CN105062949B

CN105062949B - 小花矮牵牛原生质体的制备方法

Info

Publication number: CN105062949B
Application number: CN201510363007.4A
Authority: CN
Inventors: 曾丽; 刘国锋; 王鹏; 刘晓丛; 彭勇政; 赵子刚; 林登贵; 王梦茹; 秦泽冠; 周嘉桢
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2015-06-26
Filing date: 2015-06-26
Publication date: 2019-01-11
Anticipated expiration: 2035-06-26
Also published as: CN105062949A

Abstract

本发明公开了一种小花矮牵牛原生质体的制备方法；该方法包括以下步骤：在黑暗条件下，将幼嫩叶片置于3～5℃清水中预处理20～25h；用酶解液酶解预处理后的叶片；加入和酶解液等体积的CPW洗液，摇匀，300目细胞筛过滤，转速1100r/min离心2min，吸去上清液；向沉淀中加入CPW洗液洗涤原生质体，转速1100r/min离心2min，收集沉淀加入悬浮液悬浮，即得到产量为(5.0±0.3)×10⁶个/g，活性达到85％的原生质体，9h后80％的原生质体可维持活性。用本发明的分离方法获得了高活性、高产量及状态良好的原生质体，可满足原生质体的培养及植株再生的条件，为植物原生质体融合培育新品种提供实验材料。

Description

小花矮牵牛原生质体的制备方法

技术领域

本发明涉及一种小花矮牵牛原生质体的制备方法。

背景技术

小花矮牵牛(Calibrachoa hybrid)又名舞春花，是茄科Calibrachoa属草本花卉，因花色丰富、花型优美，花期长及花量大，株型丛状紧凑，对介质中高PH值有很好的耐性等特点被广泛应用于城市园林绿化，商业发展潜力巨大。同时还可作为育种资源，与其它植物进行原生质体融合培育新品种，特别是可为黄色矮牵牛的培育开辟一条新的途径。

酶液种类和比例、渗透压、酶解时间、预处理方式及纯化方法等因素影响植物原生质体的分离。目前有关小花矮牵牛原生质体分离研究较少，Power(1980)等利用4wt％纤维素酶+2wt％半纤维素酶+0.3wt％离析酶分离小花矮牵牛叶片，酶解过程所需时间较长；Meyer(2009)利用2％纤维素酶+0.6wt％离析酶分离经过预质壁分离小花矮牵牛叶片，酶解时间15h，漂浮法纯化原生质体，原生质体产量约为2.3×10⁶个/g，活性可达80％以上。不同物种同一物种不同品种原生质体分离差异较大，有关小花矮牵牛原生质体分离效率不高，且分离时间较长。本发明建立了一套完善的分离体系，分离时间缩短，原生质体产量增加，原生质体纯化方式简便，可重复性好，极大的提高了小花矮牵牛原生质体的分离效率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种小花矮牵牛(Calibrachoa hybrid‘lindurayellow’)原生质体的制备方法；该制备方法简便，可高效制备原生质体，且可重复性好。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明所提供的制备原生质体的方法，包括以下步骤：

(1)对叶片进行预处理：在黑暗条件下，收集幼嫩叶片于3～5℃清水中进行20～25h预处理；

(2)用酶解液酶解步骤(1)中处理后的叶片；所述酶解液的溶剂为0.25M的磷酸盐溶液，溶质为如下终浓度的物质：2wt％的纤维素酶；0.8wt％的离析酶；0.2wt％的果胶酶；0.11wt％的无水氯化钙；0.10wt％的牛血清白蛋白；所述酶解液的pH值为5.6～5.7；

(3)向步骤(2)的酶解结束后的溶液中加入和所述酶解液等体积的A溶液，轻轻摇晃酶液，经过300目细胞筛过滤后1100r/min离心2min，移液枪吸去上清液；A溶液为CPW洗液，其中溶剂为CPW盐溶液，溶质为终浓度0.25M的甘露醇；

(4)在经过步骤(3)处理的体系中缓缓加CPW洗液洗涤，后在Centrifuge 5810R离心机1100r/min离心2min，吸去上清液，收集沉淀，即得原生质体；

(5)在所述原生质体中缓缓加入悬浮液，得到悬浮的原生质体；所述悬浮液为含0.25M的甘露醇、4mMMES、0.1wt％KCl的水溶液，所述悬浮液的pH为5.6～5.7。

