CN105077510B - 一种松木层孔菌超临界萃取物作为抑菌剂的应用 - Google Patents
一种松木层孔菌超临界萃取物作为抑菌剂的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种松木层孔菌超临界萃取物作为抑菌剂的应用，所述超临界萃取物是将松木层孔菌子实体进行超临界CO2萃取获得的萃取物，所述超临界萃取条件为：以CO2为超临流体，萃取压力为20～40MPa，时间1～3h，温度30℃‑50℃，CO2流速为10～20g/min；本发明松木层孔菌提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌等几种食品常见细菌均有较好的抑制效果，对大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为2.5mg/mL，对枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度均为5.0mg/mL；由于超临界萃取物是非极性，可用于油脂类的抑菌剂，以期应用于食品的防腐和贮藏保鲜。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种松木层孔菌提取物的应用，特别涉及一种松木层孔菌超临界萃取物作为抑菌剂的应用。
(二)背景技术
每年世界上食品因微生物腐败造成的损失不计其数，食品腐败变质不仅会使食品丧失营养价值，还会造成食物中毒。为了延长食品贮运和保藏期限，在食品加工过程中除杀(灭)菌外，还普遍采用通过添加防腐剂的手段，使微生物丧失活性、延缓或阻止其生长。食品防腐剂按来源通常分为合成防腐剂与天然防腐剂两大类。目前国内外大量使用的食品防腐剂仍以化学合成为主，如对羟基苯甲酸酯、苯甲酸、山梨酸及其盐类等化学合成防腐剂。但是，经过长期的应用和研究发现，这些化学防腐剂对人体都会有或多或少的毒害作用，尤其在长期使用或过量使用时，一些合成防腐剂还存在诱癌性、致畸性和易引起食物中毒等问题。
相比上述的化学合成防腐剂，天然防腐剂，尤其是食品来源，或经长期使用的药用植物或真菌来源，不仅具有安全无毒的优点，而且通常还具有一定的营养和保健功效。随着社会和经济发展，消费者健康意识的增强，天然防腐剂已成为研究和开发的趋势。
食药真菌是一类具有较高营养或药用价值的高等真菌，普遍具有抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗病毒和增强免疫力等诸多功效。另外一些食药真菌的子实体或菌丝体的提取物也显示了一定的防腐抑菌作用，如桦褐孔菌、红菇、松乳菇、杨树菇、木蹄层孔菌、蒙古口蘑、巨大口蘑、棘托竹荪、虎奶菇、大秃马勃、大球盖菇、鲍鱼菇、巴西蘑菇等。但有些采用了有毒有害的有机溶剂萃取，从安全性考虑，不可避免对食品应用有少许残留，因此无实际食品的防腐应用价值，另外有机溶剂易燃易爆，生产安全性也较差。如2009年，刘迎秋等人采用纸片法研究了桦褐孔菌的水、甲醇、丙酮、氯仿、石油醚提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用，发现桦褐孔菌各提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有不同程度的抑制作用。2009年，方熹君等人研究表明，在10～40mg/mL的浓度范围内，虎奶菇发酵液不同组分的抑菌作用大小依次为正丁醇萃取物＞乙酸乙酯萃取物＞萃余发酵液，正己烷萃取物无活性。2010年，陈敬华等人申请的“具有抑菌活性的竹荪子实体提取物及其应用”(申请号201010578196.4)，长裙竹荪子实体经过粉粹，过筛，分别依次用石油醚、乙醚、乙酸乙酯、无水乙醇、甲醇经索氏提取器提取，提取液分别减压浓缩至干，得到各溶剂提取物，各提取液对常见致病、致腐微生物有较好的抑制作用。
本发明涉及的松木层孔菌(Phellinus pini)，又名松针层孔菌、松白腐菌、黄芝、松黄灵、红缘树舌、松生层孔、红缘层孔菌，隶属于担子菌门、伞菌纲，锈革孔菌目(Hymenochaetales)，锈革孔菌科(Hymenochaetaceae)，木层孔菌属(Phellinus)，是一种能引起树材腐朽的白腐真菌，主要寄生于云杉、落叶松等针叶树活立木上，集中产地在东北、华北、西北、西南等原始森林地区。已有研究表明松木层孔菌在抑制肿瘤、治疗肝炎、提高免疫力、降血糖、抗氧化等方面显示了较强的功效。但尚未发现松木层孔菌及其提取物在防腐抑菌方面的报道。
