CN105078781B

CN105078781B - 龋齿的无创伤治疗用的木瓜蛋白酶牙科用凝胶组合物及其制备方法

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Publication number: CN105078781B
Application number: CN201410734129.5A
Authority: CN
Inventors: 毛利西奥·杜波莱塔
Original assignee: Brix Usa LLC
Current assignee: Brix Usa LLC
Priority date: 2014-05-20
Filing date: 2014-12-04
Publication date: 2020-10-30
Anticipated expiration: 2034-12-04
Also published as: US10137178B2; EP3145484A1; EP3145484A4; BR102015001449A2; BR102015001449B1; US20170100464A1; BR102015001449B8; CN105078781A; MX2015000884A; WO2015179463A1; MX363200B; AR096355A1; EP3145484B1

Abstract

本发明涉及龋齿的无创伤治疗用的木瓜蛋白酶牙科用凝胶组合物及其制备方法。公开了一种龋齿的无创伤治疗用的木瓜蛋白酶牙科用凝胶组合物，其包括最终活性为至少3,000U/mg的木瓜蛋白酶，其中木瓜蛋白酶与药学上可接受的着色剂、防腐剂和溶剂一起生物包封于pH＝7的缓冲液‑C_3‑6多元醇‑果胶‑C_2‑6链烷醇胺‑非离子型乳化剂的混合物中。还公开了所述木瓜蛋白酶组合物的制备方法。

Description

龋齿的无创伤治疗用的木瓜蛋白酶牙科用凝胶组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及特别是使用手工用于牙齿中腐烂的牙本质的软化的化学组合物的龋齿的无创伤治疗。

背景技术

根据世界卫生组织(WHO)，90％的人口患有龋齿并且80％不愿意去牙医诊所，因为他们害怕局部麻醉和由涡轮机(钻孔机)产生的声音，同时将技术描述为消极的并且高度排斥，因为他们认为噪音、振动和压力为全面牙齿修复的障碍。

手工去除龋齿组织的技术看来成了对所有年龄的患者提供更大的安慰的选择。对关于该问题的文献和临床病例进行一些研究后，选择性的手工去除龋齿组织时协同工作的特定酶的作用是惊人的，由此提高技术并且使患者和牙医二者更容易接受。

从70年代开始，几位研究者基于健康的牙齿结构的最大保留原则，提出去除龋齿的不同组成的制剂。

在1975年，Habib等人(Habib C.M.,Kronman J.,Goldman M.,用GK-101(N-氯甘氨酸)的胶原和羟脯氨酸改变治疗的化学评价。Pharmacol.Ther.Dent.,v.2,209-215,1975)开始该方法，其通过使用具有非特异性蛋白水解作用的5％次氯酸钠去除腐烂的牙齿组织。然而，次氯酸钠对于口腔组织是有毒的、刺激的试剂，为此，以解决所述不便为目的，提出了包括将甘氨酸、氯化钠和氢氧化钠添加至5％次氯酸钠中的方案。改进的制剂称为GK-101并且由N-单氯甘氨酸组成(Goldman M.,Kronman J.H.；对去除龋齿的化学机械手段的初步报道。J.Am.Dent.Assoc.1976；93(6):1149-53)。即使这使得该方法比单独的次氯酸盐更有效，但其去除龋齿组织较慢。此外，该方法不包括进行填充的粘接的牙科材料，因此涡轮机的使用对于成形窝洞的形状仍是必需的。

向包含N-单氯甘氨酸的制剂中添加氨基丁酸，由此获得以名称Caridex销售的组合物(Schutzbank S.G.,Galaini J.,Kronman J.H.,Goldman M.,Clarke R.E.A.GK-101和GK 101E在龋齿去除中的效果的体外研究的对比。J.Dent.Res.1978；57:861-864)。即使当Caridex破坏龋齿的牙本质胶原更有效时，Caridex也具有一定的临床限制，其中我们可以提到：其具有较高的成本、其需要具有泵的大容器、其需要大量溶液、其加热期间存在几个问题并且具有短的保质期(Beeley J.A.,Yip H.K.,Stevenson A.G.，化学机械龋齿去除：技术的回顾和最新进展。Br.Dent.J.2000；188:427-430)。

为了使其更有效且更容易处理，该Caridex凝胶发展为Carisolv体系，所述Carisolv体系包括两种试剂：具有三种不同氨基酸：赖氨酸、亮氨酸和谷氨酸的溶液的羧甲基纤维素系凝胶；第二组分为0.5％次氯酸钠溶液。尽管实现了保留健康的牙齿组织并且减少旋转工具的使用的优点(Ericson D.,Zimmerman M.,Raber H.,Gotrik B.,BornsteinR.,Thorell J.；龋齿的化学机械去除的新方法的功效和安全性的临床评价。CariesRes.1999；33:171-177)，但Carisolv的使用不能系统化，因此由于如需要强化训练和专业记录以及需要特定工具(这增加该方案的成本)等使用困难，使得其应用限制在小部分人。

以使用于去除龋齿的该化学机械系统的使用全球化为目的，凝胶类制品在2003年投放市场，该制品的主成分为木瓜蛋白酶，类似于人类胃蛋白酶的从木瓜获得的酶。

该制品由两位研究者，圣保罗大学和大都会桑托斯(Universities of Sao Pauloand Metropolitana de Santos)的儿童牙科教授Sandra Kalil Bussadori博士和来自制药公司Fórmula&

