CN105079084A

CN105079084A - 从广金钱草中提取总黄酮提取物的方法和测定广金钱草中有效成分含量的方法

Info

Publication number: CN105079084A
Application number: CN201510550890.8A
Authority: CN
Inventors: 王学海; 李莉娥; 许勇; 杨仲文; 黄天赐; 冯芸; 尹海龙; 黄璐; 杨婷; 余通; 杨成兵; 曹儒宾; 谢长
Original assignee: Wuhan Guanggu Humanwell Biological Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Wuhan Guanggu Humanwell Biological Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2015-08-31
Filing date: 2015-08-31
Publication date: 2015-11-25
Anticipated expiration: 2035-08-31
Also published as: CN105079084B

Abstract

本发明提供了一种使用单一对照品夏佛塔苷，同时测定广金钱草药材、广金钱草总黄酮提取物及其制剂中Vicenin-1、Vicenin-3和夏佛塔苷含量的方法，该方法以广金钱草总黄酮提取物或制剂中有效活性成分且含量较高、易得的夏佛塔苷作为内标物，计算夏佛塔苷与Vicenin-1、Vicenin-3的相对校正因子，将其作为常数，可同时测定广金钱草总黄酮提取物或制剂中Vicenin-1、Vicenin-3和夏佛塔苷的含量，实现科学、灵敏、快速地监控工业生产中广金钱草总黄酮提取物或制剂中的质量，同时克服了对照品短缺这一问题。

Description

从广金钱草中提取总黄酮提取物的方法和测定广金钱草中有效成分含量的方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体的，本发明涉及一种从广金钱草中提取总黄酮提取物的方法和一种测定广金钱草中有效成分含量的方法。

背景技术

广金钱草为豆科山蚂蝗属植物Desmodiumstyracifolium(Osbeck)Merr.，其药用部位为干燥地上部分，主要化学成分为黄酮、皂苷、多糖、生物碱等化合物。具有清热除湿，利尿通淋之功效。用于热淋、沙淋、石淋、小便涩痛、水肿尿少、黄疸尿赤、尿路结石。

夏佛塔苷、Vicenin-1和Vicenin-3为广金钱草中的有效成分，均属于黄酮碳苷类化合物，并且这三种成分含量较高。为了控制广金钱草药材、广金钱草总黄酮提取物及其制剂的质量，需要测定这三种成分的含量。

然而，用于检测广金钱草药材、广金钱草总黄酮提取物及其制剂中多种有效成分夏佛塔苷、Vicenin-1和Vicenin-3含量的方法仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中的问题至少之一。

本发明是基于发明人的以下发现而完成的：

现有技术中，采用色谱法测定广金钱草提取物中各组分的含量，往往需要相应的高纯度标准品作对照，由于中药化学对照品分离难度大或单体不稳定难以供应或供应价格高等因素，致使高纯度的标准品不易获得或获得的成本较高，实际生产中难以大规模实施。本发明的发明人通过超高效液相色谱-二极管阵列检测器-质谱联用技术(UPLC-DAD-MS)对广金钱草总黄酮提取物进行色谱分离，并对各化合物进行峰归属及纯度分析，最终选择对夏佛塔苷、Vicenin-1和Vicenin-3三个成分进行含量测定。其中夏佛塔苷对照品可从中检院获取，另外两者为自制获得，且因为夏佛塔苷、Vicenin-1和Vicenin-3为广金钱草中的有效成分，并且这三种成分含量较高、分离度较好，故最终确定以夏佛塔苷对照品为对照，采用“一测多评”(QAMS)法对夏佛塔苷、Vicenin-1和Vicenin-3三个成分进行含量测定。

需要说明的是，高效液相色谱“一测多评”技术，是以夏佛塔苷为内标物，确立其与Vicenin-1和Vicenin-3的相对校正因子、相对保留时间，从而实现用夏佛塔苷一种易得的对照品同时测定广金钱草药材中夏佛塔苷、Vicenin-1和Vicenin-3的含量，从而实现控制广金钱草药材、广金钱草总黄酮提取物及其制剂的药品质量的目的。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种从广金钱草中提取总黄酮提取物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将广金钱草样品与乙醇混合，并通过回流或超声方法进行提取，以便获得总黄酮提取物，其中，所述乙醇的浓度为25～90％，所述广金钱草的重量与所述乙醇的体积比为25mg：25～100ml，优选25mg：50ml。通过上述提取方法，既可以确保完全提取广金钱草中的总黄酮，提取效率高，又可以使得后期液相色谱分析中峰的分离度良好。