超临界流体萃取(supercritical fluid extraction，简称SFE),是近几十年发展起来的一种新兴分离技术，与传统的化学溶剂萃取法相比，具有无化学溶剂消耗和残留、无污染、利于热敏物质萃取和产物的生物活性保留高等特点。
本发明通过超临界萃取，得到的松木层孔菌提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均显示了较好的抑菌效果，工艺和制备过程安全，不涉及有毒有害溶剂，是一种良好的天然抑菌剂，同时可能还兼有松木层孔菌原有的增强免疫和抗癌等功效。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种从松木层孔菌中超临界萃取得到的天然抑菌剂，具有使用安全性高的特点，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌具有抑菌性，且超临界萃取是非极性，可用于油脂类的抑菌剂，以期应用于食品的防腐和贮藏保鲜。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种松木层孔菌超临界萃取物作为抑菌剂的应用，所述超临界萃取物是将松木层孔菌子实体进行超临界CO2萃取获得的萃取物，所述超临界萃取条件为：以CO2为超临流体，萃取压力为20～40MPa，时间1～3h，温度30℃-50℃，CO2流速为10～20g/min。通常得到的萃取物呈浸膏状。
进一步，所述松木层孔菌子实体在萃取前先粉碎，过20～40目筛，40～60℃干燥，获得松木层孔菌子实体粉末；然后将粉末加入CO2超临界萃取仪的萃取釜进行CO2超临界萃取。
进一步，优选所述萃取压力为30～40MPa，时间2～3h，温度30℃-50℃，CO2流速为15～20g/min。
本发明所述抑菌剂为大肠杆菌抑菌剂、金黄色葡萄球菌抑菌剂或枯草芽孢杆菌抑菌剂。
本发明所述超临界萃取物对大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为2.5mg/mL，对枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度均为5.0mg/mL。
本发明所述松木层孔菌(Phellinus pini)子实体，又名松针层孔菌、松白腐菌、黄芝、松黄灵、红缘树舌、松生层孔、红缘层孔菌，隶属于担子菌门、伞菌纲，锈革孔菌目(Hymenochaetales)，锈革孔菌科(Hymenochaetaceae)，木层孔菌属(Phellinus)，是一种能引起树材腐朽的白腐真菌，主要寄生于云杉、落叶松等针叶树活立木上，集中产地在东北、华北、西北、西南等原始森林地区。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明对松木层孔菌进行安全性高的超临界CO2萃取，测定发现该提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌等几种食品常见细菌均有较好的抑制效果；本发明所述超临界萃取物对大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为2.5mg/mL，对枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度均为5.0mg/mL；由于超临界萃取物是非极性，可用于油脂类的抑菌剂，以期应用于食品的防腐和贮藏保鲜。
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
(1)松木层孔菌萃取物
松木层孔菌子实体→剪碎至0.3-0.6cm3的小块→机械粉碎过30目筛→50℃干燥→称取180g→CO2超临界萃取(超临界萃取仪：美国Thar超临界流体超细微造粒系统SFP，美国Thar科技公司有限公司)，萃取压力为30MPa，时间2h，温度40℃，CO2流速为15g/min→收集分离釜中棕色油状萃取物→称重为1.56g，得率0.87％→抑菌测定→松木层孔菌抑制剂。
(2)松木层孔菌萃取物性能
1.供试菌株：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌菌株，由浙江工业大学生物与环境工程学院微生物实验室提供，样本在该实验室贮藏。
2.实验方法