Farmácia的Márcia

Miziara博士在巴西创造，并且给出商品名Papacarie。

Papacarie包括作为活性成分的木瓜蛋白酶、氯胺T、羧甲基纤维素、氯化钠、对羟基苯甲酸甲酯、氢氧化钠、色料和足量的蒸馏水，从而完成制剂(WO2005020946A1)，后来用由木瓜蛋白酶、氯胺T、果胶、聚乙二醇、丙二醇和着色剂组成的凝胶来改进(WO2014016644A1)。

木瓜蛋白酶从生长在如巴西、印度、锡兰、南非和夏威夷等热带国家的绿色成熟木瓜番木瓜的叶子和果实的胶乳中提取。

木瓜蛋白酶为具有杀菌、抑菌和抗炎特性，专门对牙齿坏死组织起作用的蛋白水解酶，这是因为其不包含抑制木瓜蛋白酶的蛋白水解作用的血浆抗蛋白酶α1-抗胰蛋白酶。由于此，坏死组织的软化发生，从而在保留健康组织的同时，清创部分分解的胶原纤维，这是由于其未脱矿并且不具有任何暴露的胶原纤维。

用于Papacarie制剂的另一组分为氯胺。氯胺由具有用于根管冲洗的杀菌和消毒性的氯和铵组成。氯胺为腐烂的牙本质的额外化学软化剂，从而因为氢键被破坏而影响胶原的第二和/或第四结构，这使得腐烂组织的去除更容易。当通过使用扫描电子显微镜和维氏显微硬度检查氯胺的效果时，观察到氯胺的使用导致腐烂的牙本质的外层中的开口牙本质小管。

氯胺为通常危害人体健康的组分。氯胺摄入人体后的几分钟可患有恶心、发绀、循环性虚脱、口吐白沫和呼吸衰竭。在进行透析的患者中水容器中的氯胺导致高铁血红蛋白血症和溶血。当吸入氯胺时，还导致支气管痉挛。

由于Papacarie的各组分，使得Papacarie实现了使龋齿的去除更容易与高抗菌性的协同作用并且不使用特定的牙科工具。

Papacarie的主要优点为需要较少的手工压力、对介入的专业人士引起较少的疲倦和对患者方面引起较少的敏感性。

该凝胶特别推荐用于以下情况：在幼儿、儿童、青少年和/或恐惧症的成年人或者具有特别需求的患者中降低牙髓暴露的风险的无症状的深龋齿损坏；根龋的去除；牙周病治疗时齿根面的化学机械处理，使得牙结石或牙垢的去除和齿根隔离更容易；以及由于其可接受的成本使得用于公共卫生。

没有提到禁忌症。无数研究显示，没有由于凝胶与口腔组织的直接接触引起的刺激。然而，存在不应该施用Papacarie的一定状况：当有与慢性感染过程相一致的症状如瘘、自发性疼痛或叩诊疼痛时，在具有可能改变宿主的免疫反应的系统性疾病如糖尿病、血液恶质病等的患者中。

该制品必须在适当冷却下保存并且为了在室温下施用必须在使用前十五分钟从冰箱中取出。

专利申请AR号P20120101629，公开号为AR085779A1中描述了基于木瓜蛋白酶和果胶的另一凝胶。该文献的权利要求1的目的是去除龋齿组织的化学牙科制剂、用于龋齿或龋齿组织去除的所述化学牙科制剂的制造方法和施用方式；其特征在于包括：2％与6％之间的蛋白水解酶，优选30,000U/mg木瓜蛋白酶；0.2％与1％之间的抗真菌剂，优选氯胺T；0.1％与0.3％之间的抗菌着色剂，优选甲苯胺蓝；所有上述组分由在去离子水中为3％-6％，并且用在去离子水中的稀释的三乙醇胺溶液调节至pH 5/7的稳定剂、优选柑橘果胶来支持。

因此，根据涉及木瓜蛋白酶-果胶体系的现有技术的目前状态，木瓜蛋白酶凝胶的最大获得值在600-1,800U/mg的范围(参见专利申请AR085779A1)并且在木瓜蛋白酶-丙二醇-聚乙二醇体系中，最大获得值为约600U/mg(参见WO2014016644A1)。

因此，当评价所有上述体系的优点与缺点时，结论是，具有通过改进该酶的承载方式重新配制的木瓜蛋白酶系酶凝胶是可取的，其更稳定并且对于急性的和慢性的龋齿二者具有更大的作用能力，其还具有按时间顺序增强的作用，不需要特定工具并且避免潜在的有毒产品的使用。

发明内容

本发明涉及用于手工施用的凝胶牙科化学组合物，其目的是使牙齿(dentalpieces)上龋腐的牙本质软化以随后用工具手工去除，而不求助于用钻孔机的传统方法。

因此，本发明的目的是龋齿的无创伤治疗用凝胶形式的木瓜蛋白酶的牙科用组合物，其包括最终活性为至少3,000U/mg的木瓜蛋白酶，其中木瓜蛋白酶与药学上可接受的着色剂、防腐剂和溶剂一起用pH＝7的缓冲液-C_3-6多元醇-果胶-C_2-6链烷醇胺-非离子型乳化剂混合物生物包封。

优选，pH＝7的缓冲液选自磷酸氢二钠或磷酸氢二钾(Na₂HPO₄,K₂HPO₄)/柠檬酸(C₆H₈O₇)，氯化钠(NaCl)/柠檬酸钠(C₆H₅O₇Na₃·2H₂O)/氢氧化钠(NaOH)，磷酸二氢钠或磷酸二氢钾(NaH₂PO₄,KH₂PO₄)/磷酸氢二钠或磷酸氢二钾(Na₂HPO₄，K₂HPO₄)，三-(羟基甲基)-氨基甲烷(TRIS)/盐酸(HCl)。