作为优选技术方案，所述幼嫩叶片为顶芽下端第1～2片幼嫩叶片。

作为优选技术方案，所述幼嫩叶片为剪成0.1cm×0.2cm的条状叶片。所述步骤3)和4)中离心的试管均为50ml的大试管；所述步骤3)和4)中离心机的加速度为3。(离心机加速度一般是指从0转到10000转能力，共分1～9个等级。如加速度为1时表示从0转到10000转所用时间较长，加速度为9表示从0转到10000转所用时间较短。)

作为优选技术方案，所述磷酸盐溶液是由每升水中加入Na₂HPO₃·12H₂O 10.36g、NaH₂PO₃90.56g制备而得；所述磷酸盐溶液的pH为5.6～5.7。

作为优选技术方案，所述酶解温度为25～27℃，酶解时间为5h。在本发明中，酶解时间是影响原生质体产量和活性的重要参数；在酶解的前期，原生质体的产量随着酶解时间的增加而逐渐提高，在5h达到最高；超过5h后，原生质体产量随着酶解时间的增加而降低，同时细胞碎片逐渐增多；而原生质体的活性随着时间的增加一直在降低；综合原生质体产量和活性来看，5h为分离小花矮牵牛叶肉原生质体的最佳时间。

作为优选技术方案，所述纤维素酶为cellulaseR-10。

作为优选技术方案，所述离析酶为macerozymeR-10。

作为优选技术方案，所述果胶酶为pectolyaseY-23。

作为优选技术方案，所述CPW盐溶液是由每升水中加入KH₂CO₃27.2mg、KNO₃101.0mg、CaCO₃·2H₂O 1480mg、MgSO₄·7H₂O 246.0mg、KI0.16mg、CuSO₄·5H₂O0.025mg制备而得；所述CPW盐溶液的pH为5.6～5.7。在调配CPW洗液时，需要用微量氢氧化钠调到5.6～5.7；从而不仅保证最初CPW盐溶液是5.6～5.7，还保证含有甘露醇和其它物质最终的CPW洗液的PH值为5.6～5.7。

作为优选技术方案，所述小花矮牵牛品种为Calibrachoa hybrid‘lindurayellow’，花色黄色，购自Fides公司。

本发明所用的纤维素酶CellulaseOnozuka R-10与离析酶Macerozyme R-10和果胶酶Pectolyase Y-23的配比使用效果显著。离析酶对原生质体分离效果有显著的影响，在相同纤维素酶和果胶酶浓度下，随离析酶浓度的提高，原生质体产量和活性先增加后缓慢降低，当离析酶浓度在0.8wt％时，分离效果尤佳，当低于这个浓度时，原生质体的产量和活性均较低，这与离析酶分解植物组织中的果胶质，将植物组织分离成单细胞的作用有关；当高于这个浓度时，原生质体产量和活性下降，这与高浓度离析酶对原生质体产生毒害和损伤，破坏了原生质体的完整性有关。在所试验的酶液组合中，以2.0wt％纤维素酶CellulaseOnozuka R-10+0.2wt％果胶酶Pectolyase Y-23+0.8wt％离析酶Macerozyme R-10的组合，原生质体分离效果最好。

本发明以甘露醇为渗透压调节剂，不同甘露醇浓度调节的渗透压影响原生质体的产量和活性，随渗透压逐渐升高，原生质体产量逐渐降低，原生质体活性则先增加后降低，综合考虑原生质体的产量和活性，小花矮牵牛原生质体分离的甘露醇适宜浓度为0.25M。

本发明具有如下有益效果：

1)本发明的方法是首先对叶片进行低温黑暗处理，用含0.25M甘露醇+2.0wt％纤维素酶+0.2wt％果胶酶+0.8wt％离析酶的混合酶解液进行酶解，酶解完成后，对原生质体进行纯化离心洗涤，最后用悬浮液悬浮，使之处于正常状态。

2)用本发明的方法可以明显缩短分离时间减少对原生质体的伤害，得到活性很高的原生质体，活性可达到85％；与漂浮法比较纯化原生质体步骤简便且损失较少，制备叶肉原生质体产量高，可达到(5.0±0.3)×10⁶个/g，生长状态良好。

