CN105079025B - 氢气饱和生理盐水的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及氢气饱和生理盐水在制备稳定动脉粥样硬化斑块药物中的应用。本发明优点在于：提供了氢气饱和生理盐水的新用途，首次揭示了氢气饱和生理盐水除抑制动脉粥样硬化斑块形成外，还可使其稳定，不易破裂。氢生理盐水制备简单、注射浓度高、使用方便且无爆炸风险，成本很低，且无副作用，从动物实验的结果来看具有良好的治疗优势，大大减少易损斑块患者药物副作用风险，并大大降低医疗成本。

Description

氢气饱和生理盐水的应用

技术领域

本发明涉及氢气饱和生理盐水的新用途，具体地说，是氢气饱和生理盐水在制备稳定动脉粥样硬化斑块药物中的应用。

背景技术

动脉粥样硬化（AS）是一个稳定期与不稳定期交替的非线性过程，这一过程取决于斑块的稳定性和易损性。相较于斑块的早期形成，对斑块稳定性的研究越来越受到人们的重视。AS晚期不稳定斑块（易损斑块）的破裂是引起急性冠脉综合征、急性脑梗死等心脑血管病急症的主要原因。而不稳定斑块的特征是：大的细胞外脂质池、薄的纤维帽、巨噬细胞和T淋巴细胞的浸润等。大量细胞凋亡尤其巨噬细胞凋亡是导致易损斑块形成，影响其稳定性的重要因素。在AS进展过程中，巨噬细胞凋亡不仅直接导致凋亡的平滑肌细胞和巨噬细胞不能被有效吞噬，促进脂质核心的形成及增大，而且富含游离胆固醇的凋亡巨噬细胞通过释放基质降解蛋白酶损伤纤维帽，并产生肿瘤坏死因子-α、白介素-1β，引起继发性炎症反应和坏死，从而促进斑块不稳定。因此目前认为干预巨噬细胞凋亡过程可能对阻止AS进展、阻止已形成的斑块破裂、降低心脑血管病事件发生率具有重要意义。

大部分生物学家一直认为，氢气属于生理性惰性气体。最近的研究发现，氢气不仅不是生理性惰性气体，而是一种良好的选择性抗氧化物质，对许多疾病具有显著治疗作用。2007年7月，I. Ohsawa等在《自然医学》报道，动物吸入2%的氢气，可清除自由基，改善脑缺血再灌注损伤，作用基础是氢气可选择性中和羟自由基和亚硝酸阴离子。该研究迅速引起广泛关注，并引起了研究氢气治疗疾病的热潮。随后，有人又用肝和心肌缺血动物模型，证明呼吸 2 % 的氢气可治疗肝和心肌缺血再灌注损伤。采用饮用饱和氢气水可治疗应激引起的神经损伤、人类2型糖尿病、小鼠基因缺陷慢性氧化应激损伤、化疗药顺铂引起的肾损伤和帕金森病。呼吸2%的氢气可治疗小肠移植引起的炎症损伤，对小肠缺血和心脏移植后损伤同样具有保护作用。上海第二军医大的研究报道呼吸2%的氢气可治疗新生儿脑缺血缺氧损伤。申请人的研究证实，腹腔注射饱和氢气生理盐水能够降低仓鼠血浆低密度脂蛋白胆固醇水平并改善高密度脂蛋白功能。上述研究表明，作为选择性抗氧化物质，氢气对很多疾病具有治疗作用，具有十分广泛的应用前景。申请人发表在”动脉粥样硬化(Atherosclerosis)”杂志上的科学发现和日本学者Ohsawa等的报道均表明：氢分子在载脂蛋白E基因敲除（apoE-/-）鼠模型中具有明确的抗早期AS作用，能抑制AS斑块处的炎症反应和巨噬细胞聚集，但氢气分子是否能影响已形成的晚期动脉粥样硬化斑块的稳定性仍未阐明。鉴于氢气的抗凋亡特性，本申请利用与人脂质谱接近的低密度脂蛋白受体敲除（LDLR^-/-）小鼠，研究了氢气对动脉粥样硬化斑块稳定性及对斑块处巨噬细胞凋亡的影响。

中国专利公开号CN101347451A公开了一种具有治疗缺血再灌注损伤功能的含氢注射液，该发明是一种可用于治疗脑、心、肾等组织器官缺血再灌注损伤的注射液。制备方法为：将医用注射液软包装袋置于低压下脱气处理，抽除气体后进行低温预处理，再注入氢气进行加压助溶，使氢气溶于注射液，在常压4℃左右保存备用，稳定24小时后就可使用。但是关于氢气饱和生理盐水在制备稳定动脉粥样硬化斑块药物中的应用目前还未见报道。

