CN105062465A

CN105062465A - 一类环境敏感型的α1-肾上腺素能受体近红外荧光配体及其应用

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Publication number: CN105062465A
Application number: CN201510468188.7A
Authority: CN
Inventors: 李敏勇; 杜吕佩; 马朝
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2015-07-31
Filing date: 2015-07-31
Publication date: 2015-11-18
Anticipated expiration: 2035-07-31
Also published as: CN105062465B

Abstract

本发明涉及一类环境敏感型的α₁-肾上腺素能受体近红外荧光配体及其应用，其通式为(Ⅰ)，式中：R₁为药效团喹唑啉或苯基哌嗪；R₂为不同的取代基；X₁为不同类型的linker(碳链或三唑环)；n₁表示碳数为1-6，X₂为碘或溴离子。该荧光配体分子对α₁-肾上腺素能受体显示出较高的亲和力，且荧光会因周围环境的极性减小或者黏度增大而显著增强。与α₁-肾上腺素能受体结合时，分子进入疏水环境而释放出强烈的荧光信号，从而较容易地实现可视化，具有较好的信噪比。该荧光配体可作为工具药用于α₁-肾上腺素能受体药理学和生理学特征的研究。此外，该类化合物制备方法成熟，反应条件温和，原料便宜易得，操作及后处理方便。

Description

一类环境敏感型的α1-肾上腺素能受体近红外荧光配体及其应用

技术领域

本发明属于药物技术领域，具体涉及一类环境敏感型的α₁-肾上腺素能受体近红外荧光探针以及其在α₁肾上腺素受体细胞成像、亚细胞定位和表达水平检测等药理学和生理学研究中的应用。

背景技术

具有7次跨膜结构的G-蛋白偶联受体，是最大的细胞表面受体家族，其编码基因约占人类蛋白编码基因组的4％[Zhang,R.；Xie,X.ToolsforGPCRdrugdiscovery.ActaPharmacol.Sin.2012,33,372-84.]。作为一种多功能的分子机器，G-蛋白偶联受体调节着由激素和神经递质介导的大多数生理反应，是将近26％上市处方药物的作用靶点。尽管G-蛋白偶联受体的化学与结构生物学研究取得了可喜的进展，但是由于动态受体的构象多样性，其药理学及其生理学研究仍存在着很大的挑战[Granier,S.,Kobilka,B.AneweraofGPCRstructuralandchemicalbiology.Nat.Chem.Biol.2012,8,670-673.]。为了开发出用作受体研究的有效工具，荧光标记的药物分子，即小分子荧光配体越来与受到药物学家的关注。过去的几十年里，大量的G-蛋白偶联受体的小分子荧光配体被相继报道出来，而且已经广泛地应用于细胞水平的受体可视化和药理学研究[Ma,Z.；Du,L.；Li,M.TowardfluorescentprobesforG-protei-coupledpeceptors(GPCRs).J.Med.Chem.2014,57,8187-8203.]。然而，这些小分子荧光配体仍然存在的局限。一方面大多数已报道的荧光配体的荧光波长较短，常与细胞或组织本身的自发荧光产生干扰，而且这些短波的光穿透力弱，无法有效的透过深层组织，限制了其广泛应用。另一方面，传统的荧光配体缺乏一种有效的荧光开关机制，从而产生较强的非特异性结合信号，导致信噪比较差。

肾上腺素能受体是介导儿茶酚胺作用的一类组织受体，隶属于G-蛋白偶联家族，分为α和β两种亚型，是交感神经系统反应的重要介质。α₁-肾上腺素能受体包含三种亚型：α_1A、α_1B和α_1D[Zhong,H.；Minneman,K.P.Alpha1-adrenoceptorsubtypes.Eur.J.Pharmacol.1999,375,261-276]，主要调节平滑肌收缩、心肌收缩和肝脏葡萄糖代谢。研究表明，α₁-肾上腺素能受体是治疗良性前列腺增生(BPH)和高血压的药理靶点[Rosini,M.；Bolognesi,M.L.；Giardina,D.；Minarini,A.；Tumiatti,V.；Melchiorre,C.Recentadvancesinalpha1-adrenoreceptorantagonistsaspharmacologicaltoolsandtherapeuticagents.Curr.Top.Med.Chem.2007,7,147-162]。此外，研究还发现，α₁-肾上腺素能受体在前列腺肿瘤组织中高度表达，其拮抗剂对雄激素依赖和非依赖前列腺癌细胞都有促凋亡作用。α₁-肾上腺素能受体的不正常表达及分布于许多生理疾病息息相关，例如高血压、前列腺肥大、前列腺癌等。

相比于肾上腺素能受体家族的其他成员如β受体，α₁-肾上腺素能受体的药理学和生理学特征研究相对滞后。目前运用药理学手段研究α₁-肾上腺素能受体具有一定的难度，这是因为α₁-肾上腺素能受体拮抗剂虽然在活性上较以前有了很大的改善，但在组织选择性方面仍有待进一步优化；另一方面，α₁-肾上腺素能受体的三维晶体结构尚未解析，很难从基于分子水平对这些实验现象进行解释。因此开发出高灵敏的α₁-肾上腺素能受体的小分子荧光配体显得尤为重要。虽然近几年有不少α₁-肾上腺素能受体荧光探针相继问世，但他们都存在着上述传统荧光探针的缺点，即波长短且缺乏荧光开关机制。这些缺点大大限制了这些荧光探针的应用。

为寻找更为灵敏、高效的荧光探针，Cy系列荧光染料越来越受到研究人员的青睐。Cy荧光染料可以发近红外的荧光，并具有一定环境敏感的性质，已广泛地应用在生物大分子，尤其是DNA的荧光检测中。但是其在蛋白质的细胞荧光成像中的应用较少。在初期的研究中发现，Cy5荧光染料(化合物C1，实例一)可以使多种细胞明显着色，但是这种着色没有任何选择性(附图5)。如何化学修饰和连接Cy荧光染料，使得其荧光标记具有高度的选择性，也是科研人员亟待解决的难题。

发明内容

针对现有技术的不足，在已有的工作基础上，本发明把α₁-肾上腺素能受体特异性识别基团与Cy5荧光团进行连接，将荧光开关机制引入探针，使荧光性质得到有效的管理，构建出针对α₁-肾上腺素能受体的高灵敏小分子近红外荧光配体，并以此探针分子作为工具药用于α₁-肾上腺素能受体的生物学和生理学特征的体内和体外研究，为α₁-肾上腺素能受体的研究提供更方便、更有效、全新的研究手段；具体为：本发明提供近红外的具有环境敏感荧光性质的α₁-肾上腺素能受体小分子荧光配体及其制备方法、光学性质、生物活性、和受体药理特征研究中的应用。该小分子荧光配体对α₁-肾上腺素能受体具有高选择性和高灵敏度，可以作为工具药去研究α₁-肾上腺素能受体的生物学和生理学特征。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种环境敏感型的α₁-肾上腺素能受体近红外荧光配体，具有下述结构通式：(Ⅰ)。

