CN105063211A - 一种快速评价乳酸菌缓解细胞氧化损伤能力的方法及应用 - Google Patents

一种快速评价乳酸菌缓解细胞氧化损伤能力的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种快速评价乳酸菌缓解细胞氧化损伤能力的方法及应用，属于生物技术领域。本发明所提供的方法为将乳酸菌和氧化损伤的细胞共培养，提取细胞RNA，检测与氧化应激相关的基因的表达情况。本发明方法简单快速，为快速筛选和评价乳酸菌新资源提供了理论基础，也为乳酸菌抗氧化作用的机制探究提供了新方法，增强了我国新型功能性乳酸菌食品的开发基础。

Description

一种快速评价乳酸菌缓解细胞氧化损伤能力的方法及应用
技术领域
本发明涉及一种快速评价乳酸菌缓解细胞氧化损伤能力的方法及应用，属于生物技术领域。
背景技术
尽管人们可以从膳食中补充抗氧化物质来缓解氧化应激给机体带来的损伤，但膳食补充的抗氧化剂，一方面有不易被机体吸收的可能，另一方面也涉及到安全问题，因此，这类抗氧化剂的使用都受到了一定程度的限制。近年来，大量研究表明，乳酸菌具有多种益生功能，不仅能够调节机体的免疫系统，维持肠道菌群平衡，还具有一定的抗氧化能力，能够清除肠道内的活性氧分子，使机体内活性氧分子保持在相对稳定的状态[27,28]，因此乳酸菌的抗氧化作用与传统抗氧化剂相比具有多种优势，可以作为一种天然的抗氧化剂应用到食品药品加工领域中，逐渐成为近年来的研究热点。
乳酸菌(Lacticacidbacteria，LAB)是一种以乳酸为主要发酵产物的革兰氏阳性菌的统称，主要包括乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)和明串珠菌属(Leuconostoc)。它们通常都是兼性厌氧生物，并且具有有限的生物合成能力，通过发酵糖类来获取能量，因此需要持续不断的补充嘌呤、嘧啶、维生素和氨基酸等物质以维持生命活力。乳酸菌广泛分布于各种动物的肠道中，其中数量最多的为乳杆菌属，它包含大约80多个种，并广泛应用于各种产品中，例如酸菜、泡菜、果汁、啤酒、酸奶、奶酪和香肠等。1857年被誉为微生物学之父的巴斯德利用显微镜首次发现了乳酸菌，1908年来自俄国的诺贝尔生理学医学奖获得者梅契尼科夫揭示了乳酸菌所发酵的酸奶具有长寿的作用，1935年首款乳酸菌发酵饮料Yakult问世于日本，各国学者对乳酸菌的研究已有100多年的历史。
大量研究表明，乳酸菌具有多种益生功能，主要体现在以下几方面：
(1)维持肠道菌群平衡。在人体肠道中共存着数量庞大的细菌，因此肠道微生物的平衡是维持肠道稳定非常重要的因素。(2)缓解乳糖不耐症及乳糖吸收不良。(3)预防和治疗腹泻。(4)调节机体免疫系统。(5)降低胆固醇水平和血脂浓度。(6)抗高血压作用。(7)抗氧化作用。氧化应激能够引起多种疾病，成为近年来的研究热点。大量研究显示乳酸菌具有缓解氧化应激的作用，因此对多种疾病从根本上起到了预防的作用。
生物体的抗氧化防御系统可以保护机体免受低浓度ROS的损伤，但当ROS浓度过高时抗氧化防御系统便可能会受到损伤，大量体内体外实验均证明，乳酸菌具有缓解机体氧化损伤的功能。现有技术中没有一种可以快速评价乳酸菌缓解机体氧化损伤能力的方法。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提供了一种快速评价乳酸菌缓解细胞氧化损伤能力的方法，采用的技术方案如下：
本发明的目的在于提供一种快速评价乳酸菌缓解细胞氧化损伤能力的方法，该方法是将乳酸菌和氧化损伤的细胞共培养，提取共培养前后细胞的RNA，检测共培养前后细胞中EGR2、NUAK2和FBN2的基因表达水平，通过基因表达水平的变化来判断乳酸菌缓解细胞氧化损伤的能力。
所述方法步骤如下：
1)构建细胞氧化损伤模型，获得受到氧化损伤的细胞；
2)将乳酸菌和步骤2)所得受到氧化损伤的细胞进行共培养；
3)提取共培养前后细胞的RNA；
4)检测共培养前后细胞中TNF、EGR2、NUAK2、FBN2、TNFAIP3、ATF3、FOSB和PPP1R15A的基因表达水平，通过基因表达水平的变化来判断乳酸菌缓解细胞氧化损伤的能力。