根据本发明的实施例，上述从广金钱草中提取总黄酮提取物的方法可以进一步包括下列附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，上述方法采用超声方法进行提取10～40分钟，优选20分钟。通过上述超声提取方法，既节约了提取时间，又确保了完全提取广金钱草中的总黄酮，使得提取效率高，利于黄酮的药用和液相色谱分析。

根据本发明的实施例，上述乙醇的浓度为75％。发明人惊奇的发现，广金钱草样品在75％乙醇里面提取效率最高，且液相色谱分析中峰的分离度良好。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种测定广金钱草中有效成分含量的方法。根据本发明的实施例，方法包括以下步骤：(1)按照前面所述的方法，从广金钱草中提取总黄酮提取物；(2)对所述总黄酮提取物进行高效液相色谱分析，并基于所得到的液相色谱分析结果确定所述广金钱草药材中有效成分的含量。超高效液相色谱(UPLC)的方法，节约了药物分析的时间，而且使得流动相的使用量减少，方法更实用更环保。根据本发明的实施例，上述测定广金钱草中有效成分含量的方法能够实现用夏佛塔苷一种易得的对照品同时测定广金钱草药材中有效成分的含量，从而实现控制广金钱草药材、广金钱草总黄酮提取物及其制剂的药品质量的目的。

根据本发明的实施例，上述测定广金钱草中有效成分含量的方法还可以进一步包括下列附加技术特征之一：

根据本发明的实施例，所述有效成分是夏佛塔苷、Vicenin-1和Vicenin-3，其中，所述Vicenin-1和Vicenin-3的含量是基于所述夏佛塔苷的含量以及预先确定的相对校正因子确定的。发明人通过UPLC-DAD-MS法对广金钱草总黄酮提取物进行色谱分离，并对各化合物进行峰归属及纯度分析发现，夏佛塔苷、Vicenin-1和Vicenin-3三种成分在广金钱草中含量较高、分离度较好。从而通过对夏佛塔苷、Vicenin-1和Vicenin-3三个成分进行含量测定，可实现控制广金钱草药材、广金钱草总黄酮提取物及其制剂的药品质量的目的。

根据本发明的实施例，相对校正因子是通过下列步骤确定的：a、对照品溶液的制备：精密称取一定量的Vicenin-1、夏佛塔苷及Vicenin-3对照品，于同一75％乙醇中超声溶解，配制成含Vicenin-1、夏佛塔苷及Vicenin-3的对照品储备液，再将所述对照品储备液按1→5，2→5，1→10，1→25，1→50的比例进行稀释，得六种不同浓度的对照品溶液，于4℃保存，备用；b、相对校正因子f_si的计算：取步骤(a)所得对照品溶液，进样1微升，用高效液相色谱测定色谱图并进行峰面积积分，选取夏佛塔苷为内标化合物，分别计算夏佛塔苷对Vicenin-1和Vicenin-3的相对校正因子f_si和相对保留时间。根据本发明的实施例，步骤(b)中夏佛塔苷对Vicenin-3、Vicenin-1的相对校正因子为1.1。该数值的确定是发明人在经过多次试验的基础上，根据尽可能少地保留校正因子的有效数字的原则的基础上确定的。根据本发明的实施例，夏佛塔苷与Vicenin-1、Vicenin-3的相对校正因子，可将其作为常数，同时测定广金钱草总黄酮提取物或制剂中Vicenin-1、Vicenin-3和夏佛塔苷的含量，实现科学、灵敏、快速地监控工业生产中广金钱草总黄酮提取物或制剂中的质量，克服了对照品短缺这一问题，同时可计算出其他待测有效成分的含量。

