CN105061652A - 一种dna-聚合物空心微球的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种DNA-聚合物空心微球的制备方法，其步骤为：首先利用光引发可控自由基聚合法制备聚N-异丙基丙烯酰胺（PNIPAAm）；然后将己二胺、DNA与EDC反应制得氨基化DNA；将氨基化的DNA与Traut’s？Reagent试剂反应得到巯基化DNA；再将巯基化DNA与PNIPAAm反应制得DNA-聚N-异丙基丙烯酰胺耦合体；最后将助乳化剂、乳化剂、DNA-聚N-异丙基丙烯酰胺耦合体、缓冲液、油相一定比例混合后震荡，制得DNA-聚合物（DNA-PNIPAAm）空心微球。本发明合成步骤简单，操作方便，可以改变加工条件来改变微球尺寸，此外微球本身具有较好的生物相容性，在组织工程材料、药物缓释以及美容等方面展现出广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物组织医学材料制备技术领域，涉及一种以DNA-聚N-异丙基丙烯酰胺为构筑基元，微乳液制备DNA-聚合物（DNA-PNIPAAm）空心微球的方法。
背景技术
空心微球一般指粒径在500nm～2mm之间的球形颗粒，生物活性微球体带有反应性基团如-NH2、-COOH、-SH等。微球由于具有较小的尺寸而致使其具有明显的表面效应如材料的亲和性好、生物相容性好以及在生物体内易吸收、易游走等特性。
作为靶向给药系统的载体是空心微球在临床上的重要应用之一，也是近几年来国内外学者研究的热点之一。采用生物活性材料制成的空心微球，可以提高装载药物的稳定性，进一步通过膜通透性的调节实现药物的控释或缓释，从而提高了药物的疗效并且减少了药物对正常组织的毒副作用。但是，临床应用表明上述材料多少都存在一些问题，如：在体内部分吸收（体积保持率低）、迁移、引起免疫反应、产生并发症、植入困难等；另外，部分材料的成本较高，生物安全的问题也未得到解决（VanKerrebroeckP，TerMeulenF,FarrellyE,etal.Treatmentofstressurinaryincontinence:recentdevelopmentsintheroleofurethralinjection[J].UrolRes,2003；30(6):356-362；SuTH，HsuCY，ChenJC.Injectiontherapyforstressincontinenceinwomen[J].IntUrogynecolJ，1999；10(3):200-206.）。在此选用设计合成的DNA-聚N-异丙基丙烯酰胺（DNA-PNIPAAm）作为基元，DNA与蛋白质相比更加稳定，结构更加规整，可以携带更多的生命信息用于传输遗传及变异，这些优点将赋予所构建的空心微球好的生物相容性及不同生物功能。目前，虽然制备空心微球的方法有很多，包括微流体法、溶剂蒸发法、凝聚法等，但是这些方法拥有各自的优缺点，如微流体法虽然能得到尺寸一致的微球，但是过程复杂、参数精细。而考虑到构筑基元DNA-聚N-异丙基丙烯酰胺亲疏水比例，我们采用的微乳液法虽然得到的微球尺寸不一致，具有一定的分布，但是操作简单，只是将溶液混合便可得到空心微球，无疑是一种高效的制备DNA-聚合物空心微球的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种DNA-聚合物空心微球的制备方法，该方法解决了利用DNA为基元构筑空心微球的空白，且微球本身具有较好的生物相容性，在组织工程材料、药物缓释以及美容等方面展现出广阔的应用前景。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种微乳液法制备DNA-聚合物微球的方法，以DNA-聚N-异丙基丙烯酰胺为基元，微乳液制备DNA-聚合物（DNA-PNIPAAm）空心微球，具体制备步骤如下：
一、利用光引发可控自由基聚合法制备聚N-异丙基丙烯酰胺（PNIPAAm）；
二、称取0.2~2g己二胺，用20~50ml水溶解配制成溶液，用浓盐酸将溶液pH调整至7.0~8.5，随后将溶液缓慢滴加到50~300mgDNA中，加入20~150mgEDC，室温反应5~12h，得到氨基化DNA；
三、将1~10mg氨基化DNA加入400~850μl、14mMTraut’sReagent试剂中，室温反应2h~6h，得到巯基化DNA；
四、将15~40mg巯基化DNA与10~30mgPNIPAAm室温反应6~24h，得到DNA-聚N-异丙基丙烯酰胺耦合体；
五、将2~10μl助乳化剂、2~15μl乳化剂、20~60μl浓度为20mg/ml的DNA-聚N-异丙基丙烯酰胺耦合体、5~20μl缓冲液（磷酸缓冲液0.05M）（pH=7.5）加入到容器中，然后添加250~450μl油相，震荡10~90s后，制得DNA-聚合物（DNA-PNIPAAm）空心微球。