优选地，所述的方法步骤如下：
1)构建过氧化氢氧化损伤Caco-2细胞模型，获得受到氧化损伤的Caco-2细胞；
2)将乳酸菌和步骤2)所得受到氧化损伤的Caco-2细胞共培养；
3)提取共培养前后的细胞RNA；
4)将步骤3)提取的RNA反转录为cDNA；
5)利用步骤4)所获得的cDNA进行Real-timePCR，检测共培养前后细胞中TNF、EGR2、NUAK2、FBN2、TNFAIP3、ATF3、FOSB、PPP1R15A和内参基因的表达水平，通过基因表达水平的变化来判断乳酸菌缓解细胞氧化损伤的能力。
优选地，步骤1)所述过氧化氢，浓度为250μM～500μM，处理时间为30min-60min。
优选地，步骤2)所述共培养，时间为4h。
优选地，步骤4)所述反转录，过程为37℃15min，85℃5s。
优选地，步骤5)所述内参基因，为GAPDH；所述GAPDH的引物对如SEQIDNO17-18所示；步骤5)所述TNF的引物对如SEQIDNO1-2所示；EGR2的引物对如SEQIDNO3-4所示；NUAK2的引物对如SEQIDNO5-6所示；FBN2的引物对如SEQIDNO7-8所示；TNFAIP3的引物对如SEQIDNO9-10所示；ATF3的引物对如SEQIDNO11-12所示；FOSB的引物对如SEQIDNO13-14所示；PPP1R15A的引物对如SEQIDNO15-16所示。
优选地，步骤5)所述Real-timePCR，反应程序为：95℃，30s预变性；95℃，5s；60℃，34s，40个循环。
更优选地，所述方法具体步骤为：
1)将达到极化状态的Caco-2细胞暴露于500μMH2O2处理30min，构建过氧化氢氧化损伤Caco-2细胞模型，获得受到氧化损伤的Caco-2细胞；
2)将乳酸菌和步骤2)所得受到氧化损伤的Caco-2细胞共培养；
3)提取共培养前后的细胞RNA；
4)将步骤3)提取的RNA反转录为cDNA；所述反转录过程为37℃15min，85℃5s；
5)利用步骤4)所获得的cDNA进行Real-timePCR，检测共培养前后细胞中TNF、EGR2、NUAK2、FBN2、TNFAIP3、ATF3、FOSB、PPP1R15A和内参基因的表达水平，通过基因表达水平的变化来判断乳酸菌缓解细胞氧化损伤的能力；所述内参基因为GAPDH，GAPDH的引物对如SEQIDNO17-18所示；所述TNF的引物对如SEQIDNO1-2所示，EGR2的引物对如SEQIDNO3-4所示，NUAK2的引物对如SEQIDNO5-6所示，FBN2的引物对如SEQIDNO7-8所示，TNFAIP3的引物对如SEQIDNO9-10所示，ATF3的引物对如SEQIDNO11-12所示，FOSB的引物对如SEQIDNO13-14所示，PPP1R15A的引物对如SEQIDNO15-16所示；所述Real-timePCR反应程序为：95℃，30s预变性；95℃，5s；60℃，34s，40个循环。
以上所述任一方法应用于评价乳酸菌缓解细胞氧化损伤能力。
本发明所述TNF、EGR2、NUAK2、FBN2、TNFAIP3、ATF3、FOSB、PPP1R15A和GAPDH为发明人前期通过DGE表达谱测序等过程筛选出的与氧化应激相关的8个关键显著差异基因。
本发明所述TNF为肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor，TNF)，这个基因编码着一系列多功能的促炎因子，它们同属于肿瘤坏死因子家族，主要由巨噬细胞分泌。这一细胞因子能够参与多种细胞过程，包括增殖、分化、衰老、脂质代谢等，它也与多种疾病有关，例如免疫疾病、糖尿病以及癌症等。
本发明所述NUAK2，是AMPK(腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是一类重要的调节细胞肿瘤以及机体能量平衡的蛋白酶)的一种相关酶，NUAK2可由多种刺激环境所激活，如高渗应激、DNA损伤和氧化应激等，NUAK2还被报道称能够通过上调肿瘤细胞增殖、抑制p53信号通路等方法来促进肿瘤的生长和转移，可见NUAK2基因的上调对癌症等疾病有着促进的作用。