根据本发明的实施例，所述Vicenin-1和Vicenin-3的含量按照下列公式确定的：C_i＝(f_si×A_i×C_S)/A_s，其中，A_s为内标化合物峰面积，C_S为内标化合物质量；A_i为被测组分i的峰面积，C_i为被测组分i的质量，f_si为夏佛塔苷对Vicenin-1和Vicenin-3的相对校正因子；其中，所述Vicenin-1峰和Vicenin-3峰的位置是基于夏佛塔苷峰的位置以及所述夏佛塔苷对Vicenin-1和Vicenin-3的相对保留时间而确定的。根据本发明的实施例，步骤(b)中，Vicenin-1的相对保留时间为0.83，Vicenin-3的相对保留时间为1.39。发明人经过多次试验摸索发现仪器自身状态的变化、室内外的温度变化，对保留时间差的影响较为明显，而相对保留值的波动相对较小，因此采用相对保留时间法进行待测成分色谱峰的定位科学可行。发明人结合上述试验结果，考虑各影响因素，确定Vicenin-1和Vicenin-3的相对保留时间，有利于在“一测多评”检测中准确定位各样品峰位置。根据本发明的实施例，上述测定方法能够实现用夏佛塔苷一种易得的对照品同时测定广金钱草药材中有效成分的含量，从而实现有效控制广金钱草药材、广金钱草总黄酮提取物及其制剂的药品质量的目的。

根据本发明的实施例，所述高效液相色谱分析采用下列条件：采用甲醇-0.1％甲酸体系进行梯度洗脱，色谱柱为WatersACQUITYBEHC₁₈(2.1mm×100mm,1.7微米)，柱温为25摄氏度，流速为0.2ml/min；进样量：1微升，检测波长为330nm，洗脱条件：

时间(min)	0.1％甲酸水溶液	甲醇
			0～28	82→74	18→26
28～40	74	26
			40～41	74→82	26→18
41～50	82	18

在上述色谱条件下，色谱峰可以达到很好的分离效果，从而有效测定广金钱草中有效成分的含量。根据本发明的实施例，上述液相色谱分析条件下的测定广金钱草中有效成分的含量的方法具有高稳定性和准确性的特点。

根据本发明的实施例，所述总黄酮提取物是以样品溶液的形式提供的，所述样品溶液中，所述Vicenin-1在1.220～61.018微克/毫升的范围内，所述夏佛塔苷在4.266～213.305微克/毫升的范围内、所述Vicenin-3在3.371～168.559微克/毫升的范围内，所述有效成分的浓度变化与峰面积呈线性关系。发明人经过多次试验摸索惊奇地发现，在该浓度范围内，夏佛塔苷、Vicenin-1和Vicenin-3浓度的变化与响应信号的线性关系好，测得的含量更接近实际值。

综上，本发明以广金钱草总黄酮提取物或制剂中有效活性成分且含量较高、易得的夏佛塔苷作为内标物，计算夏佛塔苷与Vicenin-1、Vicenin-3的相对校正因子，将其作为常数，同时测定广金钱草总黄酮提取物或制剂中Vicenin-1、Vicenin-3和夏佛塔苷的含量，实现科学、灵敏、快速地监控工业生产中广金钱草总黄酮提取物或制剂中的质量，克服了对照品短缺这一问题，即只测定某个代表性成分(易得、廉价、有效)，同时可计算出其他待测有效成分的含量。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是根据本发明实施例3的对照品紫外扫描图；