3)对通过此方法分离的原生质体进行培养及植株再生，可进一步为其它植物原生质体融合获得新品种提供育种材料。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为实施例制备的小花矮牵牛叶肉原生质体的图片；

图2为在荧光显微镜下检测实施例制备的小花矮牵牛叶肉原生质体的活性图片。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本发明涉及一种小花矮牵牛原生质体的制备方法，所述方法包括以下步骤：

A、在黑暗条件下，将小花矮牵牛的幼嫩叶片进行预处理；

B、用酶解液酶解步骤A处理后的叶片；所述酶解液的溶剂为0.25M的磷酸盐溶液，溶质为如下终浓度的物质：2wt％的纤维素酶、0.8wt％离析酶、0.2wt％果胶酶、0.11wt％无水氯化钙、0.10wt％牛血清白蛋白；所述酶解液的pH为5.6～5.7；

C、向步骤B酶解结束后的溶液中加入和所述酶解液等体积的CPW洗液，摇晃酶液，经300目细胞筛过滤后1100r/min离心2min，吸去上清液；所述CPW洗液中溶剂为CPW盐溶液，溶质为终浓度0.25M的甘露醇，CPW洗液的pH为5.6～5.7；

D、再次加入CPW洗液洗涤，1100r/min离心2min，吸去上清液，收集沉淀，即得原生质体；

E、在所述原生质体中缓缓加入悬浮液，得到悬浮的原生质体；所述悬浮液为含0.25M的甘露醇、4mMMES、0.1wt％KCl的水溶液，所述悬浮液的pH为5.6～5.7。

针对步骤A中的预处理，本发明在预处理的过程中共设置了两个预处理方式，具体为在黑暗条件下用4℃清水对叶片进行24h预低温黑暗处理或把叶片置于含0.55M甘露醇CPW溶液中进行1h的预处理；具体见表1：

表1 对外植体进行预处理

预处理方式对原生质体分离的影响：

酶解前对材料进行预处理，可改变细胞和细胞壁的生理状态，增加细胞膜的强度，提高细胞壁酶解的效率，减少原生质体损失。上述两组不同的预处理措施，用以研究其对叶片制备原生质体的影响，结果如表2所示。两种不同预处理方法与对照相比，原生质体产量和活性均呈增大趋势，但多重比较分析显示两种预处理之间并无显著差异。当把叶片置于4℃黑暗条件下放置24h，酶解产量为5.4x10^a个/g，活性达到87％，均比经预质壁分离处理和对照组得到的原生质体结果好。因此，分离小花矮牵牛叶肉原生质体最好的预处理方式为3～5℃黑暗放置20～25h，更优选4℃黑暗放置24h。

表2 不同预处理对原生质体产量及活性的影响

针对步骤B中的酶解液，本发明在选择酶液组分和浓度过程中，在2wt％纤维素酶+0.2wt％果胶酶的基础上，共设置4个离析酶浓度，分别为0wt％，0.4wt％，0.8wt％，1.2wt％。结果表明离析酶对于原生质体分离效果起到非常明显的作用，当离析酶浓度为0.8wt％时，原生质体产量较高，活性较好。具体如下：

酶液组合的选择：

酶液处理共设置4个组合，见表3。通过测定分离出原生质体的产量和活性，确定适宜的最佳酶液组合。

表3 酶液处理组合

酶液种类和浓度对原生质体产量和活性的影响：

在原生质体分离过程中，不同种类的酶及其浓度对原生质体产量和活性都有较大影响。结果如表4所示，纤维素酶Cellulase Onozuka R-10与离析酶Macerozyme R-10和果胶酶Pectolyase Y-23的配合使用效果很显著。离析酶对原生质体分离效果有显著的影响，在相同纤维素酶和果胶酶浓度下，随离析酶浓度的提高，原生质体产量和活性先增加后缓慢降低，当离析酶浓度在0.8wt％时，分离效果尤佳，当低于这个浓度时，原生质体的产量和活性均较低，这与离析酶分解植物组织中的果胶质，将植物组织分离成单细胞的作用有关；当高于这个浓度时，原生质体产量和活性下降，这与高浓度离析酶对原生质体产生毒害和损伤，破坏了原生质体的完整性有关。在所试验的酶液组合中，以2.0wt％纤维素酶CellulaseOnozuka R-10+0.2wt％果胶酶Pectolyase Y-23+0.8wt％离析酶Macerozyme R-10的组合，原生质体分离效果最好。