本发明步骤一中，所述的光引发可控活性自由基聚合法制备聚N-异丙基丙烯酰胺（PNIPAAm）的步骤如下：
称取6g2,2’-二硫二吡啶，用乙醇溶解配制成溶液30ml，再加入0.8g巯基乙醇反应；随后将溶液缓慢滴加到3ml二硫化碳和5g铁氰化钾混合溶液中，搅拌使其充分溶解得到RAFT试剂；将300mgN-异丙基丙烯酰胺、3mgRAFT试剂和15μl光催化剂混合，加入3ml乙腈中，经紫外光照10h，制得聚合物PNIPAAm。
本发明步骤二中，所述己二胺的质量优选为0.5g；用水的体积优选为25ml；溶液的pH优选为7.5；DNA的质量优选为100mg；EDC的质量优选为50mg；室温反应时间优选为10h。
本发明步骤三中，所述氨基化DNA的质量优选为5mg；14mMTraut’sReagent试剂的体积优选为710μl；室温反应优选为3h。
本发明步骤四中，所述巯基化DNA的质量优选为25mg；PNIPAAm的质量优选为优选19.3mg；室温反应时间为优选为12h。
本发明步骤五中，所述助乳化剂为正丁醇，体积优选为5μl；乳化剂为TritonX-100，体积优选为10μl；20mg/ml的基元物质DNA-聚N-异丙基丙烯酰胺的体积优选为40μl；缓冲液（pH=7.5）的体积优选为15μl；油相的体积优选为350μl；震荡时间优选为60s。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明制备的DNA-聚合物（DNA-PNIPAAm）空心微球具备生物相容性好、无毒害作用的优点，对生物体的应用降低各种不良反应。
2、本发明制备的DNA-聚合物（DNA-PNIPAAm）空心微球是共价键交联的稳定结构，膜具备一定的强度，且其通透性可通过耦联的聚合物PNIPAAm的分子量进行调控。
3、本发明制备的DNA-聚合物（DNA-PNIPAAm）空心微球可作为药物的载体同时载入多种药物，如包括具备消炎功能的药物。那么当空心微球进入生物体组织后，实现缓慢释放药物的同时且消除因空心微球的注入而引起的炎症。
4、本发明制备的DNA-聚合物（DNA-PNIPAAm）空心微球的方法合成步骤简单，操作方便，可以改变加工条件来实现微球尺寸的调控，作为药物载体满足进入不同生物组织需要，是一种十分有效的制备DNA-聚合物（DNA-PNIPAAm）空心微球的方法。
附图说明
图1是实施例2制备的DNA-聚合物（DNA-PNIPAAm）空心微球的粒径分布图；
图2是实施例2制备的DNA-聚合物（DNA-PNIPAAm）空心微球显微镜照片；
图3是实施例3制备的DNA-聚合物（DNA-PNIPAAm）空心微球的粒径分布图；
图4是实施例3制备的DNA-聚合物（DNA-PNIPAAm）空心微球显微镜照片。
图5是实施例4制备的DNA-聚合物（DNA-PNIPAAm）空心微球的粒径分布图；
图6是实施例5制备的DNA-聚合物（DNA-PNIPAAm）空心微球显微镜照片。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
实施例1：
称取6g的2,2’-二硫二吡啶，用乙醇溶解配制成溶液30ml，再加入0.8g巯基乙醇反应。随后将溶液缓慢滴加到3ml的二硫化碳和5g的铁氰化钾混合溶液中，搅拌使其充分溶解得到RAFT试剂。将300mg的N-异丙基丙烯酰胺、3mg的RAFT试剂和15μl的光催化剂混合，加入3ml的乙腈中，经紫外光照10h，制得聚合物PNIPAAm。
实施例2：
称取0.2g的己二胺，用20ml的水溶解配制成溶液，用浓盐酸将溶液pH调整至7.0。随后将溶液缓慢滴加到50mg的DNA中，加入20mg的EDC，室温反应5h，得到氨基化DNA；将1mg的氨基化DNA加入400μl的14mMTraut’sReagent试剂中，室温反应2h，得到巯基化DNA。将15mg的巯基化DNA与10mg的PNIPAAm室温反应6h，得到基元物质DNA-聚N-异丙基丙烯酰胺；将2μl助乳化剂、2μl乳化剂、20μl浓度为20mg/ml的基元物质DNA-聚N-异丙基丙烯酰胺、5μl缓冲液（pH=7.5）加入到容器中，然后添加250μl的油相，震荡10s后，制得DNA-聚合物（DNA-PNIPAAm）空心微球，其粒径分布如图1所示，显微镜照片如图2所示。
实施例3：