图2显示本发明的一个实施例中广金钱草总黄酮提取物的供试品溶液在272nm和330nm处的叠加色谱图；

图3显示根据本发明实施例4的广金钱草总黄酮提取物的样品色谱图；

图4显示根据本发明实施例7的Vicenin-1线性关系图；

图5显示根据本发明实施例7的夏佛塔苷线性关系图；

图6显示根据本发明实施例7的Vicenin-3线性关系图；

图7显示本发明的一个实施例中的广金钱草总黄酮提取物在柱温20℃下的色谱行为；

图8显示本发明的一个实施例中的广金钱草总黄酮提取物在柱温25℃下的色谱行为；

图9显示本发明的一个实施例中的广金钱草总黄酮提取物在柱温30℃下的色谱行为；

图10显示本发明的一个实施例中广金钱草总黄酮提取物在甲醇-0.05％甲酸水溶液的流动相中色谱行为；

图11显示本发明的一个实施例中广金钱草总黄酮提取物在甲醇-0.1％甲酸水溶液的流动相中色谱行为；

图12显示本发明的一个实施例中广金钱草总黄酮提取物在甲醇-0.2％甲酸水溶液的流动相中色谱行为；

图13显示本发明的一个实施例中广金钱草总黄酮提取物在WatersBEHC18(2.1mm×100mm,1.8微米)色谱柱中的色谱行为；

图14显示本发明的一个实施例中广金钱草总黄酮提取物在资生堂CapellcoreC18(2.1mm×100mm,2.7微米)色谱柱中的色谱行为；以及

图15显示本发明的一个实施例中广金钱草总黄酮提取物在岛津Shim-packXR-ODSII(2.0mm×75mm，2.2微米)色谱柱中的色谱行为。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1仪器与试药

WatersUPLCH-class超高效液相色谱仪；WatersACQUITYBEHC₁₈(2.1mm×100mm,1.7微米)；资生堂CapellcoreC₁₈(2.1mm×100mm,2.7微米)；岛津Shim-packXR-ODSII(2.0mm×75mm，2.2微米)，CQ250超声波仪(上海超声波仪器厂)；梅特勒-多伦多XP205型分析天平；梅特勒-多伦多XS204型分析天平；9个对照品如下表1所示。

表1对照品信息

所有自制对照品均为Waters制备液相获得，使用前五氧化二磷减压干燥12h；甲醇为色谱纯，水为Millipore超纯水，其余试剂均为分析纯。

实施例2样品

分别采集十个不同产地的广金钱草药材，制得十个批次的广金钱草总黄酮提取物，信息如下表2。

表2十批次广金钱草总黄酮提取物及其广金钱草原药材产地来源

实施例3色谱条件的考察

3.1检测波长的选择：取广金钱草总黄酮提取物、夏佛塔苷及其余八种自制对照品适量，分别于75％乙醇中超声溶解，在210～400nm进行全波长紫外扫描，在270nm和330nm处有最大吸收，但通过比较这两个波长下的供试品色谱图，发现330nm处杂质干扰较小，故选择330nm作为检测波长。紫外扫描色谱图见图1，供试品溶液在272nm和330nm处的叠加色谱图见图2。

其中在图1中，1为DS-1全波长扫描色谱图，2为DS-3全波长扫描色谱图，3为DS-4全波长扫描色谱图，4为DS-5全波长扫描色谱图，5为DS-8全波长扫描色谱图，6为DS-11全波长扫描色谱图，7为DS-14全波长扫描色谱图，8为DS-15全波长扫描色谱图，9为DS-2全波长扫描色谱图。

3.2洗脱条件：采用WatersACQUITYBEHC₁₈(2.1mm×100mm,1.7微米)色谱柱，通过比较甲醇-0.1％甲酸水溶液、乙腈-0.1％甲酸水溶液、甲醇-乙腈-0.1％甲酸水溶液、甲醇-0.1％磷酸水溶液等体系发现，广金钱草总黄酮提取物在甲醇-0.1％甲酸水溶液的体系中，得到的色谱峰较多，分离度较好，因此选择甲醇-0.1％甲酸水溶液体系进行梯度洗脱，柱温：25℃；流速：0.2ml/min，进样量：1μL，检测波长：330nm；梯度条件见下表3：

表3：广金钱草总黄酮提取物梯度洗脱条件

实施例4“一测多评”指标的确定

通过UPLC-DAD-MS法对广金钱草总黄酮提取物进行色谱分离，并对各化合物进行峰归属及纯度分析，最终选择对夏佛塔苷、Vicenin-1和Vicenin-3三个成分进行含量测定。其中夏佛塔苷对照品可从中检院获取，另外两者为自制获得，且三个成分的含量较高、分离度较好，故最终确定以夏佛塔苷对照品为对照，采用“一测多评”法对夏佛塔苷、Vicenin-1和Vicenin-3三个成分进行含量测定。广金钱草总黄酮提取物(批号140504)的样品色谱图见图3，其中在图3中，1代表Vicenin-1；2代表夏佛塔苷；3代表Vicenin-3。