表4 酶液成分对分离小花矮牵牛叶肉原生质体效果的影响

针对步骤B中的酶解时间，本发明共设置了2、3、4、5、6、7h共6个酶解时间的处理。结果表明，综合原生质体产量和活性来看，5h为分离小花矮牵牛叶肉原生质体的较适宜时间。具体如下：

酶解时间的选择：

本发明设置了2，3，4，5，6，7h共6个酶解时间处理。小花矮牵牛叶片原生质体均在甘露醇浓度0.32M时，2％纤维素酶+0.2％果胶酶+0.8％离析酶的酶液组合下进行酶解。通过测定分离出原生质体的产量和活性，确定最佳酶解时间。

酶解时间对原生质体产量和活性的影响：

酶解时间是影响原生质体产量和活性的重要因素之一(表5)。试验结果表明，在酶解前期，原生质体的产量随着酶解时间的增加而逐渐提高，在5h达到最高；超过5h后，原生质体产量随着酶解时间的增加而降低，同时细胞碎片逐渐增多。而原生质体的活性随着时间的增加一直在降低。综合原生质体产量和活性来看，5h为分离小花矮牵牛叶肉原生质体的最佳时间。

表5 酶解时间对分离小花矮牵牛叶肉原生质体的影响

针对步骤B中的甘露醇浓度，本发明设置了0.2，0.25，0.30，0.35，0.40M共5个甘露醇浓度。结果表明，综合原生质体产量和活性来看，0.25M为分离小花矮牵牛叶肉原生质体较适宜的甘露醇浓度。具体如下：

将供试材料分别放入甘露醇浓度为0.2，0.25，0.30，0.35，0.40M的酶液组合中进行酶解，测定各处理原生质体的产量和活性，确定最适的甘露醇浓度。

渗透压稳定剂对原生质体产量和活性的影响：

适当的渗透压是细胞正常代谢的基本条件之一。细胞内外的渗透压差决定着外界环境与细胞内外物质交换方向。在原生质体分离过程中，无细胞壁保护，原生质体会变大并变脆弱，保证原生质体与反应体系内渗透压的平衡对于原生质体分离的产量和活性至关重要。本发明以甘露醇为渗透压调节剂，不同甘露醇浓度调节的渗透压对分离原生质体产量和活性的影响如表6所示。结果表明：随渗透压升高原生质体产量逐渐降低，原生质体活性则先增加后降低。综合考虑原生质体的产量和活性，小花矮牵牛原生质体分离适宜的甘露醇浓度为0.25M。

表6 酶液渗透压对分离小花矮牵牛叶肉原生质体的影响

采用本发明的制备方法制备小花矮牵牛原生质体的具体应用实施例如下：

实施例

本实施例涉及小花矮牵牛叶肉原生质体的制备，小花矮牵牛品种为Calibrachoahybrid‘lindura yellow’，花色黄色，购自Fides公司。具体包括如下步骤：

1、准备材料：取小花矮牵牛顶芽下第1～2片幼嫩叶片，称量0.33g。

2、质壁分离：对叶片进行预处理，在黑暗条件下，收集幼嫩叶片于3～5℃清水中进行20～25h的预处理。

3、酶解：向6cm小培养皿中加入5ml的酶解液，把经过预处理的叶片剪成0.1cm×0.2cm条状后平铺在酶液中，使之不相互重叠。黑暗条件下26±1℃静止酶解5h，期间每隔1h轻轻晃动培养皿使两相充分接触。酶解液为0.25M的磷酸盐溶液(Na₂HPO₃·12H₂O10.36g，NaH₂PO₃90.56g溶于1L纯水，pH＝5.6～5.7)，溶质为如下终浓度的物质：2wt％纤维素酶；0.8wt％离析酶；0.2wt％果胶酶；0.11wt％无水氯化钙；0.10wt％牛血清白蛋白；所述酶解液的pH为5.6～5.7(0.5M NaOH溶液微调即可)。