式中：R₁为6,7-二甲氧基-2-(哌嗪-1-基)喹唑啉-4-氨，或1-(2-甲氧苯基)哌嗪；X₁为含或不含三唑环的长链连接基团；R₂为不同取代基；X₂为卤素离子。

优选的，n₁为1～6；X₂为碘或溴离子。

更为优选的，n₁等于1；R₂为甲基；X为碘离子。

更优选的，是下述化合物：

本发明所述化合物可用作α₁-肾上腺素能受体的小分子荧光探针；

本发明所述化合物可用作与α₁-肾上腺素能受体相关疾病的诊断和/检测；优选的，疾病为高血压、前列腺肥大、前列腺癌。

本发明所述化合物可用于筛选α₁-肾上腺素能受体相关疾病的药物；优选的，所述药物为α₁-肾上腺素能受体拮抗剂或激动剂。

本发明所述化合物可用于α₁-肾上腺素能受体的细胞成像和/或流式检测，在此需要说明，所述应用方法不属于疾病的诊疗方法，首先，细胞成像和/或流式检测可用于α₁-肾上腺素能受体拮抗剂或激动剂的筛选过程中；其次，用于生物体细胞时，所述细胞成像和/或流式检测的结果，无法直接说明机体是否患α₁-肾上腺素能受体相关疾病，其作为中间结果，需要进一步的与正常细胞比对并进一步的诊断才能确定生物体是否患病。

有益结果：

(1)本发明探针分子的荧光性质随着周围环境的改变而发生变化，尤其是其荧光会因周围环境的极性减小或者黏度增大而显著增强；

(2)当探针与α₁-肾上腺素能受体结合时荧光会大大增强，可以很容易地实现受体蛋白的可视化，提高了信噪比，避免了繁琐的洗涤步骤；

(3)本发明所述探针的荧光的波长可调范围大，可进入近红外区，能够有效的避开生物体系的自发荧光，从而极大提供了探针的灵敏性，避免干扰；

(4)本发明所述探针在兼顾灵敏性的同时，显示出与α₁-肾上腺素能受体极高的亲和力，对α₁-肾上腺素能受体特异性较高，以该类荧光配体作为工具药实现了α₁-肾上腺素能受体细胞成像、亚细胞和细胞表达水平检测等受体药理学和生理学特征的研究。

附图说明

图1.PTC-1在不同溶剂(A)以及DMSO与HEPES缓冲的混合溶液(B)中的荧光发射光谱；PTC-1在不同体积甘油和水的混合溶液中的荧光强度和荧光寿命(C)；不同浓度PTC-1在水中的荧光寿命(D)。

图2.PTC-1(A)和荧光团C1(B)对不同蛋白的荧光响应；多沙唑嗪淬灭PTC-1对α1-受体三种亚型蛋白特异性响应的荧光强度(C)；PTC-1对α1-受体转染的HEK293细胞特异性响应(D)；PTC-1的HEK293细胞成像结果(E)：α1A-HEK293细胞(a，b)，α1D-HEK293细胞(c，d)，HEK293细胞(e)，α1B-EGFP-HEK293细胞(f，g)；细胞以PTC-1(300nM)孵育(a，c，e，f)，细胞以PTC-1与多沙唑嗪混合溶液(300nm+3μM)进行孵育(b，d，g)

图3.PTC-1的不同肿瘤细胞成像结果。a，PC-3细胞，PTC-1；a’，PC-3细胞，PTC-1+doxazosin；b，DU145细胞，PTC-1；b’，PC-3细胞，PTC-1+doxazosin；PTC-1；c，Hela细胞，PTC-1；d，ES-2细胞，PTC-1；e，A549细胞，PTC-1；f，MCF-7细胞，PTC-1；g，HepG2细胞，PTC-1。

图4.流式细胞术测定α1-受体表达。A，α1A-HEK293与HEK293细胞；B，PC-3与Hela细胞。

图5.Cy荧光染料C1(30nM)在不同细胞的成像结果。(A)HEK293细胞；(B)PC-3细胞；(C)ES-2细胞.(a)明场；(b)红色荧光；(c)a与b的叠合.Scalebar＝20μm。

具体实施方式

下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实例一：PTC-1～3的合成

反应试剂与条件:(a)3-碘代丙酸,乙腈,回流,48h,81％；(b)碘甲烷,乙腈,回流,12h,86％；(c)盐酸-N-(3-苯氨基-2-丙烯亚基)苯胺,AcOH/AC₂O,120℃,4h；吡啶/AcOH,120℃,4h；30％两步；(d)炔丙胺,EDCI,DMAP,二氯甲烷,r.t.,6h,53％；(e)哌嗪,H₂O,100℃,81％；(f)酰基氯,TEA,乙腈,1h,0℃,62-75％；(g)NaN₃,DMSO,100℃,6h,35-88％；(h)CuSO4,抗坏血酸钠,tBuOH/H₂O＝2:1,50℃,1h,48.9-67.3％。

中间体C3：1-(2-羧乙基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-碘鎓

2,3,3-三甲基-3H-吲哚(1.0g,6.23mmol)和3-碘丙酸(1.86g,9.3mmol)溶于15mL乙腈中，回流48小时后，降至室温。旋干溶剂后，在超声震荡下，缓慢加入100mL乙酸乙酯，有大量沉淀析出。过滤，20mL乙酸乙酯洗涤滤饼，干燥后等白色固体1.8g，产率81％。熔点：181-183℃.¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆):δ12.72(s,1H),8.01-7.98(m,1H),7.85-7.83(m,1H),7.62-7.60(m,2H),4.67(t,2H,J＝7.0Hz),3.00(t,2H,J＝7.0Hz),2.86(s,3H),1.53(s,6H).¹³CNMR(100MHz,DMSO-d₆):δ198.4,172.0,142.2,141.3,129.8,129.4,124.0,116.0,54.7,44.0,31.6,22.4,14.9.ESI-MS:m/z[M-I^-]calcdforC₁₄H₁₈N₂O₂ ⁺232.1,found232.4。

中间体C4：1,2,3,3-四甲基-3H-吲哚-1-碘鎓

2,3,3-三甲基-3H-吲哚(2.0g,12.5mmol)和碘甲烷(2.3g,16.3mmol)溶于20mL乙腈中，回流12小时后，降至室温。过滤，20mL乙腈洗涤滤饼，干燥后等白色固体3.2g，产率86％。分解点：:244-245℃.¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆):δ7.93-7.91(m,1H),7.85-7.82(m,1H),7.65-7.60(m,2H),3.98(s,3H),2.78(s,3H),1.54(s,6H).¹³CNMR(100MHz,DMSO-d₆):δ196.5,142.6,142.1,129.8,129.3,123.8,115.6,54.4,35.2,22.2,14.7.ESI-MS:m/z[M-I^-]calcdforC₁₂H₁₄N⁺174.1,found174.4。