实施例5提取方法的考察及供试品溶液的制备

精密称取广金钱草药材、广金钱草药材提取物或广金钱草制剂，加入浓度为25％～90％的乙醇水溶液，超声或加热回流提取，过滤，取续滤液过0.45μm滤膜，得样品溶液。

5.1提取方式的考察

样品溶液为广金钱草总黄酮提取物。精密称取25mg的样品，精密加入50％乙醇50ml，称重，分别采用超声及回流两种提取方法进行提取30min，放冷，补重，取滤液注入液相色谱仪，结果表明，两者的提取效率无显著性差异，考虑操作的简便性，选取超声作为提取方法，测定结果见表4。

表4提取方法的比较

提取方法

Vicenin-1

夏佛塔苷

Vicenin-3

	(峰面积/取样量)	(峰面积/取样量)	(峰面积/取样量)
				回流30min	3333.27	11249.80	7207.99
超声30min	3230.36	11097.98	7055.04

5.2提取时间的考察

精密称取25mg样品置50ml量瓶中，加入50％乙醇至近刻度线，分别超声10min、20min、30min、40min，放冷，定容，取续滤液注入液相色谱仪，进行比较，结果发现，提取时间对提取效率无显著性差异，考虑节约时间但又要确保提取完全，选取超声20min，测定结果见表5。

表5提取时间的比较

5.3溶剂用量的考察

精密称取25mg样品，分别加入50％乙醇25ml、50ml、75ml、100ml至近刻度线，超声提取20min，取出放冷，定容，取续滤液注入液相色谱仪，以50ml溶剂提取为基准，分别按体积比进行折算比较，结果发现，溶剂用量对提取效率无显著性差异，考虑节约成本但又要确保提取完全，选取50ml提取即可，测定结果见表6。

表6溶剂用量的比较

5.4提取溶液浓度的考察

精密称取25mg样品置50ml容量中，分别加入25％乙醇、50％乙醇、75％乙醇、95％乙醇至近刻度线，超声提取20min，取出放冷，定容，取续滤液注入液相色谱仪，结果表明，样品在75％乙醇里面提取效率最高，且分离度良好；在95％乙醇里峰形较差，分离度较低，因此选择75％乙醇提取，测定结果见表7。

表7提取溶剂的比较

5.5供试品溶液制备

根据以上考察结果，最终确定广金钱草总黄酮提取物的供试品溶液制备方法为：精密称取25mg的广金钱草总黄酮提取物，置50ml量瓶中，加入75％乙醇至近刻度线，超声20min，放冷，定容即可。

实施例6系统适应性评价

6.1相对校正因子的测定

精密称取一定量的Vicenin-1、夏佛塔苷及Vicenin-3对照品，配制成含Vicenin-161.018微克/ml、夏佛塔苷213.305微克/ml及Vicenin-3168.559微克/ml的对照品储备液。再将对照品溶液(对照品储备液)按1→5，2→5，1→10，1→25，1→50的比例进行稀释，将上述六种混合对照品溶液各进样1微升，测定各成分的峰面积。根据相对校正因子计算公式(s为内参物，i为待测成分)：

f_si＝f_s/f_i＝(A_s/C_s)/(A_i/C_i)

分别计算各待评价成分Vicenin-1、Vicenin-3与内参物夏佛塔苷间的相对校正因子，结果见表8。并分别计算各待评价成分的相对保留时间，结果见表9。

表8相对较正因子计算结果

表9相对保留时间计算结果

6.2相对校正因子的确定

综合上述试验结果，根据尽可能少地保留校正因子的有效数字的原则，各校正因子均为1.1。

6.3待测色谱峰的定位

试验中发现仪器自身状态的变化、室内外的温度变化，对保留时间差的影响较为明显，而相对保留值的波动相对较小，因此采用相对保留时间法进行待测成分色谱峰的定位较为可行。结合上述试验结果，考虑各影响因素，将Vicenin-1和Vicenin-3的相对保留时间定为0.83和1.39。