本发明所述EGR2，早期生长反应蛋白2(Earlygrowthresponseprotein2，EGR2)在外周神经髓鞘形成、脂肪细胞分化和免疫过程中都起到了至关重要的作用。
本发明所述TNFAIP3，TNFAIP3是由TNF表达所引起的，它所编码的蛋白质——肿瘤坏死因子α诱导蛋白3，能够抑制NF-κB的激活以及TNF所调节的衰老，与细胞因子诱导的免疫及炎症反应都有一定的联系。
本发明所述ATF3，转录激活因子3(activatingtranscriptionfactor3，ATF3)是一种应激早期快反应基因，可以被一系列损伤性的应激信号快速的诱导表达，它不仅充当应激反应过程中的关键性调控因子，还广泛的参与到维持机体稳态、细胞粘附、细胞凋亡、肿瘤形成等过程中。另外，Wu等利用HT29细胞和Caco-2细胞作为实验对象，发现ATF3基因表达上调对结肠癌的生长及转移也有促进作用。
本发明所述FOSB，Fos基因家族由FOS、FOSB、FOSL1和FOSL2组成，这些基因基因编码的蛋白质能够与JUN基因家族编码的蛋白质组成异二聚体，从而形成转录因子复合体AP-1，它能通过调节基因表达对多种刺激产生应答，也会参与如增殖、分化、凋亡等细胞进程的调控，而FOS所编码的蛋白同样具有调节细胞增殖、分化和转移的作用，异常表达可诱发肿瘤形成。
本发明所述PPP1R15A，蛋白磷酸酶1调节亚基15A(proteinphosphatase1，regulatorysubunit15A)是一类受到应激环境以及DNA损伤后转录水平会迅速升高的基因。
本发明采用体外实验的方法，通过选择合适的H2O2浓度来构建氧化损伤模型，接着将氧化损伤的Caco-2细胞与乳酸菌的菌体共同培养，利用Real-timePCR方法对发明人前期通过DGE测序筛选出的8个与氧化应激相关的基因分别测定表达情况，进而判断乳酸菌的缓解细胞氧化损伤能力。
利用本发明方法可以进行定性，判断乳酸菌是否具有缓解细胞氧化损伤能力，是否具有抗氧化能力，以及通过相互间的对比比较来判断抗氧化或缓解细胞氧化损伤能力的强弱。
本发明有益效果：
本发明提供了一种可以快速评价乳酸菌缓解细胞氧化损伤能力的方法，本发明方法简单快速，为快速筛选和评价乳酸菌新资源提供了理论基础，也为乳酸菌抗氧化作用的机制探究提供了新方法，增强了我国新型功能性乳酸菌食品的开发基础。
附图说明
图1为过氧化氢浓度与细胞存活率关系图。
图2为四株乳酸菌羟自由基清除活性。
图3为四株乳酸菌超氧阴离子自由基清除活性。
图4为四株乳酸菌DPPH自由基清除活性。
图5为H组与B组差异基因DGE测序数据和RealTimePCR验证。
图6为L组与H组及N组与H组差异基因DGE测序数据和RealTimePCR验证。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
以下实施例利用如下试验菌株、细胞及培养方法对本发明所述方法做进一步说明。
试验菌株：植物乳杆菌NDC75017分离自内蒙古通辽地区牧民自制的发酵酸奶中；嗜酸乳杆菌NCFM丹麦丹尼斯克公司(Danisco)惠赠；植物乳杆菌ATCC14917购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)；鼠李糖乳杆菌LGG购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)；人结肠癌细胞Caco-2购自中科院上海细胞库。
培养方法：四株乳酸菌分别于MRS固体培养基上三区划线，37℃培养36-48h后分别挑取单菌落培养于液体MRS培养基，12h后，分别按2％接种量接种于MRS液体培养基，37℃培养12h，传3代后即为实验菌株。6000r/min，4℃离心10min，收集上清液即为实验所需发酵液；离心后的菌体用无菌PBS洗涤三次，6000r/min，4℃离心10min，将菌体重悬于PBS即为实验所需菌体；将重悬于PBS中的菌体在沸水浴中处理20min，无菌PBS洗涤三次，6000r/min，4℃离心10min，重悬于PBS即为灭活菌体。