中间体C2：1-(2-羧乙基)-3,3-二甲基-2-((1E,3E,5E)-5-(1,3,3-三甲基吲哚-2-甲叉基)五-1,3-二烯-1-基)-3H-吲哚-1-碘鎓

氮气保护下，中间体C3(684.6mg,2.2mmol)和1-苯胺基-3-苯亚胺基丙烯盐酸盐(517.5mg,2mmol)溶于4mL乙酸和4mL乙酸酐中，回流搅拌4小时。降至室温后，旋干溶剂，残留物溶于4mL乙酸和4mL吡啶中。将中间体C4(602.5mg,2mmol)加至反应液中，氮气保护下回流2小时。降至室温，旋干溶剂，经两次硅胶柱层析分离得蓝色化合物341mg，产率30％。分解点：171-172℃.¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆):δ8.35(q,2H,J＝12.0Hz),7.61(t,2H,J＝7.6Hz),7.43-7.33(m,4H),7.26-7.20(m,2H),6.57(t,1H,J＝12.4Hz),6.40(d,1H,J＝14.0Hz),6.22(d,1H,J＝13.6Hz),4.26(t,2H,J＝7.2Hz)3.56(s,3H),2.26(t,2H,J＝7.2Hz),1.67(s,6H),1.66(s,6H).ESI-MS:m/z[M-I^-]calcdforC₂₉H₃₃N₂O₂ ⁺441.2,found441.6。

中间体C1：3,3-二甲基-1-(3-氧-3-(2-炔丙基-1-氨基-)丙基)-2-((1E,3E,5E)-5-(1,3,3-三甲基吲哚-2-甲叉基)五-1,3-二烯-1-基)-3H-吲哚-1-碘鎓

将中间体C2(427mg,0.82mmol),丙炔胺(158μL,2.46mmol),N,N-二甲氨基吡啶(DMAP,150mg,1.23mmol)，碳二亚胺盐酸盐(EDCI,173mg,0.9mmol)溶于20mL二氯甲烷中，室温搅拌6小时。将反应液以100mL二氯甲烷稀释，然后分别以100mL饱和柠檬酸溶液，100mL饱和碳酸氢钠溶液，50mL水和50mL饱和氯化钠溶液洗涤两次，无水硫酸钠干燥有机相过夜，过滤，旋出有机溶剂。将残留物以3mL干燥的二氯甲烷溶解，加50mL乙醚，超声振荡，过滤得蓝色国体243mg，产率53％。分解点：175-176℃.¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆):δ8.53(t,1H,J＝5.2Hz),8.39-8.27(q,2H,J＝12.8Hz),7.64(d,1H,J＝7.2Hz)7.61(d,1H,J＝7.6Hz),7.43-7.20(m,6H),6.58(t,1H,J＝12.4Hz),6.36(d,1H,J＝14.0Hz),6.22(d,1H,J＝13.6Hz),4.32(t,2H,J＝6.0Hz)3.81(dd,2H,J₂＝5.2Hz,J₂＝2.4Hz)3.63(s,3H),3.11(t,2H,J＝2.4Hz)2.60(t,2H,J＝6.4Hz),1.67(s,6H),1.66(s,6H).¹³CNMR(100MHz,DMSO-d₆):δ174.2,172.5,169.5,154.8,154.2,143.2,142.3,141.6,141.4,128.9,128.8,126.0125.4,124.9,122.8,111.7,111.4,104.4,103.4,81.2,73.8,49.5,49.2,40.4(coveredwithDMSO)33.3,31.7,28.5,27.7,27.4；ESI-MS:m/z[M-I^-]calcdforC₃₂H₃₆N₃O⁺478.3,found478.5。

中间体8：6,7-二甲氧基-2-(哌嗪-1-基)喹唑啉-4-氨

将2-氯-4-氨基-6,7-二甲氧基喹唑啉(9.96g,41.56mmol)和哌嗪(35.8g,41.56mmol)加入到50mL水中，于100℃搅拌6h。降至室温后，将50mL1.7NKOH溶液缓慢加入到反应液中，室温搅拌1h，过滤得沉淀，20mL水洗涤滤饼，甲醇重结晶得白色固体9.7g，产率81％.熔点.219-220℃.¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆):δ7.40(s,1H),7.03(s,2H),6.70(s,1H),3.82(s,3H),3.78(s,3H),3.64(t,4H,J＝4.8Hz),2.71(t,4H,J＝4.4Hz)；¹³CNMR(100MHz,DMSO-d₆):δ161.4,159.1,154.6,149.4,145.2,105.6,104.2,103.2,56.3,55.8,46.2,45.3；ESI-MS:m/z[M+H]⁺calcdforC₁₄H₂₀N₅O₂ ⁺290.2,found290.4。

中间体7a：1-(4-(4-氨基-6,7-二甲氧基喹唑-2-基)哌嗪-1-基)-2-氯乙基-1-酮

中间体8(1g,3.46mmol)和三乙胺(1mL,6.9mmol)加热溶解于100mL乙腈。冰水浴下，2-氯乙酰氯(286.3μL,3.8mmol)逐滴加入反应液中。冰浴搅拌1h后，蒸除溶剂。向残留物中加入5mL甲醇，室温搅拌20min，过滤，10mL甲醇洗涤滤饼，干燥，得白色固体950mg,产率75％.分解点:218-219℃.¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆):δ7.43(s,1H),7.16(s,2H),6.75(s,1H),4.43(s,2H),3.83(s,3H),3.79-3.72(m,7H),3.52(t,4H,J＝2.7Hz)；¹³CNMR(100MHz,DMSO-d₆):δ165.2,161.6,158.7,154.7,149.1,145.6,105.7,104.2,103.5,56.3,55.9,49.1(Methanol),45.8,44.2,43.8,42.4,42.2；ESI-MS:m/z[M+H]⁺calcdforC₁₆H₂₁ClN₅O₃ ⁺366.1327,found366.1334。

中间体7b：1-(4-(4-氨基-6,7-二甲氧基喹唑-2-基)哌嗪-1-基)-3-氯丙基-1-酮

中间体7b的合成以3-氯丙酰氯为原料，按照7a的合成方法，得白色固体920mg,产率为70％.熔点：212-215℃.¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆):δ7.42(s,1H),7.15(s,2H),6.74(s,1H),3.83-3.78(m,8H),3.74(t,2H,J＝4.4Hz),3.69(t,2H,J＝5.6Hz),3.52-3.51(m,4H),2.92(t,2H,J＝6.8Hz)；¹³CNMR(100MHz,DMSO-d₆):δ168.3,161.6,158.7,154.7,149.2,145.5,105.7,104.2,103.4,56.3,55.9,45.3,44.2,43.9,41.7,41.1,35.8；ESI-MS:m/z[M+H]⁺calcdforC₁₇H₂₃ClN₅O₃ ⁺380.1,found380.5。