更优选，pH＝7的缓冲液为KH₂PO₄/Na₂HPO₄缓冲液。

优选，果胶为苹果渣果胶(核和皮)或柑橘果胶。

更优选，使用的果胶为柑橘果胶。

还优选，C_3-6多元醇选自1,2,3-丙三醇(甘油)、1,2-丙二醇(丙二醇)、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇、1,3-丁烯二醇、2,3-丁烯二醇、2,2-二甲基-1,3-丙二醇(新戊二醇)、赤藓醇、山梨糖醇、甘露醇及其混合物。

更优选，C_3-6多元醇为1,2-丙二醇(丙二醇)。

还优选，C_2-6链烷醇胺可以为单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺及其混合物。

更优选，C_2-6链烷醇胺为三乙醇胺。

优选，非离子型乳化剂选自由以下组成的组：聚氧乙烯硬脂酸酯8(E-430)；聚氧乙烯硬脂酸酯40(E-431)；聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯20(20EO或用20个氧乙烯单元乙氧基化)，也称为聚山梨醇酯20或吐温20(E-432)；聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯20、聚山梨醇酯80或吐温80(E-433)；聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯20、聚山梨醇酯40或吐温40(E-434)；聚氧乙烯山梨糖醇酐单硬脂酸酯20、聚山梨醇酯60或吐温60(E-435)；聚氧乙烯山梨糖醇酐三硬脂酸酯20、聚山梨醇酯65或吐温65(E-436)；及其混合物。

更优选，非离子型乳化剂为聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯20(聚山梨醇酯80或吐温80)。

另外，所述组合物进一步包含选自亚甲基蓝、甲苯胺蓝、甲基绿、亚甲基绿、龙胆紫、孔雀绿、亚甲基黄及其混合物的药学上可接受的着色剂。

优选，药学上可接受的着色剂为甲苯胺蓝。

优选，防腐剂选自对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯及其混合物。

更优选，所述组合物包含木瓜蛋白酶(30,000U/mg)10.00％w/w、柑橘果胶8.00％w/w、丙二醇8.00％w/w、三乙醇胺(99％)0.72％w/w、TW80(聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯20EO)0.50％w/w、KH₂PO₄0.0378％w/w、Na₂HPO₄0.1283％、甲苯胺蓝(1％w/w水溶液)0.09％w/w、对羟基苯甲酸甲酯0.10％w/w、对羟基苯甲酸丙酯0.05％w/w和蒸馏水72.37％w/w。

还提出了上述龋齿的无创伤治疗用木瓜蛋白酶组合物的制备方法，其包括：

a)在大约1,500rpm下搅拌的同时，将pH＝7的缓冲液组分、一种以上的药学上可接受的防腐剂和最后的30,000U/mg木瓜蛋白酶添加至蒸馏水中直到完全分散为中性pH(pH＝7)；

b)在搅拌的同时使果胶在C_3-6多元醇中湿润/润湿，然后添加非离子型乳化剂和最后添加C_2-6链烷醇胺直到中和果胶的酸度，由此形成中性包封乳液(pH＝7)；和

c)在低速搅拌下将来自步骤b)的中性包封乳液添加至步骤a)获得的分散液中，从而获得木瓜蛋白酶分散液的稳定凝胶形式的缓冲包封乳液(BEE)。

优选，所述方法包括：

a)在大约1,500rpm下搅拌的同时，将磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯和最后的30,000U/mg木瓜蛋白酶添加至蒸馏水中直到完全分散为中性pH(pH＝7)，由此获得缓冲分散液；

b)在搅拌的同时使柑橘果胶在丙二醇中湿润，添加山梨糖醇酐单油酸酯和最后的三乙醇胺直到中和柑橘果胶的酸度，由此形成中性包封乳液(pH＝7)；和

优选，该方法包括在搅拌的同时将溶解于药学上可接受的溶剂中的着色剂添加至木瓜蛋白酶分散液的稳定凝胶中的步骤。

优选，着色剂为溶解于蒸馏水的1％w/w甲苯胺蓝。

优选，步骤c)中的搅拌在20rpm与150rpm之间进行。

优选，柑橘果胶/丙二醇/三乙醇胺的浓度比分别在以％w/w表示的4/4/0.36至10/10/0.90的范围内。

最优选，柑橘果胶/丙二醇/三乙醇胺的浓度比为以％w/w表示的8/8/0.72。

另外，所述方法包括将获得的凝胶包封在多剂量注射器中的步骤。

附图说明

图1示出根据实施例2的在不同的柑橘果胶/丙二醇/三乙醇胺的浓度比下在缓冲包封乳液中的固定化木瓜蛋白酶(immobilized papain enzyme)的活性的图表。

图2示出实施例3中凝胶A和B在口腔中作业规定的时间分钟的比较图表。

图3A和3B分别示出根据凝胶A和B的Chipps量表的疼痛程度结果分布的饼图。

图4A和4B分别示出第一次施用凝胶A和B后暴露于龋齿检测器的结果分布的饼图。

图5A和5B分别示出第二次施用凝胶A和B后暴露于龋齿检测器的结果分布的饼图。

图6示出对应于应用例1的一系列照片。

图7示出对应于应用例2的一系列照片。

图8示出对应于应用例3的一系列照片。

图9示出对应于应用例4的一系列照片。

图10示出对应于应用例5的一系列照片。

图11示出对应于应用例6的一系列照片。

图12示出对应于应用例7的一系列照片。

图13示出对应于应用例8的一系列照片。

图14示出对应于应用例9的一系列照片。

图15示出对应于应用例10的一系列照片。

图16示出对应于应用例11的一系列照片。

图17示出对应于应用例12的一系列照片。

图18示出对应于应用例13的一系列照片。

图19示出对应于应用例14的一系列照片。

图20示出对应于应用例15的一系列照片。

具体实施方式

因此，为了解决现有技术问题，提出牙科使用的木瓜蛋白酶局部凝胶组合物，其被推荐用于牙齿中坏死的龋腐牙本质组织的去除。

因此，此处存在的凝胶基于作为不同于已知产品的专有组分的木瓜蛋白酶，因为其有效成分木瓜蛋白酶为具有至少3,000U/mg的活性含量的分散液形式并且吸收在作为包封剂、润湿剂和稳定剂的缓冲包封乳液(BEE)中，这使得固定化并给予稳定性；这成指数地提高最终制品在贮存期间的酶活性。