Caco-2细胞培养于含10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素，1％非必需氨基酸的高糖DMEM培养液中，在37℃、5％CO2条件下培养，每1-2天更换一次培养液，当细胞单层生长到覆盖培养瓶表面80％左右时，用PBS洗涤细胞，0.25％胰酶消化，以1:2比例进行传代后可继续培养。
实施例1：Caco-2细胞氧化损伤模型的构建
1、H2O2的浓度选择
为构建合理的氧化损伤模型需要对H2O2的浓度进行选择，本实验用MTT法确定构建氧化损伤模型所需H2O2的浓度，选择0μM、25μM、50μM、100μM、150μM、200μM、250μM、500μM、1000μM、2000μM的H2O2，与Caco-2细胞分别接触30min和1h后，测定细胞存活率。具体过程如下：
Caco-2细胞以每孔1×105的浓度接种于96孔板，培养24h，待细胞贴壁后开始实验，用PBS清洗3次以洗去培养液，用无血清无双抗的DMEM配制0μM、25μM、50μM、100μM、150μM、200μM、250μM、500μM、1000μM、2000μM的H2O2，向每孔加入100μl不同浓度的H2O2后培养，吸去H2O2，PBS清洗3次后，每孔加入20μlMTT溶液，继续培养4h，终止培养，吸去孔内MTT，每孔加入150μl二甲基亚砜，低速振荡10min，在490nm处测量各孔吸光值。
如图1显示，过氧化氢与细胞生长状态之间存在着一定的关系，与H2O2接触后Caco-2细胞活性呈现先略微上升后急速下降的趋势。目前大量研究显示，当Caco-2细胞接触的H2O2浓度＞500μM，时间长于1h则会引起细胞死亡或脱壁，因此根据本实验结果，选择较优范围为：H2O2浓度为250μM～500μM，处理时间为30min-60min，最佳条件为：H2O2浓度为500μM，处理时间为30min。
2、试验细胞分组
Caco-2细胞以每孔3×105的浓度接种于六孔板，连续培养18-21天，当细胞达到极化状态后开始实验。实验共分为11组，每组3个重复，具体分组如下，空白组：不对细胞进行任何处理，无菌PBS清洗3次后，每孔加入3mlDMEM(不含血清不含双抗，下同)进行培养；损伤组：对细胞进行氧化损伤处理，根据2.4.1的结果选择出，用DMEM配制最佳H2O2的浓度(500μM)，每孔加入3ml，30min后移除含有H2O2的DMEM，无菌PBS清洗3次，DMEM继续培养4h；阳性对照组：氧化损伤后的细胞无菌PBS清洗3次，每孔加入3mlDMEM配制的0.01％的Vc，继续培养4h；NCFM组、14917组、75017组、LGG组：氧化损伤后的细胞无菌PBS清洗3次，每孔加入3mlDMEM配制108cfu/ml的四种菌悬液，继续培养4h；灭活NCFM组、灭活14917组、灭活75017组、灭活LGG组：氧化损伤后的细胞无菌PBS清洗3次，每孔加入3mlDMEM配制108cfu/ml的四种灭活菌体的菌悬液，继续培养4h。实施例2：
1、Caco-2细胞RNA的提取
采用天根生化科技有限公司的“RNAprepPureCell/BacteriaKit，RNAprepPure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒DP430”，按照产品操作使用说明书，分别提取空白组(B组)、氧化应激组(H组)、LGG组(L组)、和NDC75017组(N组)中各3个样品的总RNA。具体操作步骤参照试剂盒说明书进行。
2、反转录
将提取的待检测RNA样品反转录为cDNA，然后进行反转录，反应体系10μl，具体反转录体系试剂及用量如下：
反转录过程为：37℃15min(反转录)，85℃5s(热灭活反转录酶)。
3、Real-timePCR检测基因表达
针对8个与氧化应激相关的基因(TNF、EGR2、NUAK2、FBN2、TNFAIP3、ATF3、FOSB、PPP1R15A)以及1个内参基因GAPDH，在NCBI上查找基因信息，利用Primer5.0软件来设计各个基因特异性引物，引物设计原则为特异性并跨内含子，具体引物相关信息见表1。
表1待测基因Real-timePCR引物名称及碱基序列