中间体7c：1-(4-(4-氨基-6,7-二甲氧基喹唑-2-基)哌嗪-1-基)-3-氯丙基-1-酮

中间体7c的合成以4-氯丁酰氯为原料，按照7a的合成方法，得白色固体850mg,产率为62％.熔点：186-189℃.¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆):δ7.42(s,1H),7.16(s,2H),6.74(s,1H),3.83(s,3H),3.78(s,3H),3.75(t,2H,J＝4.0Hz)3.70(t,4H,J＝6.4Hz),3.52(t,4H,J＝6.4Hz),2.51-2.50(m,2H),1.99(m,2H)；¹³CNMR(100MHz,DMSO-d₆):δ170.2,161.2,158.7,154.7,149.5,145.5,105.6,104.2,103.4,56.3,55.9,45.5,45.3,44.2,43.9,41.6,29.9,28.5,；ESI-MS:m/z[M+H]⁺calcdforC₁₈H₂₅ClN₅O₃ ⁺394.2。

中间体P1：1-(4-(4-氨基-6,7-二甲氧基喹唑啉2-基)哌嗪-1-基)-2-叠氮乙基-1-酮

将叠氮化钠(0.89g13.65mmol)缓慢小心地加入中间体7a(1.0g,2.73mmol)的DMSO(10mL)溶液中，于100℃搅拌6h，降至室温。反应液以200mL二氯甲烷溶液稀释,然后分别以100mL饱和碳酸氢钠溶液，100mL水和100mL饱和食盐水洗涤两次，无水硫酸镁干燥有机相过夜。过滤，旋出溶剂得粗产品，硅胶柱层析纯化得白色粉末0.66g,产率65％.熔点：231-233℃.¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆):δ7.42(s,1H),7.15(s,2H),6.74(s,1H),4.20(s,2H),3.83(s,3H),3.79(s,3H),3.74(m,4H),3.53(t,2H),3.37(t,2H)；¹³CNMR(100MHz,DMSO-d₆):δ166.5,161.6,158.7,154.7,149.2,145.5,105.7,104.1,103.4,56.3,55.9,50.2,44.6,44.0,43.8,42.0；ESI-MS:m/z[M+H]⁺calcdforC₁₆H₂₁N₈O₃ ⁺373.1731,found373.1723。

中间体P2：1-(4-(4-氨基-6,7-二甲氧基喹唑啉2-基)哌嗪-1-基)-2-叠氮丙基-1-酮

中间体P2的合成以7b为原料，按照P1的合成方法，得白色固体440mg,产率35％.熔点：192-195℃.¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆):δ7.43(s,1H),7.16(s,2H),6.75(s,1H),3.83(s,3H),3.79(s,3H),3.75(t,2H,J＝5.2Hz),3.71(t,2H,J＝5.6Hz),3.56(m,6H),2.70(t,2H,J＝6.4Hz)；¹³CNMR(100MHz,DMSO-d₆):δ168.9,161.6,158.7,154.7,149.2,145.5,105.6,104.2,103.4,56.3,55.9,47.2,45.2,44.2,43.8,41.6,32.3；ESI-MS:m/z[M+H]⁺calcdforC₁₇H₂₃N₈O₃ ⁺387.1888,found387.1893。

中间体P3：1-(4-(4-氨基-6,7-二甲氧基喹唑啉2-基)哌嗪-1-基)-2-叠氮丁基-1-酮

中间体P3的合成以7c为原料，按照P1的合成方法，得白色固体1.1g,,产率88％.熔点：199-202℃.¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆):δ7.43(s,1H),7.16(s,2H),6.75(s,1H),3.83(s,3H),3.79(s,3H),3.74(t,2H,J＝4.8Hz),3.69(t,2H,J＝5.2Hz),3.50(m,4H),3.39(t,2H,J＝6.8Hz),2.46(t,2H,J＝7.2Hz),1.82-1.75(m,2H)；¹³CNMR(100MHz,DMSO-d₆):δ170.2,161.2,158.7,154.7,149.5,145.5,105.6,104.2,103.4,56.3,55.9,50.8,45.3,44.3,43.9,41.6,29.7,24.6,；ESI-MS:m/z[M+H]⁺calcdforC₁₈H₂₅N₈O₃ ⁺401.2044,found401.2045。

荧光配体PTC-1：1-(3-(((1-(2-(4-(4-氨基-6,7-二甲氧基喹唑啉-2-基)哌嗪-1-基)-2-氧乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)-3-氧丙基)-3,3-二甲基-2-((1E,3E,5E)-5-(1,3,3-三甲基吲哚-2-甲叉基)五-1,3-二烯-1-基)-3H-吲哚-1-碘鎓

将中间体C1和中间体P1溶于3.9mL叔丁醇：水(2:1)中，避光下将0.1M抗坏血酸钠(1.8mL)和0.1M硫酸铜(0.5mL)加至反应液中，50℃搅拌1h，检测反应完全，降至室温。旋出溶剂，残留物溶于5mL2MNH₄OH溶液中，以二氯甲烷萃取(3x25mL)，无水硫酸钠干燥过夜。过滤，旋干，粗产品经硅胶柱层析纯化得蓝色化合物23.9mg,产率48.9％.¹HNMR(300MHz,CD₃OD):δ8.30-8.18(m,2H),7.68(s,1H),7.50-7.20(m,9H),6.93(s,1H),6.50(t,1H,J＝12.3Hz),6.35-6.25(m,2H),5.46(s,2H),4.40-4.34(m,4H),3.92-3.83(m,10H),3.69(t,4H,J＝3.3Hz),2.72(t,2H,J＝6.9Hz),1.72(s,6H),1.68(s,6H)；ESI-HRMS:m/z[M-I^-]calcdforC₄₈H₅₆N₁₁O₄ ⁺850.4511,found850.4512.HPLCpurity99.1％,t_R＝10.459min,250×10.00mm,CH₃OH(0.05％triethylamine):H₂O＝95:5,2mL/min。

荧光配体PTC-2：1-(3-(((1-(2-(4-(4-氨基-6,7-二甲氧基喹唑啉-2-基)哌嗪-1-基)-2-氧丙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)-3-氧丙基)-3,3-二甲基-2-((1E,3E,5E)-5-(1,3,3-三甲基吲哚-2-甲叉基)五-1,3-二烯-1-基)-3H-吲哚-1-碘鎓

