CN105056249A - 毛蕊花苷-金纳米颗粒复合物在治疗人或动物白血病中的应用 - Google Patents
毛蕊花苷-金纳米颗粒复合物在治疗人或动物白血病中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了毛蕊花苷-金纳米颗粒复合物在治疗人或动物白血病中的应用。经过多种实验充分证明了，毛蕊花苷-金纳米颗粒复合物可明显降低肿瘤细胞的活力、增强肿瘤细胞的凋亡，特别地毛蕊花苷-金纳米颗粒复合物可显著抑制植瘤小鼠肿瘤的生长、诱导小鼠肿瘤组织中肿瘤细胞的凋亡，为癌症的治疗提供了一种新思路。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，毛蕊花苷-金纳米颗粒复合物在治疗人或动物白血病中的应用。
背景技术
癌症是恶性肿瘤的统称。白血病是一种预后较差，死亡率较高的恶性肿瘤疾病，其严重危害人类健康和生命，曾被称为不治之症。急性白血病是病情非常凶险的一种疾病，患急性白血病患者若不经特殊治疗，其生存时间最多只有三个月，若该患者受到感染，或者是颅内出血，必死无疑。白血病治疗的一个重要手段是化疗，大部分病人往往会因白血病细胞的多药耐药而导致化疗无效或逐渐由有效转为无效。
金纳米颗粒(goldnanoparticle,Au)因其独特的结构、催化性能等优点在大多领域得到了广泛应用，在过去的十年，Au已在临床诊断和治疗癌症过程中得到了广泛应用，并且随着纳米技术的不断发展，作为一种有效、安全的药物载体，Au在癌症治疗领域获得越来越多的关注。
《毛蕊花苷对MPP+诱导的SHSY5Y细胞凋亡的保护作用》中虽然公开了毛蕊花苷(Verbascoside,VB)能抑制MPP+诱导的SHSY5Y细胞凋亡，并且VB对神经细胞的保护作用可能与其降低细胞内活性氧水平，维持线粒体膜电位的高能状态和抑制Caspase-3的活性有关。然而，上述发明所指向的病症是帕金森病，并没有提及VB对肿瘤细胞特别是人白血病细胞K562的作用。本领域技术人员并不清楚VB是否具有促进肿瘤细胞凋亡进而达到抑制肿瘤生长的作用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供毛蕊花苷-金纳米颗粒复合物(VB-Au)在治疗人或动物白血病中的应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
VB-Au在制备治疗人或动物白血病的药物中的应用；优选VB-Au在制备诱导人白血病细胞K562凋亡的药物中的应用。
本发明所述的应用，优选将VB包被Au制备成VB-Au复合物使用。本发明所述的VB-Au复合物可通过现有技术制备。
有益效果：
实验研究表明，同正常对照组(NC)相比，VB或VB-Au复合物均能促使人白血病K562细胞在体内外发生凋亡，但同VB处理组相比，VB-Au在体内外促使人白血病K562细胞发生凋亡的作用更加显著，加之VB-Au复合物成本低、易合成、毒副作用小等，因此VB-Au复合物有望用于制备治疗人或动物白血病药物。
附图说明
图1显示运用电镜鉴定合成的VB-Au复合物。A和C：Au纳米颗粒的扫描电镜图(A)和透射电镜图(C)；B和D：VB-Au的扫描电镜图(B)和透射电镜图(D)。
图2显示电镜观察K562细胞经VB-Au处理48h后，细胞核凝缩及核碎裂情况。A和C：未经处理的K562细胞的透射电镜图(A)和扫描电镜图(C)；B和D：经VB-Au处理的K562细胞的透射电镜图(B)和扫描电镜图(D)。
图3显示经VB-Au处理后K562细胞的凋亡状况。A：未经处理的K562细胞；B，C和D：经VB-Au处理24h(B)，48h(C)及72h(D)后，凋亡的K562细胞量不断增加。
图4显示经Au，VB及VB-Au分别处理K562细胞72h后，MTT检测各组细胞的细胞活力。结果显示，同未经处理的细胞(NC)相比，VB及VB-Au都可明显抑制细胞的活力，而VB-Au抑制细胞活力的作用比VB更显著。
图5显示经Au，VB及VB-Au分别处理K562细胞72h后，流式细胞术检测各组细胞的凋亡。图6为对图5细胞凋亡的定量分析。同样发现，同未经处理的细胞(NC)相比，VB及VB-Au都可显著诱导细胞的凋亡，而VB-Au促使细胞凋亡的作用比VB更显著。