4、纯化：酶解结束后，在酶解液中加入和酶解液等体积的CPW洗液，轻轻摇晃酶液1min释放原生质体，用移液枪吸取溶液到300目不锈钢细胞筛上，经不锈钢细胞筛过滤除去未酶解完全的细胞团和组织，吸取混合酶置于50ml大离心管中1100r/min离心2min，离心加速度为3，吸去上清液，保留沉淀。向沉淀中加入10mlCPW洗液洗涤，1100r/min离心2min，轻轻吸去上清液，收集底部的原生质体。CPW洗液中溶剂为CPW盐溶液，溶质为终浓度0.25M的甘露醇，pH为5.6～5.7(0.5M NaOH溶液微调即可)。

5、悬浮原生质体：缓缓加入悬浮溶液3.3ml悬浮原生质体。悬浮液为溶质终浓度为0.25M的甘露醇，4mM的2-(N-吗啡啉)乙烷磺酸钠，0.1wt％氯化钾的水溶液，PH为5.6～5.7(0.5M NaOH溶液微调即可)。

6、用血球计数板统计原生质体产量。每个样品重复6次，取平均值，最后计算原生质体产量。

计算公式：细胞数/ml＝100小格内细胞个数/100×400×10000×稀释倍数

原生质体产量(个/g)＝[原生质体数(个/ml)×稀释后的体积(ml)]/叶片总质量(g)

检测原生质体数量可知，酶解得到的原生质体数目较多，细胞状态良好原生质体产量为(5.0±0.3)×10⁶个/g；如图1。

7、检测原生质体活性：将5mg双醋酸乙酸酯溶于1ml丙酮作为双醋酸乙酸酯母液(0℃保存)，然后向1ml悬浮的原生质体中加25ul双醋酸乙酸酯母液，室温3min反应后，取少量溶液置于载玻片用荧光显微镜观察。原生质体活性以一个视野中有活性的原生质体占该视野中原生质体总数的百分数来表示，选取10个有代表性的视野进行统计，在荧光显微镜下显示原生质体活性为85％，如图2；由图2可知，显微镜下发黄绿色荧光的即为有活性的原生质体。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims

1.一种小花矮牵牛原生质体的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

A、在黑暗条件下，将小花矮牵牛的幼嫩叶片置于3～5℃清水中预处理20～25h；

C、向步骤B酶解结束后的溶液中加入和所述酶解液等体积的CPW洗液，摇晃酶解液，经300目细胞筛过滤后1100r/min离心2min，吸去上清液；所述CPW洗液中溶剂为CPW盐溶液，溶质为终浓度0.25M的甘露醇；

E、在所述原生质体中加入悬浮液，分离得到悬浮纯化后的原生质体；所述悬浮液为含0.25M的甘露醇、4mM MES、0.1wt％KCl的水溶液，所述悬浮液的pH为5.6～5.7；

所述酶解温度为25～27℃，酶解时间为5h。

2.根据权利要求1所述的小花矮牵牛原生质体的制备方法，其特征在于，所述幼嫩叶片为顶芽下端第1～2片幼嫩叶片。

3.根据权利要求1或2所述的小花矮牵牛原生质体的制备方法，其特征在于，所述幼嫩叶片为剪成0.1cm×0.2cm的条状叶片。

4.根据权利要求1所述的小花矮牵牛原生质体的制备方法，其特征在于，所述磷酸盐溶液是由每升水中加入Na₂HPO₄·12H₂O 10.36g、NaH₂PO₄ 90.56g制备而得；所述磷酸盐溶液的pH为5.6～5.7。

5.根据权利要求1所述的小花矮牵牛原生质体的制备方法，其特征在于，所述纤维素酶为cellulaseR-10。

6.根据权利要求1所述的小花矮牵牛原生质体的制备方法，其特征在于，所述离析酶为macerozymeR-10，所述果胶酶为pectolyaseY-23。

7.根据权利要求1所述的小花矮牵牛原生质体的制备方法，其特征在于，所述CPW盐溶液是由每升水中加入KHCO₃ 27.2mg、KNO₃ 101.0mg、CaCO₃·2H₂O 1480mg、MgSO₄·7H₂O246.0mg、KI 0.16mg、CuSO₄·5H₂O 0.025mg制备而得；所述CPW盐溶液的pH为5.6～5.7。

8.根据权利要求1所述的小花矮牵牛原生质体的制备方法，其特征在于，所述小花矮牵牛品种为Calibrachoa hybrid‘lindura yellow’。