发明内容

本发明针对以上不足之处，提供了一种氢气饱和生理盐水的新用途，氢气饱和生理盐水通过减少斑块内脂质和巨噬细胞含量及炎症反应，增加斑块内胶原含量，从而增加斑块稳定得分，防止其破裂。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种氢气饱和生理盐水的应用，氢气饱和生理盐水在制备稳定动脉粥样硬化斑块药物中的应用。

氢气饱和生理盐水在制备稳定动脉粥样硬化斑块保健品中的应用。

所述氢气饱和生理盐水的制备方法为：生理盐水在0. 5 MPa压力下加压暴露4 h,将纯氢气溶解于无菌生理盐水中达到饱和水平, 4℃贮存于移除气体的密封生理盐水袋中备用。

所述氢气饱和生理盐水维持氢气浓度不低于0.6 mM，一周内配制使用均可达到此浓度。

本发明优点在于：提供了氢气饱和生理盐水的新用途，首次揭示了氢气饱和生理盐水除抑制动脉粥样硬化斑块形成外，还可使其稳定，不易破裂；氢生理盐水制备简单、注射浓度高、使用方便且无爆炸风险，成本很低，且无副作用，从动物实验的结果来看具有良好的治疗优势，大大减少易损斑块患者药物副作用风险，并大大降低医疗成本。

附图说明

图1所示为：主动脉斑块病变分析结果；

图2所示为：斑块稳定得分；

图3所示为：主动脉斑块MMP-9免疫荧光组织化学分析结果；

图4所示为：主动脉斑块CD83和FoxP3免疫荧光组织化学分析结果；

图5所示为：实时荧光定量PCR结果；

图6所示为：TUNEL染色结果；

图7所示为：免疫印迹；

图8所示为：主动脉斑块BIP和CHOP免疫荧光组织化学分析。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

材料和方法

1.1 动物和实验设计

80只8-9周龄雄性 LDLR^-/-小鼠随机分成5组，每组16只。分别为：

阴性对照组（溶媒组，Control）、

饱和氢气生理盐水低剂量组（0.5 ml/kg/d, H₂-L）、

饱和氢气生理盐水高剂量组(5 ml/kg/d, H₂-H)、

阳性对照辛伐他汀组（5 mg/kg/d, Sim (5)）、

联合用药组（低剂量氢气和2.5 mg/kg/d辛伐他汀，H₂-L + Sim (2.5)）。

适应性喂养1周后，给予高脂（15.8%）、高胆固醇（1.25%）饮食，自由饮水。氢气生理盐水腹腔注射给药，辛伐他汀灌胃给药，持续28周。

氢气饱和生理盐水的制备

在0. 5 MPa压力下加压暴露4 h,将纯氢气溶解于正常无菌生理盐水中达到饱和水平, 4℃贮存于移除气体的密封生理盐水袋中。所用氢气饱和生理盐水均为1周内配置，以维持氢气浓度不低于0.6 mM。

病变分析

主动脉根部靠近心底的部位用于连续冰冻切片的制作。冰冻切片的厚度为8μm，切片开始的部位为主动脉根部主动脉瓣开始出现处，每间隔16μm收集一张切片，直至主动脉瓣膜完全消失。分别采用不连续切片的油红O染色和Trichrome 染色 (Sigma, HT15)确定斑块脂质核心和胶原面积；利用抗SMC抗体（Abcam, ab5694）、抗MOMA-2（Serotec,MCA519G）抗体和抗MMP-9抗体（Santa Cruz,sc-6840）进行免疫荧光染色检测斑块处平滑肌细胞、巨噬细胞含量和金属基质蛋白酶-9表达。所有的定量分析数据均使用Image-ProPlus软件并用抗体的阳性面积和斑块面积的百分比显示数据结果。斑块稳定得分计算方法为：（平滑肌细胞面积+胶原面积）/(巨噬细胞面积+脂质面积)。

免疫荧光组织化学分析

主动脉根部的连续冰冻切片分别用特异性抗体 (Bip抗体、CHOP抗体、CD83抗体、MOMA-2抗体和FoxP3抗体来自Abcam）进行染色，荧光二抗孵育后Olympus显微镜采集图片。数据定量分析中使用颜色设定和面积求法。所有的定量分析数据均使用Image-Pro Plus软件并用抗体的阳性面积和斑块总面积的百分比显示数据结果。