利用获得的cDNA及设计的引物对进行Real-timePCR反应，反应体系20μl，具体反应试剂及用量如下：
使用ABI/7500RCR系统进行目的基因的扩增反应，具体反应程序如下：95℃，30s预变性；95℃，5s；60℃，34s，40个循环。为确定扩增产物的特异性和纯度，我们对每种目的基因的扩增反应都进行了扩增产物的融解曲线分析。采用GAPDH作为内参基因对各个基因表达进行比较，待测样品均设置3个重复对照，并利用去离子水代替模板作为阴性对照。通过结果分析各基因的Ct值，通过计算得出标化后的-△△Ct值，最后利用2-△△Ct法来评估目的基因的表达。
这8个基因为H组与B组间显著差异的基因，分别为FOSB、TNF、PPP1R15A、NUAK2、ATF3、TNFAIP3、EGR2和FBN2。实验结果：经H2O2处理后，Caco-2细胞中这8个基因出现了不同程度的上调，在这8个基因中，其中有6个受到LGG作用后发生了下调，分别为TNF、PPP1R15A、NUAK2、TNFAIP3、EGR2和FBN2；其中有3个受到NDC75017作用后发生了下调，分别为NUAK2、EGR2和FBN2。由此可知，LGG和NDC75017具有缓解细胞氧化损伤的能力。
实验结果表明：四株乳酸菌均能不同程度的缓解Caco-2细胞氧化损伤，其中，LGG和植物乳杆菌NDC75017具有最为显著的缓解氧化损伤Caco-2细胞胞内SOD活性降低及GSH-Px活性激增的效果，但四株乳酸菌灭活菌体对Caco-2细胞氧化损伤的缓解作用并不明显。
利用DGE测序数据来辅助验证RealTimePCR结果。图5和图6为DGE测序和RealTimePCR结果，图5为H组与B组差异基因DGE测序数据和RealTimePCR验证，图6为L组与H组及N组与H组差异基因DGE测序数据和RealTimePCR验证。纵坐标为正数表示基因表达上调，负数表示基因表达下调。结果表明RealTimePCR和DGE测序的结果一致，这8个基因RealTimePCR表达量改变倍数与DGE测序数据结果中差异基因表达倍数基本保持趋势一致，因此RealTimePCR测定获得的信息具有比较高的准确性。
因此，利用本发明方法根据8个基因表达水平的变化能够评价缓解细胞氧化损伤的能力。实施例3：验证实验
通过测定乳酸菌清除自由基能力和抗氧化酶活性的测定来辅助验证乳酸菌的抗氧化能力及缓解细胞氧化损伤的能力。
1、乳酸菌清除自由基能力测定
对四株乳酸菌进行自由基清除能力的测定。
1)清除羟自由基能力测定
首先配制0.75mmol/L的邻二氮菲、pH7.4的PBS、0.75mmol/L的FeSO4和0.12％的H2O2，将1ml邻二氮菲、2mlPBS和1mlFeSO4充分混合均匀，再加入1mlH2O2后分别加入四株乳酸菌菌液及其发酵液，混合均匀后37℃静置孵育90min，在536nm处测量吸光值。
羟自由基清除活性(％)＝(As-Ac)/(Ab-Ac)×100
其中，As为样品组吸光值；
Ac为对照组吸光值(包括邻二氮菲、PBS、FeSO4和H2O2)；
Ab为空白组吸光值(包括邻二氮菲、PBS和FeSO4)。
2)清除超氧阴离子自由基能力测定
每1ml反应液中包含20mmol/LPBS(pH7.4)，50μmol/LNBT，75μmol/LNADH，15μmol/LPMS和50μl的菌液或发酵液，在37℃条件下孵育5分钟，560nm处测量吸光值。
超氧阴离子自由基清除活性(％)＝[(As-Ac)/As]×100
其中，As为样品组吸光值；
Ac为对照组吸光值(用蒸馏水取代样品)。
3)清除DPPH自由基能力测定
首先将DPPH溶于甲醇溶液，配制成0.1mmol/L的DPPH溶液，取此溶液2ml分别与1ml四株乳酸菌菌液及其发酵液混合均匀，室温避光孵育30min，在517nm处测量吸光值。
DPPH自由基清除活性(％)＝[(Ac-As)/Ac]×100
其中，As为样品组吸光值；
Ac为对照组吸光值(用蒸馏水取代样品)。