因此，实现更大的蛋白水解效力，从而去除龋齿组织的胶原纤维；活性成分较少地溶解于口腔液体中，在无需冷藏的情况下即使在不利条件下也实现更大的耐贮存性，并且还能实现在组织水平下更大的抗菌和抗真菌能力与提高的防腐能力。此外，该凝胶在其制剂中不包含氯胺，这增强其毒理学安全性特征。

活性剂为木瓜蛋白酶、植物蛋白酶，其用于在使其稳定的如生物聚合物等一定的包封剂的存在下从皮肤损伤处去除坏死组织。

果胶为多糖、高分子量大分子，其为植物细胞壁的主要组分，负责植物的特征纹理。果胶广泛用于食物、药物和化妆品工业，主要作为增稠剂和稳定剂。

根据本发明，已获得具有至少3,000U/mg的值的组合物，这大大超过了目前现有技术所达到的水平。

为了获得该预料不到的结果，该工作基于通过将木瓜蛋白酶分散于由pH＝7的缓冲液-C_3-6多元醇-果胶-C_2-6链烷醇胺-非离子型乳化剂组成的体系中的生物包封木瓜蛋白酶体系。

本发明的优选实施方案为龋齿的无创伤治疗用凝胶形式的牙科木瓜蛋白酶组合物，其包括最终活性为至少3,000U/mg的木瓜蛋白酶，其中木瓜蛋白酶与药学上可接受的着色剂、防腐剂和溶剂一起生物包封于pH＝7的缓冲液-C_3-6多元醇-果胶-C_2-6链烷醇胺-非离子型乳化剂混合物中。

根据本发明，用于生物包封木瓜蛋白酶的果胶可以为来自苹果渣(核和皮)的果胶或柑橘果胶。更优选，将柑橘果胶用于本发明的凝胶组合物。

优选，pH＝7的缓冲液选自磷酸氢二钠或磷酸氢二钾(Na₂HPO₄，K₂HPO₄)/柠檬酸(C₆H₈O₇)、氯化钠(NaCl)/柠檬酸钠(C₆H₅O₇Na₃·2H₂O)/氢氧化钠(NaOH)、磷酸二氢钠或磷酸二氢钾(NaH₂PO₄，KH₂PO₄)/磷酸氢二钠或磷酸氢二钾(Na₂HPO₄，K₂HPO₄)和三-(羟基甲基)-氨基甲烷(TRIS)/盐酸(HCl)。

用于本发明组合物的pH＝7的缓冲液为磷酸二氢钾(KH₂PO₄)/磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)缓冲液。

此外，还优选，用于本发明牙科用组合物的C_3-6多元醇为1,2,3-丙三醇(甘油)、1,2-丙二醇(丙二醇)、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇、1,3-丁烯二醇、2,3-丁烯二醇、2,2-二甲基-1,3-丙二醇(新戊二醇)、赤藓醇、山梨醇、甘露醇。

更优选，使用的C_3-6多元醇为1,2-丙二醇(丙二醇)。

丙二醇或丙烷-1,2-二醇为有机化合物、醇，或者更具体地为无色、无臭且无味的二醇。其为吸湿的并且与水、丙酮和氯仿混溶的透明粘稠液体。其通过氧化丙烯的水合来获得。

美国食品和药品管理局(FDA)已确定丙二醇对于用于食物、化妆品和药物一般认为是安全的(GRAS)。丙二醇代谢为乳酸，其为在工作的肌肉中自然发生的反应。

通过使用该化合物，即使凝胶的容器打开凝胶也仍然稳定而不变干或不堵塞注射施加器。

另一方面，用于中和酸pH的根据本发明的组合物中的C_2-6链烷醇胺可以为单乙醇胺、二乙醇胺或三乙醇胺。优选，使用的C_2-6链烷醇胺为三乙醇胺。

三乙醇胺为具有一般化学式C₆H₁₅NO₃的主要由叔胺和三个羟基组成的有机化合物。像其它胺类，由于在氮原子上可获得电子对，所以三乙醇胺起到弱化学碱的作用。

依赖于温度，虽然当三乙醇胺不纯时可能为固体，但其看起来为粘性液体；三乙醇胺为透明、浅黄至无色、不大吸湿且挥发、完全溶解于水并且与大部分含氧有机溶剂混溶。三乙醇胺具有轻微的氨气味。

该化学品用于化妆品、卫生清洁制剂的pH调节。这些化妆品和卫生产品中，可以包括润肤液、眼霜、保湿霜、洗发水、剃须泡沫等。

非离子型乳化剂也用于本发明组合物的优选实施方案，其选自由以下组成的组：聚氧乙烯硬脂酸酯8(E-430)；聚氧乙烯硬脂酸酯40(E-431)；聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯20(20EO或用20个氧乙烯基团乙氧基化)(也称为聚山梨醇酯20、吐温20或E-432)；聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯20(聚山梨醇酯80、吐温80或E-433)；聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯20(聚山梨醇酯40、吐温40或E-434)；聚氧乙烯山梨糖醇酐单硬脂酸酯20(聚山梨醇酯60、吐温60或E-435)；聚氧乙烯山梨糖醇酐三硬脂酸酯20(聚山梨醇酯65、吐温65或E-436)；及其混合物。