荧光配体PTC-2的合成以中间体P2为原料，按照PTC-1的合成方法，得蓝色化合物33.4mg,产率：67.3％.¹HNMR(300MHz,CD₃OD):δ8.22-8.07(m,2H),7.63(s,1H),7.43-7.12(m,9H),6.83(s,1H),6.53(t,1H,J＝12.3Hz),6.27(d,1H,J＝14.1Hz),6.16(d,1H,J＝12.3Hz),4.60(t,2H,J＝6.3Hz),4.30-4.22(m,4H),3.82(s,3H),3.79(s,3H),3.69(t,4H,J＝5.4Hz),3.57(m,5H),3.48(t,2H,J＝5.4Hz),3.03(t,2H,J＝6.3Hz),2.61(t,2H,J＝6.9Hz),1.64(s,6H),1.57(s,6H)；ESI-HRMS:m/z[M-I^-]calcdforC₄₉H₅₈N₁₁O₄ ⁺864.4668,found864.4656.HPLCpurity99.9％,t_R＝10.664min,250×10.00mm,CH₃OH(0.05％triethylamine):H₂O＝95:5,2mL/min。

荧光配体PTC-3：1-(3-(((1-(2-(4-(4-氨基-6,7-二甲氧基喹唑啉-2-基)哌嗪-1-基)-2-氧丁基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)-3-氧丙基)-3,3-二甲基-2-((1E,3E,5E)-5-(1,3,3-三甲基吲哚-2-甲叉基)五-1,3-二烯-1-基)-3H-吲哚-1-碘鎓

荧光配体PTC-3的合成以中间体P3为原料，按照PTC-1的合成方法，得蓝色化合物30.4mg,产率：60.4％.¹HNMR(300MHz,CD₃OD):δ8.20-8.09(m,2H),7.57(s,1H),7.43-7.13(m,9H),6.91(s,1H),6.54(t,1H,J＝9.3Hz),6.26(d,1H,J＝10.5Hz),6.19(d,1H,J＝10.2Hz),4.35-4.28(m,6H),3.85(s,3H),3.81(s,3H),3.79(t,2H,J＝3.6Hz),3.75(t,2H,J＝3.3Hz),3.60(t,2H,J＝4.5Hz),3.57(s,3H),3.52(t,2H,J＝3.9Hz),2.65(t,2H,J＝5.1Hz),2.39(t,2H,J＝5.1Hz),2.12(m,2H),1.64(s,6H),1.58(s,6H)；ESI-HRMS:m/z[M-I^-]calcdforC₅₀H₆₀N₁₁O₄ ⁺878.4824,found878.4823.HPLCpurity99.1％,t_R＝9.733min,250×10.00mm,CH₃OH(0.05％triethylamine):H₂O＝95:5,2mL/min。

实例二：PTC-4～6的合成

反应试剂和条件:(a)H₂O/乙腈,NaN₃,80℃,20h,43-74％；(b)TsCl,三乙胺,三氯甲烷,r.t.,24h,65-88％；(c)K₂CO₃,乙腈,90℃,64-69％；(d)CuSO4,抗坏血酸钠,tBuOH/H₂O＝2:1,50℃,1h,55.2-72.5％。

中间体11a：2-叠氮乙醇

将NaN₃(3.12g,48mmol)小心地加入到2-溴乙醇(2g,16mmol)的乙腈(10mL)和水(40mL)的混合溶液中，于80℃强力搅拌20h后，降至室温。反应液以二氯甲烷萃取(3×50mL)，无水硫酸镁干燥过夜，过滤，蒸除溶剂得透明油状物0.7g,产率50％.¹HNMR(300MHz,CDCl3):δ3.80(td,2H,J₁＝4.8Hz,J₂＝3.0Hz),3.27(t,2H,J＝5.4Hz),1.96(s,1H)。

中间体11b：3-叠氮-1-丙醇

中间体11b的合成以3-溴-1-丙醇为原料，按照11a的合成方法，得1.2g，产率74％.¹HNMR(300MHz,CDCl3):δ3.77(t,2H,J＝6.0Hz),3.48(t,2H,J＝6.6Hz),1.91(s,1H),1.88-1.79(m,2H)。

中间体11c：4-叠氮-1-丁醇

中间体11c的合成以4-氯-1-丁醇为原料，按照11a的合成方法，得0.8g，产率43％.¹HNMR(300MHz,CDCl3):δ3.68(td,2H,J₁＝6.0Hz,J₂＝2.1Hz),3.48(t,3H,J＝5.4Hz),1.75-1.59(m,4H)。

中间体10a：2-叠氮乙基-4-甲基苯磺酸酯

中间体11a(1.3g,15mmol)，对甲苯磺酰氯(5.7g,30mmol)和三乙胺(3g,30mmol)的二氯甲烷溶液于室温下搅拌24h。反应液以200mL二氯甲烷溶液稀释，分别以饱和碳酸钠溶液(50mL×2)，水(50mL×2)，卤水(50mL×2)洗涤，无水硫酸镁干燥过夜，过滤，蒸除溶剂。粗产物经硅胶柱层析分离纯化，得黄色油状物2.3g,产率65％.¹HNMR(300MHz,CDCl3):δ7.83(d,2H,J＝8.4Hz),7.38(d,2H,J＝8.1Hz),4.18(t,2H,J＝5.1Hz),3.50(t,2H,J＝5.1Hz),2.46(s,3H).ESI-MS:m/z[M+NH₄]⁺calcdforC₉H₁₅N₄O₃S⁺259.1,found259.3。

中间体10b：2-叠氮丙基-4-甲基苯磺酸酯

中间体10b的合成以中间体11b(1.12g,11mmol)为原料，按照10a的合成方法，得黄色油状物2.5g，产率88％。¹HNMR(300MHz,CDCl3)δ7.81(d,2H,J＝8.1Hz),7.38(d,2H,J＝8.1Hz),4.13(t,2H,J＝6.0Hz),3.40(t,2H,J＝6.6Hz),2.46(s,3H),1.93-1.85(m,2H).ESI-MS:m/z[M+NH₄]⁺calcdforC₁₀H₁₇N₄O₃S⁺273.1,found273.4。

中间体10c：2-叠氮丁基-4-甲基苯磺酸酯

中间体10c的合成以中间体11c(0.6g,5.2mmol)为原料，按照10a的合成方法，得黄色油状物1.2g,86％。¹HNMR(300MHz,CDCl3)δ7.80(d,2H,J＝8.4Hz),7.37(d,2H,J＝8.1Hz),4.07(t,2H,J＝6.0Hz),3.28(t,2H,J＝6.6Hz),2.46(s,3H),1.82-1.57(m,4H)；ESI-MS:m/z[M+NH₄]⁺calcdforC₁₁H₁₉N₄O₃S⁺287.1,found287.3。

中间体P4：2-(4-(2-叠氮乙基)哌嗪-1-基)-6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氨

