表达质粒转化到大肠杆菌，利用IPTG进行诱导表达目标蛋白。融合表达载体选自pET32a载体。pET32a载体的构建步骤如下：以添加限制性内切酶识别位点序列的引物，克隆制备海参组织蛋白酶成熟肽区域基因序列。使用内切酶，对PCR产物以及空载pET32a载体分别进行双酶切，通过电泳及胶回收纯化酶切产物。混合经过双酶切处理的组织蛋白酶基因片段及载体片段，使用DNA快速连接酶连接构建表达载体。IPTG诱导表达组织蛋白酶的温度低于30℃，IPTG浓度小于3mM，诱导表达的组织蛋白酶以非包涵体形式表达于大肠杆菌胞内。
本发明采用的刺参的拉丁命名为Apostichopusjaponicus。
海参组织蛋白酶基因序列为SEQ1：CCAGACACTGTTGATTGGAGACCAAAGGGTTACGTCACTGGGGTCAAAGATCAGAAACAATGCGGATCCTGCTGGGCATTCAGCACCACTGGGTCACTTGAAGGTCAGATGTTCAACAAGACTGGTATGCTGGTCAGCTTGAGCGAACAGAATCTCGTCGACTGCTCTCGTAAGGAGGGTAACATGGGTTGCCAAGGGGGGCTTATGGACGACGCCTTTCAATATGTCATTGATAACGGAGGTCTTGACACCGAGGATTGTTACCCGTACAAAGCCGTGCAAGGAACTTGCATGTACAAGTCGAGCTGCAACTCTGCTGATGTTGTCAAGTTCAACGATATTCCAACTGGTAACGAGATGGCACTTCAACAAGCTGTGGCTACCGTAGGACCTGTTTCTGTCGCCATAGACGCTGCTCTCAGTTCGTTCCATATGTACCATAGCGGTGTTTACGATGACTCAATGTGCCGCAGCGACAGACAGCACTTGGATCACGGTGTGCTGGCGGTAGGTTACGGAACCATGGACGGGAAAGATTACTGGCTCGTTAAGAACAGCTGGGGCATGAGCTGGGGTGACCAGGGGTACATCATGATGTCTCGTAACAAGAACAACCAGTGTGGTATTGCAACTGCCGCCAGTTACCCAACTGTC。
参照如下方式可进行本方法的再现：
1）刺参组织蛋白酶基因全长克隆
根据已获得的刺参组织蛋白酶基因EST序列片段，设计特异性全长克隆引物，采用RACE技术扩增基因片段获得功能基因的全长cDNA序列，通过NCBI网站及蛋白翻译软件等初步分析cDNA序列的正确性。
2）预测蛋白结构分析并确定原核表达的基因片段
查找确定刺参组织蛋白酶基因全长序列的开放阅读框，确定编码序列并推测编码蛋白的氨基酸序列，采用PDBSUM数据库预测分析蛋白二级结构、二硫键、配体结合位点等结构信息，PROCAT数据库预测分析活性位点三维结构，NRL-3D数据库相似蛋白结构分析，SMART蛋白质结构功能域分析等，初步阐述基因编码蛋白结构特征，明确结构域位置。
所确定的目标基因片段序列为成熟肽区域DNA序列，通过引物序列调整改造后连接至pET32a多克隆位点的序列为：
ATGCCAGACACTGTTGATTGGAGACCAAAGGGTTACGTCACTGGGGTCAAAGATCAGAAACAATGCGGATCCTGCTGGGCATTCAGCACCACTGGGTCACTTGAAGGTCAGATGTTCAACAAGACTGGTATGCTGGTCAGCTTGAGCGAACAGAATCTCGTCGACTGCTCTCGTAAGGAGGGTAACATGGGTTGCCAAGGGGGGCTTATGGACGACGCCTTTCAATATGTCATTGATAACGGAGGTCTTGACACCGAGGATTGTTACCCGTACAAAGCCGTGCAAGGAACTTGCATGTACAAGTCGAGCTGCAACTCTGCTGATGTTGTCAAGTTCAACGATATTCCAACTGGTAACGAGATGGCACTTCAACAAGCTGTGGCTACCGTAGGACCTGTTTCTGTCGCCATAGACGCTGCTCTCAGTTCGTTCCATATGTACCATAGCGGTGTTTACGATGACTCAATGTGCCGCAGCGACAGACAGCACTTGGATCACGGTGTGCTGGCGGTAGGTTACGGAACCATGGACGGGAAAGATTACTGGCTCGTTAAGAACAGCTGGGGCATGAGCTGGGGTGACCAGGGGTACATCATGATGTCTCGTAACAAGAACAACCAGTGTGGTATTGCAACTGCCGCCAGTTACCCAACTGTCTAA。（SEQ2）
3）pET32a载体构建
根据已获得的全长基因序列开放阅读框信息序列信息，设计带有EcoRI和NotI酶切位点的特异性引物，以刺参消化道cDNA为模版，扩增获得目标序列；DNA电泳并回收获得纯化的目标DNA序列，采用EcoRI和NotI双酶切处理产物DNA和pET32a空载载体，DNA电泳并纯化酶切产物（组织蛋白酶编码DNA产物和空载pET32a），使用T4DNA快速连接酶连接构建pET32a表达载体。
4）载体的转化和融合蛋白酶表达
将连接产物载体全量（10微升）与50微升感受态BL21(DE3)细胞进行混合，冰浴30分钟后42℃加热60秒，再冰浴1分钟后，加入800微升不带抗生素的LB液体培养基，复苏培养1小时。取100微升复苏菌液，均匀涂于带有Amp的L-琼脂平板培养基上过夜培养（37℃），之后挑菌斑并进行扩增培养（37℃，500ml烧瓶摇菌）。