2.1供试菌株的制备：
将所有供试菌种移接入营养琼脂试管斜面培养基上，每种菌种接多支重复。并将接种有大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的斜面培养基置于37℃生化培养箱培养24h。每种菌种取2支供试验用，其余冷藏备用。
2.2菌悬液的制备
挑取各菌落接种营养琼脂培养基平皿，三种供试菌均培养24h，用无菌生理盐水洗脱，分别制成含菌约107CFU/mL的菌悬液。
具体制备方法：分别挑取少量细菌孢子至无菌生理盐水中洗出→玻璃珠打散→制成菌悬液→调菌悬液浓度为107CFU/mL，备用。
2.3营养琼脂培养基平板制备：营养琼脂培养基3.2g，加水100ml，pH自然。
营养琼脂培养基主要成分(g/L)：蛋白胨10.0；牛肉浸出粉5.0；氯化钠5.0；琼脂12.0，pH7.3±0.1(25℃)。
配制好的培养基，121℃湿热灭菌30min后，冷却至50-60℃，无菌操作倾注于干热灭菌的培养皿内，每皿15-20mL。
2.4最低抑菌浓度(MIC)测定
①分别取步骤(1)制备的松木层孔菌超临界萃取物，加已灭菌的二甲基亚砜(DMSO)配制成一定梯度的稀释液(稀释浓度分别为10mg/mL，5mg/mL，2.5mg/mL，1.25/mL)作为抑菌原液；并另取一支不加药品(即松木层孔菌超临界萃取物)的空白液体培养基作为对照样品(用等量二甲基亚砜代替松木层孔菌超临界萃取物)。
②用移液枪移取10μL的菌悬液(107CFU/mL)至营养琼脂培养基平板表面，用三角涂布棒将其涂布均匀；
③用移液枪分别移取不同浓度的抑菌原液6μL至各个营养琼脂培养基平板表面，在37℃下培养24h，之后观察各浓度平板的抑菌情况，其中未长菌落平板的最低浓度即为最低抑菌浓度(MIC)，结果见表1所示。
表1松木层孔菌超临界萃取物最低抑菌浓度
注：“+”表示有菌落，“-”表示未见菌落。
2.5抑菌圈法测定抑菌活性
①称取步骤(1)松木层孔菌超临界萃取物样品100mg，用二甲基亚砜(DMSO)溶解，配制成10.0mg/mL的样品溶液；
②取干净的小试管，编号，将样品溶液置于其中；
③将高压灭菌后的培养基，培养皿，滤纸片等实验所需物品，放进超净工作台，打开紫外灭菌30min；
④倒营养琼脂培养基平板，移液枪分别移取三种供试菌菌悬液(107CFU/mL)20μL，打入营养琼脂培养基平板内，无菌条件下用三角涂布棒将菌液涂布均匀；以2.0mg/mL的链霉素DMSO溶液为阳性对照。
⑤取灭菌后的两片滤纸片，置于培养基表面，分别用移液枪移取6μL样品溶液于其中一片滤纸片上，移取相同剂量二甲基亚砜于第二片滤纸片上做阴性对照；
⑥在37℃恒温培养箱放置24h左右，用数显游标卡尺测量抑菌圈的直径，每组实验重复3次，结果见表2。
表2松木层孔菌超临界萃取物抑菌圈直径
2.6松木层孔菌超临界萃取物抑菌率的测定
称取步骤(1)的松木层孔菌超临界萃取物样品100mg，用二甲基亚砜(DMSO)溶解，配制成5mg/mL的样品溶液；
采用三点接种法，在涂布有三种供试菌菌悬液的营养琼脂培养基平板上放置3片灭菌后的滤纸片，用移液枪分别移取5.0mg/mL的样品溶液6μL，2mg/mL氨苄青霉素钠水溶液6μL和2mg/mL二甲基亚矾水溶液6μL，分别滴加在三片滤纸片上，每个实验设置3次重复，阳性对照为：2mg/mL氨苄青霉素钠水溶液；阴性对照：2mg/mL二甲基亚砜水溶液。将以上平板均倒置于37℃恒温培养箱中培养24h后，测量三个抑菌圈的直径，并求平均值作为抑菌实验的结果。同样条件下，测试10.0mg/mL样品溶液在涂布三种供试菌菌悬液的平板上的抑菌率，具体抑菌率结果见表3。
以上细菌培养和抑菌操作时的加样和加料操作均在在超净工作台中进行。
抑制率＝(供试品抑菌圈直径-阴性对照抑菌圈直径)/阳性对照抑菌圈直径×100％
表3松木层孔菌超临界萃取物抑菌率
实施例2：
松木层孔菌子实体→剪碎至0.3-0.6cm3的小块→机械粉碎过40目筛→60℃干燥→称取190g→CO2超临界萃取(超临界萃取仪：美国Thar超临界流体超细微造粒系统SFP，美国Thar科技公司有限公司)，萃取压力为40MPa，时间3h，温度50℃，CO2流速为20g/min→收集分离釜中棕色油状萃取物→称重为1.85g，得率0.97％→抑菌测定→松木层孔菌抑制剂，抑菌效果如表4和表5。
表4松木层孔菌超临界萃取物最低抑菌浓度
注：“+”表示有菌落，“-”表示未见菌落。