向中间体8(1.0g，3.46mmol)和10a(920mg，3.8mmol)的乙腈溶液中(60mL)加入1.43g碳酸钾，混合物回流24h后，立即过滤得滤液。蒸除溶剂，经硅胶柱层析纯化得白色固体0.86g，产率69％.M.p.119-121℃.¹HNMR(300MHz,CDCl₃):δ6.94(s,1H),6.80(s,1H),5.13(s,2H),3.97(s,3H)3.93(s,3H),3.89(t,4H,J＝4.8Hz),3.42(t,2H,J＝6.0Hz),2.66(t,2H,J＝6.0Hz),2.59(t,4H,J＝5.1Hz)；¹³CNMR(100MHz,DMSO-d₆):δ166.5,158.8,154.7,149.0,145.4,105.5,104.2,103.3,57.3,56.3,55.5,47.6,44.1,44.0；ESI-MS:m/z[M+H]⁺calcdforC₁₆H₂₃N₈O₂ ⁺359.2,found359.6。

中间体P5：2-(4-(2-叠氮丙基)哌嗪-1-基)-6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氨

中间体P5的合成以中间体10b(893mg，3.5mmol)为原料，按照P4的合成方法，得白色固体0.8g，产率68％.mp.117-120℃.¹HNMR(300MHz,CDCl₃):δ7.08(s,1H),6.98(s,1H),5.12(s,2H),3.96(s,3H)3.95(s,3H),3.88(t,4H,J＝3.9Hz),3.40(t,2H,J＝6.9Hz),2.53-2.44(m,6H),1.86-1.76(m,2H)；¹³CNMR(100MHz,DMSO-d₆):δ161.5,158.9,154.7,149.2,145.4,105.6,104.2,103.3,56.3,55.8,55.3,53.3,49.4,44.0,26.1；ESI-MS:m/z[M+H]⁺calcdforC₁₇H₂₅N₈O₂ ⁺373.2,found373.4。

中间体P6：2-(4-(2-叠氮丁基)哌嗪-1-基)-6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氨

中间体P6的合成以中间体10c(1.2g,4.2mmol)为原料，按照P4的合成方法，得白色固体0.85g，产率64％.mp.140-141℃.¹HNMR(300MHz,CDCl₃):δ6.93(s,1H),6.79(s,1H),5.10(s,2H),3.97(s,3H)3.93(s,3H),3.88(t,4H,J＝4.8Hz),3.34(t,4H,J＝6.0Hz),2.53(t,4H,J＝5.1Hz),2.43(t,2H,J＝6.9Hz)1.66-1.62(m,2H)；¹³CNMR(100MHz,DMSO-d₆):δ161.5,160.0,154.6,149.3,145.3,105.7,104.2,103.3,57.8,56.3,55.8,53.4,51.1,44.1,26.8,23.9；ESI-MS:m/z[M+H]⁺calcdforC₁₈H₂₇N₈O₂ ⁺387.2,found387.5。

荧光配体PTC-4：1-(3-(((1-(2-(4-(4-氨基-6,7-二甲氧基喹唑啉-2-基)哌嗪-1-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)-3-氧丙基)-3,3-二二甲基-2-((1E,3E,5E)-5-(1,3,3-三甲基吲哚-2-甲叉基)五-1,3-二烯-1-基)-3H-吲哚-1-碘鎓

荧光配体PTC-4的合成以中间体P4为原料，按照PTC-1的合成方法，得蓝色化合物33.4mg,产率：67.3％。¹HNMR(400MHz,CD₃OD):δ8.20-8.10(m,2H),7.71(s,1H),7.42-7.15(m,9H),6.91(s,1H),6.55(t,1H,J＝12.4Hz),6.25(d,1H,J＝13.6Hz),6.20(d,1H,J＝13.6Hz),4.45(t,2H,J＝6.0Hz),4.29(m,4H),3.84(s,3H),3.81(s,3H),3.72(t,4H,J＝4.4Hz),3.56(s,3H),2.80(t,2H,J＝6.0Hz),2.65(t,2H,J＝6.8Hz),2.52(t,2H,J＝4.8Hz),1.64(s,6H),1.59(s,6H)；ESI-HRMS:m/z[M-I^-]calcdforC₄₈H₅₈N₁₁O₃ ⁺836.4719,found836.4714.HPLCpurity100.0％,t_R＝13.981min,250×4.60mm,CH₃OH(0.05％triethylamine):H₂O＝9:1,1mL/min.

荧光配体PTC-5：1-(3-(((1-(2-(4-(4-氨基-6,7-二甲氧基喹唑啉-2-基)哌嗪-1-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)-3-氧丙基)-3,3-二甲基-2-((1E,3E,5E)-5-(1,3,3-三甲基吲哚-2-甲叉基)五-1,3-二烯-1-基)-3H-吲哚-1-碘鎓

荧光配体PTC-5的合成以中间体P5为原料，按照PTC-1的合成方法，得蓝色化合物27.0mg,产率：55.2％。¹HNMR(400MHz,CD₃OD):δ8.20-8.10(m,2H),7.61(s,1H),7.43-7.13(m,9H),6.91(s,1H),6.55(t,1H,J＝12.4Hz),6.26(d,1H,J＝14.0Hz),6.19(d,1H,J＝13.6Hz),4.37(t,2H,J＝6.8Hz),4.30-4.27(m,4H),3.85(s,3H),3.81(s,3H),3.74(t,4H,J＝4.8Hz),3.56(s,3H),2.64(t,2H,J＝6.8Hz),2.45(t,4H,J＝7.2Hz),2.33(t,2H,J＝6.8Hz),2.05-1.98(m,2H),1.64(s,6H),1.59(s,6H)；ESI-HRMS:m/z[M-I^-]calcdforC₄₉H₆₀N₁₁O₃ ⁺850.4875,found850.4873.HPLCpurity96.2％,t_R＝14.110min,250×4.60mm,CH₃OH(0.05％triethylamine):H₂O＝9:1,1mL/min.

荧光配体PTC-6：1-(3-(((1-(2-(4-(4-氨基-6,7-二甲氧基喹唑啉-2-基)哌嗪-1-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)-3-氧丙基)-3,3-二二甲基-2-((1E,3E,5E)-5-(1,3,3-三甲基吲哚-2-甲叉基)五-1,3-二烯-1-基)-3H-吲哚-1-碘鎓

荧光配体PTC-6的合成以中间体P6为原料，按照PTC-1的合成方法，得蓝色化合物36.0mg,产率：72.5％。¹HNMR(400MHz,CD₃OD):δ8.21-8.10(m,2H),7.60(s,1H),7.41-7.13(m,9H),6.90(s,1H),6.56(t,1H,J＝12.4Hz),6.26(d,1H,J＝14.0Hz),6.21(d,1H,J＝13.6Hz),4.32-4.29(m,6H),3.85(s,3H),3.81(s,3H),3.74(t,4H,J＝6.4Hz),3.57(s,3H),2.66(t,2H,J＝6.8Hz),2.49(t,4H,J＝4.4Hz),2.40(t,2H,J＝7.2Hz),1.88-1.80(m,2H),1.64(s,6H),1.60(s,6H),1.51-1.48(m,2H)；ESI-HRMS:m/z[M-I^-]calcdforC₅₀H₆₂N₁₁O₃ ⁺864.5032,found864.5028.HPLCpurity95.4％,t_R＝14.251min,250×4.60mm,CH₃OH(0.05％triethylamine):H₂O＝9:1,1mL/min.