称取0.5g的己二胺，用25ml的水溶解配制成溶液，用浓盐酸将溶液pH调整至7.5。随后将溶液缓慢滴加到100mg的DNA中，加入50mg的EDC，室温反应10h，得到氨基化DNA；将5mg的氨基化DNA加入710μl的14mMTraut’sReagent试剂中，室温反应3h，得到巯基化DNA。将25mg的巯基化DNA与19.3mg的PNIPAAm室温反应12h，得到基元物质DNA-聚N-异丙基丙烯酰胺；将5μl助乳化剂、10μl乳化剂、40μl浓度为20mg/ml的基元物质DNA-聚N-异丙基丙烯酰胺、15μl缓冲液（pH=7.5）加入到容器中，然后添加350μl的油相，震荡60s后，制得DNA-聚合物（DNA-PNIPAAm）空心微球，其粒径分布如图3所示，显微镜照片如图4所示。
实施例4：
称取2g的己二胺，用50ml的水溶解配制成溶液，用浓盐酸将溶液pH调整至8.5。随后将溶液缓慢滴加到300mg的DNA中，加入150mg的EDC，室温反应12h，得到氨基化DNA；将10mg的氨基化DNA加入850μl的14mMTraut’sReagent试剂中，室温反应6h，得到巯基化DNA。将40mg的巯基化DNA与30mg的PNIPAAm室温反应24h，得到基元物质DNA-聚N-异丙基丙烯酰胺；将10μl助乳化剂、15μl乳化剂、60μl浓度为20mg/ml的基元物质DNA-聚N-异丙基丙烯酰胺、20μl缓冲液（pH=7.5）加入到容器中，然后添加450μl的油相，震荡90s后，制得DNA-聚合物（DNA-PNIPAAm）空心微球，其粒径分布如图5所示，显微镜照片如图6所示。
Claims (10)
1.一种DNA-聚合物空心微球的制备方法，其特征在于所述制备方法步骤如下：
一、称取0.2~2g己二胺，用20~50ml水溶解配制成溶液，用浓盐酸将溶液pH调整至7.0~8.5，随后将溶液缓慢滴加到50~300mgDNA中，加入20~150mgEDC，室温反应5~12h，得到氨基化DNA；
二、将1~10mg氨基化DNA加入400~850μlTraut’sReagent试剂中，室温反应2h~6h，得到巯基化DNA；
三、将15~40mg巯基化DNA与10~30mgPNIPAAm室温反应6~24h，得到DNA-聚N-异丙基丙烯酰胺耦合体；
四、将2~10μl助乳化剂、2~15μl乳化剂、20~60μlDNA-聚N-异丙基丙烯酰胺耦合体、5~20μl缓冲液加入到容器中，然后添加250~450μl油相，震荡10~90s后，制得DNA-聚合物空心微球。
2.根据权利要求1所述的DNA-聚合物空心微球的制备方法，其特征在于所述步骤一中，己二胺的质量为0.5g；用水的体积为25ml；溶液的pH为7.5；DNA的质量为100mg；EDC的质量为50mg；室温反应时间为10h。
3.根据权利要求1所述的DNA-聚合物空心微球的制备方法，其特征在于所述步骤二中，氨基化DNA的质量为5mg；Traut’sReagent试剂的体积为710μl；室温反应为3h。
4.根据权利要求1或3所述的DNA-聚合物空心微球的制备方法，其特征在于所述Traut’sReagent试剂的浓度为14mM。
5.根据权利要求1所述的DNA-聚合物空心微球的制备方法，其特征在于所述步骤三中，巯基化DNA的质量为25mg；PNIPAAm的质量为19.3mg；室温反应时间为12h。
6.根据权利要求1或5所述的DNA-聚合物空心微球的制备方法，其特征在于所述PNIPAAm的制备方法如下：称取6g2,2’-二硫二吡啶，用乙醇溶解配制成溶液30ml，再加入0.8g巯基乙醇反应；随后将溶液缓慢滴加到3ml二硫化碳和5g铁氰化钾混合溶液中，搅拌使其充分溶解得到RAFT试剂；将300mgN-异丙基丙烯酰胺、3mgRAFT试剂和15μl光催化剂混合，加入3ml乙腈中，经紫外光照10h，制得聚合物PNIPAAm。
7.根据权利要求1所述的DNA-聚合物空心微球的制备方法，其特征在于所述步骤四中，助乳化剂的体积为5μl；乳化剂的体积为10μl；基元物质DNA-聚N-异丙基丙烯酰胺的体积为40μl；缓冲液的体积为15μl；油相的体积为350μl；震荡时间60s。
8.根据权利要求1或7所述的DNA-聚合物空心微球的制备方法，其特征在于所述助乳化剂为正丁醇，乳化剂为TritonX-100。
9.根据权利要求1或7所述的DNA-聚合物空心微球的制备方法，其特征在于所述基元物质DNA-聚N-异丙基丙烯酰胺的浓度为20mg/ml。
10.根据权利要求1或7所述的DNA-聚合物空心微球的制备方法，其特征在于所述缓冲液的pH=7.5。
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| CN110859827A (zh) * | 2019-12-27 | 2020-03-06 | 华北水利水电大学 | 一种金纳米团簇耦合体、其制备方法及微胶囊 |
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