实施例7方法学验证

7.1线性关系考察

精密称取一定量的Vicenin-1、夏佛塔苷、Vicenin-3对照品，配制成含Vicenin-1为61.018微克/ml、夏佛塔苷213.305微克/ml、Vicenin-3为168.559微克/ml的混标储备液。再将混标储备液按2→5，1→5，1→10，1→25，1→50的比例进行稀释，将上述六种混合对照品溶液各进样1微升，记录色谱图，以测得峰面积A对进样量进行线性回归。结果表明，Vicenin-1在1.220～61.018ng、夏佛塔苷在4.266～213.305ng、Vicenin-3在3.371～168.559ng的范围内线性关系良好，表10-1为Vicenin-1的峰面积A与进样量的线性关系，Vicenin-1线性关系图见图4。表10-2为夏佛塔苷的峰面积A与进样量的线性关系，夏佛塔苷线性关系图见图5。表10-3为Vicenin-3的峰面积A与进样量的线性关系，Vicenin-3线性关系图见图6。

表10-1Vicenin-1的峰面积A与进样量的线性关系

进样量(ng)	1.220	2.441	6.102	12.204	24.407	61.018
							峰面积	12800	26282	66303	133047	264916	662569

回归方程	Y＝10861.144X-79.912
		相关系数	R＝1

表10-2夏佛塔苷的峰面积A与进样量的线性关系

表10-3Vicenin-3的峰面积A与进样量的线性关系

7.2重复性考察

取样品9份，分别按规定取样量的0.5倍、1倍和1.5倍取样，各取3份，测定含量及相对保留时间，结果表明，在取样量的0.5倍、1倍和1.5倍时，供试品含量重复性较好，相对保留时间的重复性良好；外标法与一测多评法(QAMS)相对误差较小，表明该方法的重复性良好，见表11-表14。

表11重复性的测定结果(Vicenin-1的含量)

表12重复性的测定结果(夏佛塔苷的含量)

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	平均含量(％)	RSD(％)
												取样量(g)	12.4	12.6	13.2	24.9	25.6	24.8	37.5	37.6	37.6	/	/
外标法	5.18	5.16	5.11	5.27	5.26	5.27	5.17	5.19	5.18	5.20	1.07

表13重复性的测定结果(Vicenin-3的含量)

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	平均含量(％)	RSD(％)
												取样量(g)	12.4	12.6	13.2	24.9	25.6	24.8	37.5	37.6	37.6	/	/
外标法	3.70	3.66	3.61	3.64	3.62	3.63	3.63	3.64	3.63	3.64	0.73
												QAMS法	3.68	3.77	3.71	3.74	3.73	3.73	3.74	3.75	3.74	3.73	0.68
相对误％	0.27	1.48	1.37	1.36	1.50	1.36	1.49	1.49	1.49	1.25	/

表14重复性试验(相对保留时间)

序号	取样量	r_{Vicenin-1/夏佛塔苷}	r_{夏佛塔苷/夏佛塔苷}	r_{Vicenin-3/夏佛塔苷}
					1	12.4	0.831	1.000	1.385
2	12.6	0.831	1.000	1.384
					3	13.2	0.832	1.000	1.384
4	24.9	0.831	1.000	1.385
					5	25.6	0.832	1.000	1.383
6	24.8	0.832	1.000	1.384
					7	37.5	0.832	1.000	1.384
8	37.6	0.832	1.000	1.385
					9	37.6	0.832	1.000	1.384
平均值	/	0.832	1.000	1.384
					RSD(％)	/	0.06	0.00	0.05

7.3稳定性考察

取广金钱草药材样品，照实施例2制成样品溶液，在不同的时间点进样，进样量均为1微升，记录峰面积，并计算相对保留时间，结果表明，供试品在20h内稳定，能保证含量测定的时间要求；各色谱峰相对保留时间在20h内的稳定性良好，见表15、表16。

表15稳定性试验(峰面积)