由表4可见，松木层孔菌的超临界提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为2.5mg/mL，对枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度均为5.0mg/mL。
表5松木层孔菌超临界萃取物抑菌率
从表5可以看出，松木层孔菌超临界萃取物对3种实验细菌均有较好的抑制效果，其中对大肠杆菌的抑菌效果最好，10.0mg/mL时的抑菌率达86.6％。
上述实验结果表明，松木层孔菌超临界萃取物对常见的3种食品腐败菌均有一定的抑制作用，可将本发明成果应用于食品防腐保鲜等领域。
对比实施例1松木层孔菌水提取
松木层孔菌子实体→剪碎至0.3-0.6cm3的小块→机械粉碎过30目筛→50℃干燥→称取50g→加入20倍重量的水，加热沸腾提取→索氏抽滤得过滤液→55℃旋转蒸发浓缩→冷冻干燥→松木层孔菌水提物，称重为2.05g，得率4.1％→抑菌测定。
表6松木层孔菌水提物最低抑菌浓度
注：“+”表示有菌落，“-”表示未见菌落。
由表6可见，在实验浓度范围内，松木层孔菌水提物对枯草芽孢杆菌没有抑制效果，对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为10mg/mL，对大肠杆菌的最低抑菌浓度为20mg/mL，相比表1的超临界萃取物抑菌效果要差很多。
对比例2桑黄(鲍氏针层孔菌)超临界萃取物
桑黄子实体→剪碎至0.3-0.6cm3的小块→机械粉碎过30目筛→50℃干燥→称取180g→CO2超临界萃取(超临界萃取仪：美国Thar超临界流体超细微造粒系统SFP，美国Thar科技公司有限公司)，萃取压力为30MPa，时间2h，温度40℃，CO2流速为15g/min→收集分离釜中黄色油状萃取物→称重为1.88g，得率1.04％→抑菌测定。
表7桑黄超临界萃取物最低抑菌浓度
注：“+”表示有菌落，“-”表示未见菌落。
由表7可见，因萃取物浓度在20mg/mL已达最大溶解浓度左右，在实验浓度范围内，桑黄超临界萃取物对三种菌都没有抑制效果。
对比例3桦褐孔菌超临界萃取物
桦褐孔菌子实体→剪碎至0.3-0.6cm3的小块→机械粉碎过30目筛→50℃干燥→称取180g→CO2超临界萃取(超临界萃取仪：美国Thar超临界流体超细微造粒系统SFP，美国Thar科技公司有限公司)，萃取压力为30MPa，时间2h，温度40℃，CO2流速为15g/min→收集分离釜中黄色油状萃取物→称重为1.12g，得率0.62％→抑菌测定。
表7桦褐孔菌超临界萃取物最低抑菌浓度
注：“+”表示有菌落，“-”表示未见菌落。
由表7可见，在实验浓度范围内，桦褐孔菌超临界萃取物对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌均没有抑制效果，而对大肠杆菌的最低抑菌浓度为20mg/mL，相比表1的松木层孔菌超临界萃取物抑菌效果要差很多。
Claims (5)
1.一种松木层孔菌(Phellinus pini)超临界萃取物作为抑菌剂的应用，其特征在于所述超临界萃取物是将松木层孔菌子实体进行超临界CO2萃取获得的萃取物，所述超临界萃取条件为：以CO2为超临流体，萃取压力为20～40MPa，时间1～3h，温度30℃-50℃，CO2流速为10～20g/min。
2.如权利要求1所述松木层孔菌超临界萃取物作为抑菌剂的应用，其特征在于所述松木层孔菌子实体在萃取前先粉碎，过20～40目筛，40～60℃干燥，获得松木层孔菌子实体粉末；然后将粉末加入CO2超临界萃取仪的萃取釜进行CO2超临界萃取。
3.如权利要求2所述松木层孔菌超临界萃取物作为抑菌剂的应用，其特征在于所述萃取压力为30～40MPa，时间2～3h，温度30℃-50℃，CO2流速为15～20g/min。
4.如权利要求1所述松木层孔菌超临界萃取物作为抑菌剂的应用，其特征在于抑菌剂为大肠杆菌抑菌剂、金黄色葡萄球菌抑菌剂或枯草芽孢杆菌抑菌剂。
5.如权利要求4所述松木层孔菌超临界萃取物作为抑菌剂的应用，其特征在于超临界萃取物对大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为2.5mg/mL，对枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度均为5.0mg/mL。
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