图7显示进一步运用吖啶橙/溴化乙锭染色(AO/EB染色)分析经VB-Au处理的K562细胞的凋亡情况。A和B：K562细胞经VB-Au复合物处理24h前(A)、后(B)的早期凋亡图；C和D：K562细胞经VB-Au复合物处理72h前(C)、后(D)的晚期凋亡图。
图8显示K562细胞经不同组处理后发生凋亡的DNA片段分析图。A：为各组处理24h后的结果；B：为各组处理细胞48h后的结果；C：为各组处理72h后的结果；D：为各组处理0h的图片。其中，泳道1为正常对照组，泳道2为经VB单独处理组，泳道3为经VB-Au复合物处理组。结果显示，VB和VB-Au都可时间依赖性的诱导细胞发生凋亡，然而，同VB处理组相比，VB-Au诱导细胞凋亡的作用更加显著。
图9显示免疫印迹法(WesternBlot)检测经Au，VB及VB-Au处理的K562细胞中相关凋亡蛋白的表达。A：检测各处理组细胞中Cleavedcas9、Cleavedcas8和Cleavedcas3蛋白的表达水平，其中泳道1为未经过处理的正常的K562细胞；泳道2为经Au处理的K562细胞；泳道3为经VB处理的K562细胞；泳道4为经VB-Au复合物处理的K562细胞；B，C和D：分别为对Cleavedcas9(B)、Cleavedcas8(C)和Cleavedcas3(D)蛋白表达的定量分析。结果显示，VB和VB-Au都可诱导以上3中凋亡相关蛋白的表达，但同VB处理组相比，VB-Au可更有效的诱导Cleavedcas9、Cleavedcas8和Cleavedcas3蛋白的表达。
图10显示经腹腔注射VB-Au及其他对照组后，各组小鼠K562肿瘤的改变。A和C：植瘤小鼠经腹腔注射PBS、Au、VB和VB-Au后，检测各组小鼠肿瘤的大小，其中图(A)为肿瘤图片观察，图(C)为肿瘤体积检测；B：各组植瘤小鼠注射PBS、Au、VB和VB-Au期间，肿瘤体积随时间的变化情况；D：各组小鼠肿瘤组织进行苏木素-伊红染色(H-E染色)分析。结果表明，同PBS组相比，经VB和VB-Au治疗后可显著抑制小鼠K562肿瘤的生长、诱导组织中肿瘤细胞的凋亡。但VB-Au复合物的作用较VB更显著。
具体实施方式
实施例1
在5ml20nm的金纳米颗粒(Au)溶液中，加入0.4ml水和2.6ml1M的SH-PEG-COOH(分子量5000)，15min后，加入4ml的10M的SH-PEG(分子量5000)，20min后，离心(10000g/min,30min)，取底部沉淀液，去离子水稀释到5ml,碳酸钾溶液调PH为8，加热到60度，随后，加入2ml1M的毛蕊花糖苷(VB)溶液，进行酯化反应。反应2h后，离心去底部沉淀液，即为20nm的金纳米颗粒共价键修饰毛蕊花糖苷的复合物(VB-Au)。最后可通过扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)分别测量Au和VB-Au复合物的大小，结果见图1，由图可看出，VB-Au纳米颗粒复合物的大小约为20nm。
实施例2
K562细胞购自天津血液学研究所，用添加10％GIBCO胎牛血清和青霉素(100U/ml)的1640培养基，在37℃、pH值7.2～7.4，二氧化碳浓度为5％，且湿气充足的培养箱中无菌恒温培养。为了检测VB-Au对K562细胞活力的影响，取100μLVB-Au加入到K562细胞中，继续放于培养箱中培养。培养48h后，运用SEM和TEM观察细胞的形态变化，结果见图2，由图A，B可看出，细胞加药后发生核破裂，由图C，D可看出，细胞加药后发生核萎缩。
实施例3
将K562细胞接种到孔板中，其中一组作为正常对照组，其余分别添加100μLVB-Au纳米颗粒复合物，于37℃、pH值7.2～7.4，二氧化碳浓度为5％并且湿气充足的培养箱中分别培养24h、48h、72h，用显微镜观察细胞的凋亡状况，结果见图3，由图可知，VB-Au可促使细胞发生凋亡，并且随着处理时间的延长，凋亡的细胞数量也逐渐增加。
实施例4