实例三：PHC-1～3的合成

反应试剂和条件:(a)K₂CO₃,乙腈,90℃,73-96％；(b)CuSO4,抗坏血酸钠,tBuOH/H₂O＝2:1,50℃,1h,49.4-57.7％。

中间体PH1：1-(2-叠氮乙基)-4-(2-甲氧苯基)哌嗪

向1-(2-甲氧苯基)哌嗪(665mg，3.46mmol)和11a(918mg，3.8mmol)的乙腈溶液中(30mL)加入1.43g碳酸钾，混合物回流24h后，立即过滤得滤液。蒸除溶剂，经硅胶柱层析纯化得黄色油状物690mg，产率76％.¹HNMR(300MHz,CDCl₃):δ7.02-6.84(m,4H),3.80(s,3H),3.41(t,2H，J＝6.0Hz),3.11(m,4H)，2.73-2.65(m,6H)；ESI-MS:m/z[M+H]⁺calcdforC₁₃H₂₀N₅O⁺262.2,found262.4。

中间体PH2：1-(2-叠氮丙基)-4-(2-甲氧苯基)哌嗪

中间体P7的合成以中间体10b(906mg，3.56mmol)为原料，按照PH1的合成方法，得黄色油状物0.85g，产率96％.¹HNMR(300MHz,CDCl₃):δ7.02-6.84(m,4H),3.86(s,3H),3.39(t,2H，J＝6.6Hz),3.10(m,4H),2.66-2.65(m,4H),2.52(t,2H,J＝6.9Hz),1.84-1.79(m,2H)；ESI-MS:m/z[M+H]⁺calcdforC₁₄H₂₂N₅O⁺276.2,found276.5。

中间体PH3：1-(2-叠氮丁基)-4-(2-甲氧苯基)哌嗪

中间体P8的合成以中间体10c(770mg，2.86mmol)为原料，按照PH1的合成方法，得黄色油状物0.55g，产率73％.¹HNMR(300MHz,CDCl₃):δ7.03-6.84(m,4H),3.86(s,3H),3.33(t,2H，J＝6.3Hz),3.10(m,4H),2.65(m,4H),2.52(t,2H,J＝6.9Hz),1.84-1.79(m,2H)；ESI-MS:m/z[M+H]⁺calcdforC₁₅H₂₄N₅O⁺290.2,found290.4。

荧光配体PHC-1：1-(3-(((1-(2-(4-(2-甲氧苯基)哌嗪-1-基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)-3-氧丙基)-3,3-二甲基-2-((1E,3E,5E)-5-(1,3,3-三甲基吲哚甲叉基)五-1,3-二烯-1-基)-3H-吲哚-1-碘鎓

荧光配体PHC-1的合成以中间体PH1为原料，按照PTC-1的合成方法，得蓝色化合物23.2mg,产率：53.6％。¹HNMR(300MHz,CD₃OD):δ8.30-8.16(m,2H),7.61(s,1H),7.75(s,1H),7.51-7.20(m,8H),7.04-6.81(m,4H),6.64(t,1H,J＝12.6Hz),6.35(d,1H,J＝13.8Hz),6.28(d,1H,J＝13.8Hz),4.50(t,2H,J＝6.3Hz),4.36-4.33(m,4H),3.81(s,3H),3.64(s,3H),2.98(t,4H),2.87(t,2H,J＝7.2Hz),2.72-2.65(m,6H),1.72(s,6H),1.66(s,6H)；HPLCpurity99.7％,t_R＝10.195min,250×10.00mm,CH₃OH(0.05％triethylamine):H₂O＝95:5,2mL/min。

荧光配体PHC-2：1-(3-(((1-(2-(4-(2-甲氧苯基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)-3-氧丙基)-3,3-二甲基-2-((1E,3E,5E)-5-(1,3,3-三甲基吲哚甲叉基)五-1,3-二烯-1-基)-3H-吲哚-1-碘鎓

荧光配体PHC-2的合成以中间体PH2为原料，按照PTC-1的合成方法，得蓝色化合物25.4mg,产率：57.7％。¹HNMR(300MHz,CD₃OD):δ8.30-8.17(m,2H),7.68(s,1H),7.75(s,1H),7.51-7.21(m,8H),7.02-6.85(m,4H),6.65(t,1H,J＝12.6Hz),6.35-6.25(m,2H),4.43-4.36(m,6H),3.82(s,3H),3.64(s,3H),3.05(t,4H),2.70-2.68(m,6H),2.47(m,2H),2.14(m,2H),1.72(s,6H),1.67(s,6H)；HPLCpurity99.7％,t_R＝10.259min,250×10.00mm,CH₃OH(0.05％triethylamine):H₂O＝95:5,2mL/min。

荧光配体PHC-3：1-(3-(((1-(2-(4-(2-甲氧苯基)哌嗪-1-基)丁基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)-3-氧丙基)-3,3-二甲基-2-((1E,3E,5E)-5-(1,3,3-三甲基吲哚甲叉基)五-1,3-二烯-1-基)-3H-吲哚-1-碘鎓

荧光配体PHC-3的合成以中间体PH3为原料，按照PTC-1的合成方法，得蓝色化合物22.1mg,产率：49.4％。δ8.30-8.17(m,2H),7.69(s,1H),7.75(s,1H),7.51-7.17(m,8H),7.07-6.85(m,4H),6.66(t,1H,J＝12.9Hz),6.35-6.25(m,2H),4.40-4.36(m,6H),3.82(s,3H),3.64(s,3H),3.08(t,4H),2.95-2.62(m,8H),2.00(m,2H),1.72(s,6H),1.67(s,6H),1.59(m,2H)；HPLCpurity99.7％,t_R＝10.169min,250×10.00mm,CH₃OH(0.05％triethylamine):H₂O＝95:5,2mL/min

实例四：光学性质和受体亲和力的测定

以酚妥拉明(Phentolamine)为阳性药，采用放射性配体竞争性结合实验[Zhang,W.；Ma,Z.；Li,W.；Li,G.；Chen,L.；Liu,Z.；Du,L.；Li,M.Discoveryofquinazoline-basedfluorescentprobestoα₁-adrenergicreceptors.ACSMedChemLett.2015,6,502-506.]，测定荧光配体分子与α₁-肾上腺素能受体的亲和力，结果如表1，探针分子与α₁-肾上腺素能受体有较高的亲和力，均在纳摩尔级别，酚妥拉明相当，并且分子对受体三个亚型的亲和力没有显著性差异。荧光性质方面，配体分子最大吸收波长为640nm，发射波长为665nm，在DMSO中的荧光量子产率比PBS中稍大。在进一步的考察中，我们选择亲和力最强的PTC-1进行进一步的研究。