特别是，根据本发明组合物的优选实施方案，将聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯20(吐温80)用作非离子型乳化剂。

聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯20(吐温80)为用于食品工业的添加剂，其起到使脂肪乳化并溶解的非离子亲脂性洗涤剂的作用。其在食品中的应用已通过欧洲共同体批准并称为乳化剂433(E-433)。

根据本发明的组合物进一步包含药学上可接受的着色剂。

所述的药学上可接受的着色剂选自甲基蓝、甲苯胺蓝、甲基绿、亚甲基绿、龙胆紫、孔雀绿、亚甲基黄及其混合物。

特别是，用于本发明组合物的药学上可接受的着色剂为甲苯胺蓝。

甲苯胺蓝为还通过将其自身固定在细菌壁上起到强大的抗微生物剂作用的着色剂，因为大多数口腔细菌不吸收可见光所以其为无毒的光敏剂。

最后，用于凝胶组合物的防腐剂选自由对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯及其混合物组成的组。优选地，在组合物的优选实施方案中，使用对羟基苯甲酸甲酯与对羟基苯甲酸丙酯的组合。

组合物的优选实施方案包含木瓜蛋白酶(30,000U/mg)10.00％w/w、柑橘果胶8.00％w/w、丙二醇8.00％w/w、三乙醇胺(99％)0.72％w/w、聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯20EO(吐温80)0.50％w/w、KH₂PO₄0.0378％w/w、Na₂HPO₄0.1283％、甲苯胺蓝(1％w/w水溶液)0.09％w/w、对羟基苯甲酸甲酯0.10％w/w、对羟基苯甲酸丙酯0.05％w/w和蒸馏水72.37％w/w。

使用的次要成分也用于食品工业，其给予毒理学安全。

本发明的另一目的是提供如上所述的龋齿的无创伤治疗用木瓜蛋白酶组合物的制备方法，其包括：

a)在大约1,500rpm下搅拌的同时，将pH＝7的缓冲液、一种以上的药学上可接受的防腐剂和最后的30,000U/mg木瓜蛋白酶的组分添加至蒸馏水中直到完全分散为最终中性pH(pH＝7)；

b)在搅拌的同时使果胶在C_3-6多元醇中润湿，然后添加非离子型乳化剂和最后的C_2-6链烷醇胺直到中和果胶的酸度，由此形成中性包封乳液(pH＝7)；和

所述方法优选包括：

a)在大约1,500rpm下搅拌的同时，将磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯和最后的30,000U/mg的木瓜蛋白酶添加至蒸馏水中直到完全分散为最终中性pH(pH＝7)；

b)在搅拌的同时使柑橘果胶在丙二醇中湿润，添加山梨糖醇酐单油酸酯和最后的三乙醇胺直到中和柑橘果胶，由此形成中性包封乳液(pH＝7)；和

该方法进一步包括在搅拌的同时将溶解于药学上可接受的溶剂中的药学上可接受的着色剂添加至木瓜蛋白酶分散液的稳定凝胶中的步骤。

优选地，着色剂为溶解于蒸馏水的1％w/w甲苯胺蓝。

优选地，步骤a)的搅拌在大约1,500rpm下进行，步骤c)的搅拌在大约20rpm与大约150rpm之间进行。

更优选地，所述方法中采用的柑橘果胶:丙二醇:三乙醇胺的浓度比分别在以％w/w表示的4:4:0.36至10:10:0.90的范围内。

还更优选地，柑橘果胶:丙二醇:三乙醇胺的浓度比为以％w/w表示的8:8:0.72。在该体系中，木瓜蛋白酶显示较高的活性。

一旦获得期望的牙科用组合物，分析该组合物以验证其在分级的适当条件下。为了该目的，所述方法包括将获得的凝胶包装入多剂量注射器中的步骤。

以这种方式，将凝胶包装入多剂量注射器，例如1.0ml注射器中。二次包装在各自包含具有其相应的标签和包装说明书的注射器的纸板盒中进行。用密封片封闭这些盒子使得容器适当地密封。

实施例

实施例1：本发明组合物的制造

在316不锈钢反应器中安装有下部分散盘和用于凝胶搅拌的W型叶片，它们通过双轴和发动机独立操作以搅拌该包封体系的制剂。

将总量的蒸馏水添加至具有以1,500rpm旋转的分散体系的反应器中；然后添加磷酸二氢钾和磷酸二氢钠；然后，添加对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯；最后添加30,000U/mg的木瓜蛋白酶直到完全分散。

不像其它组合物，获得pH＝7的缓冲溶液中的木瓜蛋白酶分散液，而不是没有随时间的任何pH控制的蒸馏水中的溶液，这对于酶的稳定性是必要的；也没有获得聚丙二醇中的非水性木瓜蛋白酶溶液，其为将与强氧化剂反应的制品。作为后者的实例，可提到由氯胺T分解产生的产物，因为该化合物作为防腐剂用于一些组合物中，考虑到如果吸入，则可能导致咳嗽、胸痛、鼻子过敏和咽喉痛。其为易燃、危险原料。