乳酸菌羟自由基清除活性如图2，由图2可知，四株乳酸菌菌体及发酵液均有一定的羟自由基清除能力。其中菌体的羟自由基清除能力分别为LGG(87.91％±0.023)＞NDC75017(79.87％±0.027)＞ATCC14917(69.74％±0.008)＞NCFM(65.17％±0.042)，发酵液羟自由基清除能力分别为LGG(40.42％±0.018)＞NDC75017(32.13％±0.017)＞ATCC14917(23.65％±0.025)＞NCFM(17.28％±0.018)。分析其结果可发现，在羟自由基清除活性方面四株乳酸菌菌体均大于发酵液，其中鼠李糖乳杆菌LGG表现出最强的羟自由基清除活性，植物乳杆菌NDC75017次之，乳酸菌菌体具有较强的羟自由基清除能力可归结为在乳酸菌细胞内存在着针对Cu2+和Fe2+的天然螯合物质，Cu2+和Fe2+能够参与到机体多种氧化过程中，因此乳酸菌对Cu2+和Fe2+的螯合作用，能够从根本上减少羟自由基的产生。
四株乳酸菌超氧阴离子自由基清除活性实验结果如图3，四株乳酸菌菌体超氧阴离子自由基清除率为NDC75017(39.45％±0.040)＞LGG(27.85％±0.020)＞ATCC14917(23.63％±0.015)＞NCFM(15.25％±0.013)，发酵液超氧阴离子自由基清除率为ATCC14917(63.62％±0.036)＞LGG(59.54％±0.008)＞NDC75017(51.83％±0.029)＞NCFM(35.40％±0.032)。在超氧阴离子自由基清除活性方面四株乳酸菌发酵液均大于菌体，其中菌体方面植物乳杆菌NDC75017表现出最强的超氧阴离子自由基清除活性，发酵液方面植物乳杆菌ATCC14917的发酵液具有最强的超氧阴离子自由基清除能力。乳酸菌菌体及发酵液具有超氧阴离子自由基清除能力可能是由于其菌体细胞及代谢产物中存在SOD，有报道显示，SOD、CAT、NADH氧化酶和NADH过氧化物酶等都存在于乳酸菌中，并且这些抗氧化酶是乳酸菌防御氧化应激的重要酶促防御系统。
清除DPPH自由基实验被广泛应用于抗氧化能力评价实验中。DPPH自由基清除活性如图4所示，四株乳酸菌菌体DPPH自由基清除率为LGG(22.89％±0.018)＞ATCC14917(16.55％±0.016)＞NDC75017(13.32％±0.027)＞NCFM(5.99％±0.002)，发酵液DPPH自由基清除率为NDC75017(55.13％±0.032)＞LGG(53.74±0.035)＞ATCC14917(38.02％±0.015)＞NCFM(22.55％±0.018)。在DPPH自由基清除活性方面四株乳酸菌发酵液均大于菌体，其中菌体方面鼠李糖乳杆菌LGG表现出最强的DPPH自由基清除活性，发酵液方面植物乳杆菌NDC75017的发酵液具有最强的DPPH自由基清除能力。
2、抗氧化酶活性的测定
对实施例1中共培养后的细胞进行抗氧化酶活性的测定。
实验结束后，用冷的无菌PBS迅速清洗3次，收集细胞，4℃条件下2000g离心10min，弃上清，用1ml冷PBS清洗，4℃条件下2000g离心10min，加入1ml1％的TritonX-100充分混匀，4℃条件下4000g离心15min，收集上清。分别测量不同处理组上清液中SOD活性、GSH-Px活性，结果如表2所示。
表2不同处理组抗氧化酶活性
a表示与空白组相比数据间差异显著(P＜0.05)，b表示与损伤组相比数据间差异显著(P＜0.05)
如表2所示，SOD活性方面，与空白组相比，氧化损伤组SOD活性显著降低，说明Caco-2细胞已受到氧化损伤，与损伤组相比，四株乳酸菌活菌处理组SOD活性均显著升高，且14917组、75017组和LGG组已与空白组没有显著差别；但四株乳酸菌灭活菌体组SOD活性变化均不显著。GSH-Px活性方面，与空白组相比，氧化损伤组GSH-Px活性显著升高，说明Caco-2细胞在低浓度H2O2环境中也会呈现GSH-Px活性上升的趋势，以缓解其受到的氧化损伤。与损伤组相比，三株乳酸菌活菌处理组GSH-Px活性均显著下降，其中以LGG组和75017组效果最为明显，GSH-Px活性恢复到与空白组没有显著差异，其次是14917组，最后为NCFM组；但四株乳酸菌灭活菌体组GSH-Px活性变化均不显著。