表1荧光配体分子的光学性质以及其对α₁-肾上腺素能受体的亲和力

^a最大吸收和发射波长的测定在50mMPBS缓冲溶液中进行；^bK_i是由IC₅₀值经Cheng-Prusoff方程式计算所得；ND,notdetection；NA,notavailable

实例五：测定周围环境对配体分子荧光性质的影响

虽然上述荧光性质测量中，在DMSO和HEPES缓冲液中探针分子的荧光量子产率差别不大，但是其荧光强度在有机溶液中大大增强(约7倍，图1A,1B)，此外荧光强度和荧光寿命随溶液黏度的增加而增加(约3倍，图1C,1D)。说明该类分子属于环境敏感型的荧光探针。

实例六：PTC-1对α₁-肾上腺素能受体特异性识别。

PTC-1与α₁-肾上腺素能受体特异性识别从膜蛋白和细胞两个水平进行考察。

首先，将PTC-1与不同类型的蛋白共同孵育，结果发现PTC-1对α₁-肾上腺素能受体显示出较高的选择性。α₁-受体三个亚型蛋白可以使PTC-1释放较强的荧光信号，而其他蛋白即使过量10倍，释放的荧光信号仍较弱，说明PTC-1对α₁-受体蛋白有较强的选择性(图2A)。当过量的多沙唑嗪(α₁-受体拮抗剂)加入后，该荧光信号减弱，进一步证明了探针分子PTC-1与α₁-受体之间的特异性结合(图2C)。图2B显示了荧光染料C1与不同蛋白孵育后的荧光信号强弱情况，不同蛋白之间差异并不明显，显示出无选择性。

其次，我们选取α_1A和α_1D受体转染的HEK293细胞与PTC-1共同孵育，同样可以观察到强烈的荧光信号，而且该信号可以被过量的多沙唑嗪淬灭。基于此，我们实现了在细胞水平上α₁-受体原位成像。选取α_1A和α_1D稳转的HEK293A细胞、α_1B-EGFP瞬转的HEK293A细胞以及未转染的HEK293A细胞为考察对象。具体操作：收集细胞，接种于共聚焦小皿中(5×10⁴个/皿，2mL/皿)，培养24-36h。吸出培养基，1×PBS洗涤一次，加PTC-1(300nM)，PTC-1与多沙唑嗪混合溶液(300nm+3μM)，在37℃下孵育10min，不需洗涤，直接在ZeissAxioObserverA1荧光显微镜或共聚焦显微镜LSM700下观察，拍照。结果如图2D所示，在没有洗涤步骤的染色过程中，PTC-1明显地标记了三个亚型α₁-受体转染的HEK293细胞，这种标记可以被过量的多沙唑嗪竞争下来，导致荧光值下降。三种亚型的受体的亚细胞定位差别明显，α_1A在细胞膜和细胞质里都有分布，α_1B主要分布在细胞膜上，而α_1D主要分布在细胞质里。这和文献报道的结论高度一致[Chalothorn,D.；McCune,D.F.；Edelmann,S.E.；García-Cazarín,M.L.；Tsujimoto,G.；Piascik,M.T.；Differencesinthecellularlocalizationandagonist-mediatedinternalizationpropertiesoftheα₁-adrenoceptorsubtypes.Mol.Pharmacol.2002,61:1008-1016.]。值得注意的是，在我们构建的α_1B-EGFP瞬转的HEK293A细胞成像中，绿色荧光(EGFP)与红色荧光(PTC-1)几乎完全重叠，这也充分说明了PTC-1荧光配体分子的特异性和实用性。

实例七：PTC-1测定不同细胞α₁-肾上腺素能受体表达水平。

利用PTC-1可以比较不同细胞的α₁-肾上腺素能受体表达水平。这部分研究分别通过细胞成像和细胞流式术两种手段来进行考察。对于细胞成像，以七种肿瘤细胞(前列腺癌PC-3细胞，前列腺癌DU145细胞，肝癌HepG2细胞，卵巢癌ES-2细胞，宫颈癌Hela细胞，乳腺癌MCF-7细胞和肺癌A549细胞)为研究对象。细胞与PTC-1(300nM)孵育30min后，进行成像(其他操作与上述HEK293细胞成像一致)，结果(图3)显示α₁-肾上腺素能受体在PC-3和DU145两种前列腺癌细胞表达水平较高，而其他五种肿瘤细胞株中表达相对较低。对于流式细胞术，以转染的α_1A-HEK293细胞、未转染的HEK293细胞以及PC-3细胞、Hela细胞分别为研究对象。具体操作为：收集细胞，分于1.5mLEP管中(1×10⁶个/管，500μL)，2000rpm×5min洗涤细胞2次。每管加PTC-1(60nM,500μL)或PTC-1与多沙唑嗪的混合溶液(60nM+600nM，500μL)在37℃下孵育30min，无需洗涤，直接上机检测。结果(图4)显示PTC-1可以将高表达α₁-受体的细胞与低表达α₁-受体的细胞很好地区分开。此外，我们对荧光团C1在不同细胞中的荧光成像也进行了研究，如图5所示。尽管所有的成像结果均是洗涤之后得到的，不同细胞株仍然显示出强烈的荧光信号，各个细胞株中没有显著性差异。

Claims

1.一类环境敏感型的α₁-肾上腺素能受体近红外荧光配体，其特征在于，其具有下述结构通式：

2.根据权利要求1所述的荧光配体，其特征在于，n₁为1～6；X₂为碘或溴离子。

3.如权利要求2所述的荧光配体，其特征在于，n₁等于1；R₂为甲基；X₂为碘离子。

4.如权利要求1所述的荧光配体，其特征在于，该荧光配体选自具有如下结构式的化合物：

5.如权利要求1至4任一项所述荧光配体用作α₁-肾上腺素能受体的小分子荧光探针的应用。

6.如权利要求1至4任一项所述荧光配体在制备与α₁-肾上腺素能受体相关疾病的诊断和/检测试剂中的用途。

7.如权利要求6所述用途，其特征在于，所述疾病为高血压、前列腺肥大、前列腺癌。

8.如权利要求1至4任一项所述荧光配体在筛选α₁-肾上腺素能受体相关疾病的药物中的应用。

9.如权利要求8所述应用，其特征在于，所述药物为α₁-肾上腺素能受体拮抗剂或激动剂。

10.如权利要求1至4任一项所述荧光配体在α₁-肾上腺素能受体的细胞成像和/或流式细胞检测中的应用。