时间(h)	A_Vicenin-1	A_夏佛塔苷	A_Vicenin-3
				0	78993	265183	169498
5	80099	270849	169875
				10	80167	268783	174068
15	81458	271374	174782
				20	81404	270603	175901
平均值	80424	269358	172824
				RSD(％)	1.28	0.94	1.70

表16稳定性试验(相对保留时间)

时间(h)	A_Vicenin-1	A_夏佛塔苷	A_Vicenin-3
				0	0.832	1.000	1.385
5	0.832	1.000	1.386
				10	0.832	1.000	1.385
15	0.832	1.000	1.384
				20	0.832	1.000	1.386
平均值	0.832	1.000	1.385
				RSD(％)	0.00	0.00	0.06

7.4准确度试验

取已知含量的样品，称取一半取样量的0.5倍、一半取样量的1倍、一半取样量的1.5倍各三份置50ml容量瓶中，分别加入含Vicenin-1浓度为61.018微克/ml、Vicenin-3浓度为213.305微克/ml、夏佛塔苷浓度为168.559微克/ml的混合对照品溶液1ml、2ml、3ml，再加75％乙醇至近刻度线，超声20min，放冷，定容，取续滤液注入液相色谱仪，计算平均回收率及RSD均良好，外标法与一测多评法(QAMS)相对误差较小，结果表明：本法回收率良好，Vicenin-1、Vicenin-3和夏佛塔苷的准确度试验结果依次见表17-表19。

表17准确度试验结果表(Vicenin-1的含量)

表18准确度试验结果表(夏佛塔苷的含量)

表19准确度试验结果表(Vicenin-3的含量)

7.5耐用性试验

7.5.1柱温

分别考察了20℃、25℃和30℃，这三种不同的柱温对色谱行为的影响，广金钱草黄酮提取物在20℃、25℃和30℃柱温下的色谱行为依次见图7-图9。结果发现，峰5和峰6需要在较低温下20℃，才能获得比较好的分离效果；而峰10和峰11却在较高温度30℃，才能获得比较好的分离效果；在25℃时，峰5和峰6、峰10与峰11均能获得比较满意的分离效果。因此综合分析峰5、峰6、峰9、峰10的分离状况和其对峰4(Vicenin-1)、峰5(夏佛塔苷)、峰6(Vicenin-3)的影响，控制柱温为25℃。

7.5.2流动相甲酸水溶液的浓度

分别配置三种不同甲酸浓度的流动相，0.05％甲酸水溶液-甲醇、0.1％甲酸水溶液-甲醇、0.2％甲酸水溶液-甲醇，结果发现，甲酸水溶液浓度对广金钱草总黄酮提取物的色谱行为影响不大，考虑到低pH对色谱柱的影响，选取0.1％甲酸水溶液-甲醇为流动相进行检测，见图10-图12。

7.5.3色谱柱的考察

分别采用WatersACQUITYBEHC₁₈(2.1mm×100mm,1.7微米)、资生堂CapellcoreC₁₈(2.1mm×100mm,2.7微米)和岛津Shim-packXR-ODSII(2.0mm×75mm，2.2微米)，结果发现，不同品牌规格的色谱柱对样品的色谱行为影响很大，除WatersACQUITYBEHC₁₈(2.1mm×100mm,1.8微米)色谱柱能达到理想的基线分离外，其余色谱柱均不能较好分离，因此，固定色谱柱的品牌与型号为WatersACQUITYBEHC₁₈(2.1mm×100mm,1.8微米)色谱柱，具体色谱图见图13-图15。

实施例8样品测定

首先采用外标法对十批广金钱草总黄酮提取物中的3种成分进行多成分同步含量测定，再用QAMS法(一测多评)对其含量进行计算，将2种方法所得结果进行比较，以验证QAMS法用于广金钱草总黄酮提取物中3种成分多指标质量评价的准确性。以干燥品计的结果见表20，表明两种方法测得的成分含量没有显著性差异，相对偏差﹤2％，提示建立的方法具有较好的可行性。

表20QAMS法与外标法测定结果的比较

实施例9转移率的计算

本法制剂中所用的广金钱草药材，中国药典2010年版一部中规定以干燥品计，含夏佛塔苷不得少于0.13％，本试验采用上述方法对药材的含量进行测定，并根据生产工艺折算其转移率。药材与总黄酮提取物及转移率计算结果如下，见表21-表23。