结果表明：与正常细胞相比，受到氧化损伤的Caco-2细胞胞内SOD活性显著降低(P＜0.05)、GSH-Px活性显著升高(P＜0.05)，四株乳酸菌的活菌均能不同程度缓解胞内SOD活性降低和GPx活性升高的情况，尤其是鼠李糖乳杆菌LGG和植物乳杆菌NDC75017表现出了最为显著的缓解氧化损伤Caco-2细胞胞内SOD活性降低及GSH-Px活性激增的效果(氧化损伤修复能力)，但四株乳酸菌灭活菌体对Caco-2细胞氧化损伤的缓解作用并不明显。
实验结果证实了四株乳酸菌活菌能够不同程度的缓解由H2O2所造成的Caco-2细胞氧化损伤，当Caco-2细胞处于氧化应激状态时，SOD活性显著降低，GSH-Px活性激增，说明细胞内抗氧化酶已对外界不良反应做出应答，而鼠李糖乳杆菌LGG和植物乳杆菌NDC75017具有最为显著的缓解SOD活性降低及GSH-Px活性激增的效果，这也与前期自由基清除实验的结果较为吻合，说明乳酸菌菌体及代谢产物起到了一定的抗氧化作用，可能是首先清除细胞周围的自由基使细胞不再受到自由基造成的进一步损伤，再通过调控宿主细胞内抗氧化酶的活性来缓解氧化应激，最终使宿主细胞内抗氧化酶活性趋于正常水平。但四株乳酸菌灭活菌体对Caco-2细胞氧化损伤的缓解作用并不明显，可能是在灭活过程中抗氧化成分也随之失去活性。
综上可知，实施例中所用的四株乳酸菌具有自由基清除能力及对氧化损伤细胞具有缓解作用，具有抗氧化能力，与本发明方法得出的结论一致。
本发明采用体外实验的方法，选择了与人体肠道细胞最为接近的达到极化状态的Caco-2细胞作为实验对象，通过选择合适的H2O2浓度来构建氧化损伤模型，接着将氧化损伤的Caco-2细胞与四株乳酸菌的菌体及灭活菌体共同培养，利用Real-timePCR方法对发明人前期通过DGE测序筛选出的8个基因分别检测表达情况，进而判断乳酸菌的缓解细胞氧化损伤能力。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种快速评价乳酸菌缓解细胞氧化损伤能力的方法，其特征在于，将乳酸菌和氧化损伤的细胞共培养，提取共培养前后细胞的RNA，检测共培养前后细胞中EGR2、NUAK2和FBN2的基因表达水平，通过基因表达水平的变化来判断乳酸菌缓解细胞氧化损伤的能力。
2.权利要求1所述方法，其特征在于，步骤如下：
1)构建细胞氧化损伤模型，获得受到氧化损伤的细胞；
2)将乳酸菌和步骤2)所得受到氧化损伤的细胞进行共培养；
3)提取共培养前后细胞的RNA；
4)检测共培养前后细胞中TNF、EGR2、NUAK2、FBN2、TNFAIP3、ATF3、FOSB和PPP1R15A的基因表达水平，通过基因表达水平的变化来判断乳酸菌缓解细胞氧化损伤的能力。
3.权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤如下：
1)构建过氧化氢氧化损伤Caco-2细胞模型，获得受到氧化损伤的Caco-2细胞；
2)将乳酸菌和步骤2)所得受到氧化损伤的Caco-2细胞共培养；
3)提取共培养前后的细胞RNA；
4)将步骤3)提取的RNA反转录为cDNA；
5)利用步骤4)所获得的cDNA进行Real-timePCR，检测共培养前后细胞中TNF、EGR2、NUAK2、FBN2、TNFAIP3、ATF3、FOSB、PPP1R15A和内参基因的表达水平，通过基因表达水平的变化来判断乳酸菌缓解细胞氧化损伤的能力。
4.权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1)所述过氧化氢，浓度为250μM-500μM，处理时间为30min-60min。
5.权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)所述共培养，时间为4h。
6.权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤4)所述反转录，过程为37℃15min，85℃5s。