如果分散机停止，则大多数酶将沉淀，因此保持搅拌并且添加在独立的316不锈钢容器中制备的下一乳液(在所述乳液中使柑橘果胶在丙二醇中润湿)，添加作为显著改进凝胶在牙齿窝洞中的润湿和渗透能力的优异的润湿表面活性剂的聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯20EO(吐温80)，由此提高最终产物的施用功效。然后添加三乙醇胺以中和柑橘果胶的酸度，由此形成中性乳液(pH＝7)，因此当将其添加至上述木瓜蛋白酶分散液中时pH将不改变。

当将中性包封乳液添加至木瓜蛋白酶分散液中时，以大约150rpm开启W形叶片，由此获得来自木瓜蛋白酶分散液的稳定的凝胶。一旦其为均质的，则准备将凝胶分级。

实施例2：柑橘果胶:丙二醇:三乙醇胺中木瓜蛋白酶浓度的选择。

将1g柑橘果胶润湿并且形成的乳液在蒸馏水中容易溶解。结论是，1g柑橘果胶在1g丙二醇中良好地润湿。然后添加0.09g三乙醇胺以达到pH＝7。因此，柑橘果胶:丙二醇:三乙醇胺的质量比分别以％w/w计为1:1:0.09。使用蒸馏水作为溶剂，通过在保持上述开发比的同时，，改变柑橘果胶:丙二醇:三乙醇胺的浓度，即：以％w/w计分别为4:4:0.36；6:6:0.54；8:8:0.72；10:10:0.90来制备不同的溶液。

最后将10％p/v浓度的木瓜蛋白酶添加至溶液中。为了评估不同浓度的柑橘果胶:丙二醇:三乙醇胺对酶的效果，由木瓜蛋白酶表示的酶活性通过库尼兹(Kunitz)分光光度法(1946)来评估。所述方法采用由2ml 0.1M磷酸盐缓冲液，pH＝6；1mL 1％酪蛋白(基质)和1ml酶提取物试样(柑橘果胶:丙二醇:三乙醇胺中的木瓜蛋白酶)组成的反应混合物；使混合物在37℃下培养30分钟，当该时期结束时，用20％三氯乙酸使反应终止并且使其静置20分钟。为了分离酶水解产物，将混合物在AWEL MF 20Nuaire仪器中在3,500rpm下离心分离30分钟。

最后，分离上清液并且在具有2nm带宽的T60-UV PG仪器UV-VIS分光光度计(190-1100nm)中在280nm处获得相当于每分钟1μg释放的酪氨酸的肽吸光度。使用0.005mlμg^-1cm^-1摩尔消光系数。

所得结果显示在图1中，其中可看出，中性包封乳液中的固定化的木瓜蛋白酶相对于游离酶其活性提高了30％，在不希望束缚于任何理论的情况下，该结果似乎表明支持物以某种方式对酶活性构象起作用。

通过使用用于中性包封乳液的以％w/w表示的浓度比8:8:0.72，与溶液中的酶相比获得大于55％的活性增加(参见图1)；这是观察到的最大值，为此，选择该比例用于根据本发明组合物的制剂，因为其显示最大活性。更高的浓度显示下降的活性，甚至接近游离酶的活性，再一次在不希望束缚于任何理论的情况下，这可能是由于酶活性位点的空间位阻和基质的低扩散速率。

为了提高润湿能力，用三乙醇胺中和前，将0.5％聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯20EO添加至选择的包封乳液中，然后还添加根据实施例1制备的木瓜蛋白酶分散液和着色剂，由此获得根据本发明的凝胶组合物的优选实施方案：

组分	组成
		木瓜蛋白酶(30,000U.I/mg)	10.00g
柑橘果胶	8.00g
		丙二醇	8.00g
99％三乙醇胺	0.723g
		TW80(聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯20EO)	0.50g
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	0.0378g
		Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>	0.1283g
蒸馏水中的1％w/w甲苯胺蓝	0.09g
		对羟基苯甲酸甲酯	0.10g
对羟基苯甲酸丙酯	0.05g
		蒸馏水	72.37g

实施例3：目前发展水平的组合物与本发明组合物之间的效果比较。

进行木瓜蛋白酶凝胶之间，即Papacarie Duo(凝胶A)对实施例2的组合物(凝胶B)的比较研究。

为此，临床疗效通过将Papacarie Duo与根据本发明的组合物比较来评估；评价以下参数：处理时间、疼痛程度(Chipps量表)、龋齿检测器、在不完全隔离的口腔中所需时间、室温干燥和对通用性能中的主观疗效的凝胶A与B的操作者的支持。据统计，证明本发明组合物(凝胶B)的优异的临床疗效超过其现有技术的对应物(凝胶A)。

用随机选择的患者进行本研究。这些为30个6-17岁的患者，外加10个为前者的父母的35-70岁的成人，他们全部存在龋齿，没有牙髓炎或不可逆性损伤。因此，获得总计40个患者试样。

选择的患者的50％经历用Papacarie Duo的化学机械处理，而剩下的群体用本发明的组合物处理，从而评估：龋齿去除的功效、疼痛的迹象、操作时间和用龋齿检测器的行为。

材料和方法描述

采用的方法包括化学去除，接着使用手工工具机械去除，以及随后龋齿检测器的应用以具有损伤状态的明显证据。用玻璃离子粘固剂进行最后的填充。

使用以下组合物：Papacarie Duo(凝胶A)和根据上述实施例2制备的本发明组合物(凝胶B)。

在两者的应用中采用Densell龋齿检测器。

给进行操作的牙医提供有仅标记A和B没有其它识别的两种注射器。

结果以表示以下的表的形式来报告：处理时间(分钟)、疼痛程度(Chipps量表)、龋齿检测器(+,-)、在不完全隔离的口腔中所需时间(分钟)、室温干燥(+,-)和对通用性能的主观疗效的操作者的支持(凝胶A或凝胶B)。