表21药材中Vicenin-1的转移率

表22药材中夏佛塔苷的转移率

表23药材中Vicenin-3的转移率

按现有工艺生产，经测定上述3种成分的含量可知，广金钱草中这三种成分的转移率在50％～60％之间。

应用本发明所述的测定方法用于检测广金钱草药材中多种有效成分的含量、以及用于检测广金钱草总黄酮制剂中多种有效成分的含量，也起到了相同的技术效果，因此本发明的方法不仅可用于检测广金钱草总黄酮提取物中多种有效成分的含量，也可用于检测广金钱草药材、以及广金钱草总黄酮制剂中多种有效成分的含量。

Claims

1.一种从广金钱草中提取总黄酮提取物的方法，其特征在于，包括：

将广金钱草样品与乙醇混合，并通过回流或超声方法进行提取，以便获得总黄酮提取物，

其中，所述乙醇的浓度为25～90％，所述广金钱草的重量与所述乙醇的体积比为25mg：25～100ml，优选25mg：50ml。

2.根据权利要求1所述的从广金钱草中提取总黄酮提取物的方法，其特征在于，采用超声方法进行提取10～40分钟，优选20分钟。

3.根据权利要求1所述的从广金钱草中提取总黄酮提取物的方法，其特征在于，所述乙醇的浓度为75％。

4.一种测定广金钱草中有效成分含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)按照权利要求1～3任一项所述的方法，从广金钱草中提取总黄酮提取物；

(2)对所述总黄酮提取物进行高效液相色谱分析，并基于所得到的液相色谱分析结果确定所述广金钱草药材中有效成分的含量。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述有效成分是夏佛塔苷、Vicenin-1和Vicenin-3，其中，所述Vicenin-1和Vicenin-3的含量是基于所述夏佛塔苷的含量以及预先确定的相对校正因子确定的。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述相对校正因子是通过下列步骤确定的：

a、对照品溶液的制备

精密称取一定量的Vicenin-1、夏佛塔苷及Vicenin-3对照品，于同一75％乙醇中超声溶解，配制成含Vicenin-1、夏佛塔苷及Vicenin-3的对照品储备液，再将所述对照品储备液按1→5，2→5，1→10，1→25，1→50的比例进行稀释，得六种不同浓度的对照品溶液，于4℃保存，备用；

b、相对校正因子f_si的计算

取步骤(a)所得对照品溶液，进样1微升，用高效液相色谱测定色谱图并进行峰面积积分，选取夏佛塔苷为内标化合物，分别计算夏佛塔苷对Vicenin-1和Vicenin-3的相对校正因子f_si和相对保留时间。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述Vicenin-1和Vicenin-3的含量按照下列公式确定的：

C_i＝(f_si×A_i×C_S)/A_s，

其中，A_s为内标化合物峰面积，C_S为内标化合物质量；A_i为被测组分i的峰面积，C_i为被测组分i的质量，f_si为夏佛塔苷对Vicenin-1和Vicenin-3的相对校正因子，

其中，所述Vicenin-1峰和Vicenin-3峰的位置是基于夏佛塔苷峰的位置以及所述夏佛塔苷对Vicenin-1和Vicenin-3的相对保留时间而确定的。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱分析采用下列条件：

采用甲醇-0.1％甲酸体系进行梯度洗脱，

色谱柱为WatersACQUITYBEHC₁₈(2.1mm×100mm,1.7微米)，

柱温为25摄氏度，

流速为0.2ml/min；

进样量：1微升，

检测波长为330nm，

洗脱条件：

时间(min) 0.1％甲酸水溶液甲醇 0～28 82→74 18→26 28～40 74 26 40～41 74→82 26→18 41～50 82 18

。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述总黄酮提取物是以样品溶液的形式提供的，所述样品溶液中，所述Vicenin-1在1.220～61.018微克/毫升的范围内，所述夏佛塔苷在4.266～213.305微克/毫升的范围内、所述Vicenin-3在3.371～168.559微克/毫升的范围内。