扩增培养至菌液OD600达到0.7时，加入IPTG并调整浓度至1mM，菌液培养温度调整至25℃，进行诱导表达，4小时候停止培养并开展表达蛋白收集和检测分析。
本发明以前期采用RACE全长克隆方法获取基因全长序列信息为基础，通过全长序列信息预测分析编码蛋白结构特征及功能活性，查找确定关键结构域。根据预测分析结果，确定接入表达系统的基因序列片段；构建大肠杆菌原核表达系统，体外表达目标蛋白；检测并阐明表达获得的蛋白酶活性功能特征。通过该方法表达的海参蛋白酶具有生产成本低、品质易控等特点，将增加胶原蛋白酶解蛋白酶可选种类，提高酶解生产效益，具有重要的经济和社会价值。
尽管已结合优选的实施例描述了本发明，然其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，能够对在这里列出的主题实施各种改变、同等物的置换和修改，因此本发明的保护范围当视所提出的权利要求限定的范围为准。
SEQUENCELISTING
<110>浙江大学舟山海洋研究中心
<120>一种海参组织蛋白酶的原核表达方法
<130>wtm-2015-01
<160>4
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>654
<212>DNA
<213>Apostichopusjaponicus
<400>1
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<210>2
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<212>DNA
<213>人工合成
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<212>DNA
<213>人工合成
<400>3
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<210>4
<211>35
<212>DNA
<213>人工合成
<400>4
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Claims (8)
1.一种海参组织蛋白酶的原核表达方法，其特征是：包括对海参组织蛋白酶基因序列克隆；在获得海参组织蛋白酶基因序列克隆的基础上构建具有所述的海参组织蛋白酶基因序列的融合表达载体，然后将所述的融合表达载体转化到表达宿主菌进行诱导表达目标蛋白；所述的海参组织蛋白酶基因序列含有SEQ1序列。
2.根据权利要求1所述的一种海参组织蛋白酶的原核表达方法，其特征是：所述的表达宿主菌为大肠杆菌。
3.根据权利要求1所述的一种海参组织蛋白酶的原核表达方法，其特征是：所述的海参组织蛋白酶基因序列克隆所使用的扩增目标蛋白DNA片段的引物为增加EcoRI和NotI识别位点的
引物1：F:5’-CCGGAATTCATGCCAGACACTGTTGATT-3’；
引物2：R:5’-ATAGTTTAGCGGCCGCTTAGACAGTTGGGTAACTG-3’。
4.根据权利要求1所述的一种海参组织蛋白酶的原核表达方法，其特征是：构建所述的融合表达载体所使用的限制性内切酶为EcoRI和NotI，双酶切所获得的DNA序列片段长度约660bp，通过DNA连接酶作用，连接至pET32a，完成表达载体构建。
5.根据权利要求1所述的一种海参组织蛋白酶的原核表达方法，其特征是：所述的宿主菌的诱导表达步骤如下：将构建完成的融合表达质粒转化到大肠杆菌，利用IPTG进行诱导表达目标蛋白。
6.根据权利要求1所述的一种海参组织蛋白酶的原核表达方法，其特征是：所述的融合表达载体选自pET32a载体。
7.根据权利要求5所述的一种海参组织蛋白酶的原核表达方法，其特征是：所述的IPTG诱导表达组织蛋白酶的温度低于30℃，IPTG浓度小于3mM，诱导表达的组织蛋白酶以非包涵体形式表达于大肠杆菌胞内。
8.根据权利要求6所述的一种海参组织蛋白酶的原核表达方法，其特征是：所述的pET32a载体的构建步骤如下：以添加限制性内切酶识别位点序列的引物，克隆制备海参组织蛋白酶成熟肽区域基因序列，使用内切酶，对PCR产物以及空载pET32a载体分别进行双酶切，通过电泳及胶回收纯化酶切产物，混合经过双酶切处理的组织蛋白酶基因片段及载体片段，使用DNA快速连接酶连接构建表达载体。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN110791513A (zh) * | 2019-11-15 | 2020-02-14 | 中国科学院南海海洋研究所 | 一种密码子优化的玉足海参α-淀粉酶基因及其重组表达载体与应用 |
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| CN1373223A (zh) * | 2001-09-30 | 2002-10-09 | 山东大学 | 棉铃虫组织蛋白酶b基因及其克隆、重组表达技术 |
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| CN104845957A (zh) * | 2015-05-11 | 2015-08-19 | 浙江海洋学院 | 一种海参组织蛋白酶的原核表达方法 |
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