结果分析

确定根据本发明的组合物(凝胶B)在口腔中需要较短的工作时间(参见图2)，平均大约7.5分钟。

关于疼痛程度，二者表现相似没有显示统计上的显著差异，本发明的组合物具有小5％的优势(参见图3A和3B)。

关于暴露于龋齿检测器，本发明组合物在其第一次施用时显示较大的功效(90％阴性)，而Papacarie Duo在其第二次施用时达到相同水平的功效(92％阴性)。参见第一次施用的图4A和4B以及第二次施用的图5A和B。

本发明组合物在不完全隔离的患者的口腔中停留平均超1分钟。两种组合物的干燥反应相似(Papacarie Duo为10，本发明组合物为8)。

通过操作者测量的主观疗效如下：试验时的干预牙医的70％优选本发明组合物作为工作材料而30％优选Papacarie Duo。

用任一产品没有患者在处理面周围的组织中出现炎症反应。

结论

结论是，即使当两种产品实现所述关于去除坏死组织的目的时，可临床上观察到本发明组合物具有超过Papacarie Duo的优点，这直接归因于组分和制备牙科用组合物的方式。

实施例4：检查凝胶牙科用组合物的稳定性和酶活性关于温度的验证。

取出根据本发明中所述的方法制造的组合物试样，目的是在不同温度下分析残余的酶活性：选择室温和更高温度作为在夏天室温下贮存期间可暴露该组合物的最高温度。

性质	试样(25℃)	试样(36℃)
			酶活性(木瓜蛋白酶)	3,350U/mg	3,550U/mg
pH	7.0	7.0
			密度	1.45g/cm<sup>3</sup>	1.45g/cm<sup>3</sup>
粘度	>100,000mPa·s	>100,000mPa·s

在25℃的室温下分析一个试样(25℃)并且在36℃下分析另一试样(36℃)，其均在相应温度下贮存48小时后分析；两个试样的结果显示在上表中。

酶活性完全不降低，反而提高了大约5.6％。因此，结论是，本发明组合物是可接受地稳定的，从而可销售和使用，而不需要保持在冷却条件下。

应用例

本发明应用例通过无创伤的恢复技术来进行；该步骤基于仅使用手工工具从牙齿挖取和去除腐烂，然后用适当的材料将其填充。以下情况已使用根据本发明组合物用所述技术全部处理。显示的结果从不同年龄的患者和具备最低技术培训的牙医获得，以显示本发明组合物的功效。

组合物的各应用包括大约1.5分钟的时间，此期间用棉花卷相对隔离、不使用旋转工具并且不使用局部麻醉的情况下，使凝胶与牙齿接触。

应用例1

七岁的患者。在施用一次组合物的情况下牙齿85的治疗。总工作时间：11分钟。应用龋齿检测器。参见图6从左至右的治疗顺序。

应用例2

七岁的患者。在施用三次组合物的情况下牙齿46的治疗。不使用涡轮机或麻醉。总工作时间：7分钟。参见图7，其中第二张照片(右侧)示出用挖匙去除的蛋白水解产物。

应用例3

四十五岁的患者。在施用两次组合物的情况下牙齿46的治疗。在牙颈部具有龋腐的牙齿，不使用旋转工具或麻醉；使用相对隔离。总工作时间：10分钟。参见图8，其中第二张照片(右侧)示出治疗后软组织的健康状况。

应用例4

七岁的恐惧症患者。在施用两次组合物的情况下牙齿65的治疗。在前庭面具有龋腐的牙齿，填充IV型2。总工作时间：6分钟。参见图9从左至右的治疗顺序。

应用例5

进行他们的第一次牙齿治疗的七岁患者。在施用两次组合物的情况下牙齿65的治疗。用棉花卷隔离。总工作时间：8分钟。参见图10，其中第二张照片示出具有再矿化的可能性的残余影响的牙本质。

应用例6

具有磨牙症和牙颈部龋齿的三十五岁患者。在施用三次组合物的情况下牙齿13的治疗。总工作时间：5分钟。参见图11。

应用例7

八岁的患者。在施用三次组合物的情况下牙齿53的治疗。总工作时间：6分钟。参见图12。

应用例8

极其恐惧的二十八岁患者；第一次进行填充步骤。在施用三次组合物的情况下牙齿36的治疗。不使用旋转工具或麻醉。能保持的窝洞、牙齿组织经济、改进粘合性的治疗后的粗糙表面。总工作时间：11分钟。参见图13。