染色

动脉粥样硬化斑块处凋亡细胞数目采用TUNEL染色法检测。利用试剂盒（Roche,USA）根据说明书进行操作。

实时荧光定量PCR

TRIZOL法提取全长主动脉RNA后，利用MuLV反转录酶（Applied Biosystems）合成第一链cDNA。采用SYBR-green PCR master mix试剂盒（北京天根）和Rotor-gene Q仪器（德国凯杰）进行实时荧光定量PCR反应。2^-DDCt相对定量法进行数据分析。

免疫印迹

全长主动脉组织蛋白提取后上样SDS-PAGE，采用抗BCL2和抗cleaved caspase-3抗体(Abcam)进行蛋白的免疫印记（western blot）分析。蛋白的观察和量化分析采用化学发光法(Pierce)和Quantity One (Bio-Rad)软件系统。

统计学分析

统计学分析用GraphPad Prism programme ver.4.0进行单因素方差分析检验。结果显示为平均值±标准偏差。P值小于0.05为有显著性差异。

结果

2.1 饱和氢气生理盐水增加动脉粥样硬化斑块稳定性

请参照附图1，组织切片油红O染可见，对照组斑块内有丰富的红染区域（图1），表明高脂喂养后小鼠主动脉斑块内脂质（lipid）含量增多，斑块变得不稳定；抗巨噬细胞（MOMA-2）抗体免疫染色结果显示（图1），对照组阳性染色比例高，表明斑块内含大量巨噬细胞，符合不稳定斑块的特征。而氢气干预后显著减少动脉粥样硬化斑块处脂质（lipid）和巨噬细胞（Mac）聚积，同时增加胶原（Collagen）含量（图1），由此，动脉粥样硬化斑块趋向于稳定，稳定得分增加（图2）。同时，与对照组相比，主要由巨噬细胞分泌且在斑块稳定性中起重要作用的金属基质蛋白酶-9的表达显著减少（图3），进一步验证了氢气可增加斑块稳定性。值得一提的是，低剂量联合用药组可发挥与高剂量氢气或高剂量辛伐他汀相似的保护作用（图1-图3），说明联合应用氢气和辛伐他汀可增强疗效，或许可为减少他汀类药物副作用提供新途径。

饱和氢气生理盐水减少斑块内CD83+树突状细胞并增加FoxP3+调节T细胞含量

已有报道证实动脉粥样硬化斑块稳定性与斑块内调节T细胞（Treg）数目呈正相关且与成熟树突状细胞（DC）数目呈负相关。本研究发现，与对照组相比，氢气干预后斑块内CD83+ DCs显著减少而Foxp3+ Treg显著增加 （图4）。PCR结果显示，氢气组DC成熟标志物mRNA水平下降而Treg相关基因mRNA水平表达增加（图5），同时，氢气干预后，动脉壁上DC分泌的促炎因子mRNA水平下降而Treg分泌的抗炎因子水平升高。以上发现进一步证实氢气可增加动脉粥样硬化斑块稳定性。

氢气饱和生理盐水减少动脉粥样硬化斑块内细胞凋亡和内质网应激反应

巨噬细胞凋亡在动脉斑块稳定中起重要作用，基于此，我们利用TUNEL法检测了斑块处细胞凋亡情况。结果显示，与对照组相比，氢气可显著减少斑块处凋亡细胞的比例 （图6）。免疫印迹结果显示，氢气干预后，动脉壁上凋亡标志蛋白Bcl-2表达上调，cleavedcaspase-3表达下降（图7），进一步证实了氢气的抗凋亡作用。以上数据提示氢气可能通过减少动脉斑块处细胞凋亡而发挥其稳定斑块的作用。

已有报道内质网应激反应在巨噬细胞凋亡过程中起重要作用，基于此，我们检测了斑块处内质网应激相关蛋白的表达。免疫荧光结果显示，与对照组相比，氢气干预后Bip和CHOP表达显著下调（图8）。鉴于内质网应激-CHOP信号途径在细胞凋亡过程中的重要作用，我们的结果提示，氢气干预后斑块处减少的内质网应激反应可能是氢气抑制斑块处细胞凋亡的机制。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种氢气饱和生理盐水的应用，其特征在于：氢气饱和生理盐水在制备稳定动脉粥样硬化斑块药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的氢气饱和生理盐水的应用，其特征在于：所述氢气饱和生理盐水的制备方法为：生理盐水在0. 5 MPa压力下加压暴露4 h,将纯氢气溶解于无菌生理盐水中达到饱和水平, 4℃贮存于移除气体的密封生理盐水袋中备用。

3.根据权利要求1所述的氢气饱和生理盐水的应用，其特征在于：所述氢气饱和生理盐水维持氢气浓度不低于0.6 mM。