7.权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤5)所述内参基因，为GAPDH；所述GAPDH的引物对如SEQIDNO17-18所示；步骤5)所述TNF的引物对如SEQIDNO1-2所示；EGR2的引物对如SEQIDNO3-4所示；NUAK2的引物对如SEQIDNO5-6所示；FBN2的引物对如SEQIDNO7-8所示；TNFAIP3的引物对如SEQIDNO9-10所示；ATF3的引物对如SEQIDNO11-12所示；FOSB的引物对如SEQIDNO13-14所示；PPP1R15A的引物对如SEQIDNO15-16所示。
8.权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤5)所述Real-timePCR，反应程序为：95℃，30s预变性；95℃，5s；60℃，34s，40个循环。
9.权利要求3所述方法，其特征在于，具体步骤为：
1)将达到极化状态的Caco-2细胞暴露于500μMH2O2处理30min，构建过氧化氢氧化损伤Caco-2细胞模型，获得受到氧化损伤的Caco-2细胞；
2)将乳酸菌和步骤2)所得受到氧化损伤的Caco-2细胞共培养；
3)提取共培养前后的细胞RNA；
4)将步骤3)提取的RNA反转录为cDNA；所述反转录过程为37℃15min，85℃5s；
5)利用步骤4)所获得的cDNA进行Real-timePCR，检测共培养前后细胞中TNF、EGR2、NUAK2、FBN2、TNFAIP3、ATF3、FOSB、PPP1R15A和内参基因的表达水平，通过基因表达水平的变化来判断乳酸菌缓解细胞氧化损伤的能力；所述内参基因为GAPDH，GAPDH的引物对如SEQIDNO17-18所示；所述TNF的引物对如SEQIDNO1-2所示，EGR2的引物对如SEQIDNO3-4所示，NUAK2的引物对如SEQIDNO5-6所示，FBN2的引物对如SEQIDNO7-8所示，TNFAIP3的引物对如SEQIDNO9-10所示，ATF3的引物对如SEQIDNO11-12所示，FOSB的引物对如SEQIDNO13-14所示，PPP1R15A的引物对如SEQIDNO15-16所示；所述Real-timePCR反应程序为：95℃，30s预变性；95℃，5s；60℃，34s，40个循环。
10.权利要求1-9所述任一方法应用于评价乳酸菌缓解细胞氧化损伤能力。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111718903A (zh) * 2020-06-24 2020-09-29 江南大学 一种筛选可预防和/或治疗骨质疏松的药物的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103118687A (zh) * 2010-08-27 2013-05-22 株式会社益力多本社 细胞保护剂
CN104807797A (zh) * 2015-05-12 2015-07-29 扬州市扬大康源乳业有限公司 一种基于细胞水平测定乳酸菌抗氧化活性的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103118687A (zh) * 2010-08-27 2013-05-22 株式会社益力多本社 细胞保护剂
CN104807797A (zh) * 2015-05-12 2015-07-29 扬州市扬大康源乳业有限公司 一种基于细胞水平测定乳酸菌抗氧化活性的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘少敏: "不同乳酸菌抗氧化能力比较及其机制的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技I辑》 *
陈卫等: "乳酸菌干预氧化应激的研究进展", 《中国食品学报》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111718903A (zh) * 2020-06-24 2020-09-29 江南大学 一种筛选可预防和/或治疗骨质疏松的药物的方法

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