应用例9

进行他们的第一次牙齿治疗实验的六岁的患者。在施用一次组合物的情况下牙齿64的治疗。总工作时间：5分钟。参见图14。

应用例10

具有快速扩散的龋齿的十四岁青少年患者。在施用两次组合物的情况下牙齿36的治疗。总工作时间：12分钟。参见图15。

应用例11

四十八岁的患者。在施用三次组合物的情况下牙齿11的治疗。颗粒去除。总工作时间：11分钟。参见图16。

应用例12

八十岁的患者。在施用三次组合物的情况下牙齿43的治疗。线去除(threadremoval)。总工作时间：13分钟。参见图17。

应用例13

二十七岁的患者。在施用两次组合物的情况下牙齿23的治疗。总工作时间：10分钟。参见图18。

应用例14

五十六岁的患者。在施用三次组合物的情况下牙齿25的治疗。整体去除。总工作时间：12分钟。参见图19。

应用例15

二十九岁的患者。在施用三次组合物的情况下牙齿47的治疗。用龋坏损伤浸润的汞合金、牙本质的着色区域、龋齿检测器的应用。总工作时间：12分钟。参见图20。

Claims

1.一种龋齿的无创伤治疗用的木瓜蛋白酶牙科用组合物，其为凝胶形式，所述牙科用组合物包括最终活性为至少3,000U/mg的木瓜蛋白酶，其中所述木瓜蛋白酶与药学上可接受的着色剂、防腐剂和溶剂一起生物包封于由pH＝7的缓冲液、C_3-6多元醇、果胶、C_2-6链烷醇胺和非离子型乳化剂形成的混合物中；其中，所述组合物中不包含氯胺。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述pH＝7的缓冲液选自由以下组成的组：磷酸氢二钠或磷酸氢二钾/柠檬酸、氯化钠/柠檬酸钠/氢氧化钠、磷酸二氢钠或磷酸二氢钾/磷酸氢二钠或磷酸氢二钾、三-(羟基甲基)-氨基甲烷/盐酸。

3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述pH＝7的缓冲液为磷酸二氢钾/磷酸氢二钠。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述C_3-6多元醇选自由以下组成的组：1,2,3-丙三醇、1,2-丙二醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇、1,3-丁烯二醇、2,3-丁烯二醇、2,2-二甲基-1,3-丙二醇、赤藓醇、山梨醇、甘露醇及其混合物。

5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述C_3-6多元醇为1,2-丙二醇。

6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述果胶为苹果渣果胶或柑橘果胶。

7.根据权利要求6所述的组合物，其中采用的所述果胶为柑橘果胶。

8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述C_2-6链烷醇胺选自由以下组成的组：单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺及其混合物。

9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述C_2-6链烷醇胺为三乙醇胺。

10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述非离子型乳化剂选自由以下组成的组：聚氧乙烯硬脂酸酯8、聚氧乙烯硬脂酸酯40、聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯20、聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯20、聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯20、聚氧乙烯山梨糖醇酐单硬脂酸酯20、聚氧乙烯山梨糖醇酐三硬脂酸酯20、及其混合物。

11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述非离子型乳化剂为聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯20。

12.根据权利要求1-11任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含选自由以下组成的组的药学上可接受的着色剂：甲基蓝、甲苯胺蓝、甲基绿、亚甲基绿、龙胆紫、孔雀绿、亚甲基黄及其混合物。

13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述药学上可接受的着色剂为甲苯胺蓝。

14.根据权利要求12所述的组合物，其中所述防腐剂选自由以下组成的组：对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯及其混合物。

15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述防腐剂为对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯的混合物。

16.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物包含30,000U/mg木瓜蛋白酶10.00％w/w、柑橘果胶8.00％w/w、丙二醇8.00％w/w、99％的三乙醇胺0.72％w/w、具有20个EO的聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯0.50％w/w、KH₂PO₄ 0.0378％w/w、Na₂HPO₄ 0.1283％、1％w/w甲苯胺蓝水溶液0.09％w/w、对羟基苯甲酸甲酯0.10％w/w、对羟基苯甲酸丙酯0.05％w/w和蒸馏水72.37％w/w。

17.一种权利要求1所述的龋齿的无创伤治疗用的木瓜蛋白酶牙科用组合物的制备方法，所述方法包括：

a)在1,500rpm下搅拌的同时，将pH＝7的缓冲液、一种以上的药学上可接受的防腐剂和最后添加的30,000U/mg木瓜蛋白酶的各组分添加至蒸馏水中直到完全分散为最终pH＝7；

b)在搅拌的同时使果胶在C_3-6多元醇中润湿，然后添加非离子型乳化剂和最后添加的C_2-6链烷醇胺直到中和果胶的酸度，由此形成中性包封乳液；和

c)在低速搅拌下将来自步骤b)的所述中性包封乳液添加至步骤a)获得的分散液中，从而获得木瓜蛋白酶分散液的稳定凝胶形式的缓冲包封乳液；

其中，步骤c)中的所述低速搅拌在20rpm与150rpm之间进行。

18.根据权利要求17所述的龋齿的无创伤治疗用的木瓜蛋白酶牙科用组合物的制备方法，所述方法包括：

a)在1,500rpm下搅拌的同时，将磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯和最后添加的30,000U/mg木瓜蛋白酶添加至蒸馏水中直到完全分散为最终pH＝7；

b)在搅拌的同时使柑橘果胶在丙二醇中湿润，添加聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯20和最后添加的三乙醇胺直到中和柑橘果胶，由此形成中性包封乳液；和

c)在低速搅拌下将来自步骤b)的中性包封乳液添加至步骤a)获得的分散液中，从而获得木瓜蛋白酶分散液的稳定凝胶形式的缓冲包封乳液；

其中，步骤c)中的所述低速搅拌在20rpm与150rpm之间进行。

19.根据权利要求17或18所述的方法，所述方法包括在搅拌下将溶解于药学上可接受的溶剂中的着色剂添加至所述木瓜蛋白酶分散液的稳定凝胶中的步骤。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述着色剂为溶解于蒸馏水中的1％w/w甲苯胺蓝。

21.根据权利要求18或20所述的方法，其中以质量百分比计，采用的柑橘果胶:丙二醇:三乙醇胺的浓度比在4:4:0.36至10:10:0.90的范围内。

22.根据权利要求21所述的方法，其中以质量百分比计，柑橘果胶:丙二醇:三乙醇胺的浓度比为8:8:0.72。

23.根据权利要求17-18、20、22任一项所述的方法，所述方法包括将获得的凝胶包装入多剂量注射器中的步骤。