将K562细胞进行计数，根据计数结果将K562细胞按2×104cells/孔的密度接种于96孔板中，每孔100μL。于37℃、pH值7.2～7.4，二氧化碳浓度为5％并且湿气充足的培养箱中培养24h，其中一组作为正常对照组，其余分别添加5μLAu、VB及VB-Au纳米颗粒复合物，72h后，向各孔中加入10μLMTT(5mg/mL)，37℃培养箱继续培养4h，取出孔板，弃培养液，向各孔中加入100μLDMSO，溶解紫色结晶，然后将96孔板放入酶标仪中37℃孵育10min，在570nm波长下读取吸光度值。结果见图4，由图可知，同其他对照组相比，经VB-Au纳米颗粒处理后的K562细胞的活力显著降低，即：VB-Au可有效抑制细胞的存活。
实施例5
将K562细胞接种到10cm培养皿中，其中一组作为正常对照组，其余添加200uLVB-Au纳米颗粒后于37℃、pH值7.2～7.4，二氧化碳浓度为5％并且湿气充足的培养箱中培养72h，收集细胞进行流式检测，步骤如下：
(1)将K562细胞收集到15mL的离心管中，每样本细胞数为1×106cells/mL，1000r/min离心5min，弃去培养液。
(2)用PBS缓冲液洗涤1次，1000r/min离心5min，弃去上清液。
(3)用100μL的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10～15min。
(4)1000r/min离心5min，沉淀细胞用PBS缓冲液洗1次。
(5)加入荧光溶液4℃下孵育20min，避光并不时振动。
(6)流式细胞仪分析：流式细胞仪激发光波长用488nm，用一波长为515nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560nm的滤器检测PI。
(7)结果判断：凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为(FITC-/PI-)；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为(FITC+/PI+)；而右下象限为凋亡细胞，显现(FITC+/PI-)。结果见图5，由图可知，经VB-Au纳米颗粒复合物处理后的K562细胞凋亡的细胞量最多。根据实
施例5的实验，对实验结果进行定量分析，结果见图6，由图可知，同VB处理组相比，经VB-Au纳米颗粒复合物处理后，K562细胞凋亡的数量显著增加。
实施例7
将K562细胞接种到孔板中，添加20μLVB-Au纳米颗粒复合物后于37℃、pH值7.2～7.4，二氧化碳浓度为5％并且湿气充足的培养箱中培养24h或72h，用胰酶消化细胞，随后向细胞悬液中加入lμLAO/EB染色液混合物(100μg/mL吖啶橙和100μg/mL溴化乙锭)，在荧光显微镜下观察凋亡的细胞，结果见图7。由图可知，同未经处理的正常细胞相比，经VB-Au纳米颗粒处理的K562细胞经染色后橙红色或红色的细胞(注：发生凋亡的细胞显示红色)量增加，并且随着处理时间的延长，凋亡细胞的数量显著增加。
实施例8
(1)收集分别经VB、VB-Au纳米颗粒复合物处理24h、48h和72h后的K562细胞107个到15mL离心管中，以1000rpm离心5min后去上清液，其中未经处理的正常细胞作为对照；
(2)向所述15mL离心管中加入50μL细胞裂解液，吹打混匀10秒钟，以4500rpm离心5min后，取上层液A于1.5mL离心管中；再次向所述15mL离心管中加入50μL所述细胞裂解液，吹打混匀10秒钟，以4500rpm离心5min，取上层液A和B于所述1.5mL离心管中；
(3)于所述1.5mL离心管中加入5μLA液混匀，放入30℃±1℃孵育10min；
(4)再于所述1.5mL离心管中加入5μLB液混匀，放入50℃±1℃水浴锅中过夜孵育10～12h；
(5)再于所述1.5mL离心管中加入5μL醋酸铵溶液混匀，并加入100μL异丙醇充分混匀后放入-20℃冷冻10min，然后以13000rpm离心10min，去除上层液C，得到DNAladder沉淀；
(6)所述DNAladder沉淀中加入500μL的质量浓度为70％的乙醇，以13000rpm离心10min，去除上层液D，得到洗涤后的DNAladder沉淀；
(7)所述洗涤后的DNAladder沉淀室温下晾干10min后加入30μLDNAladder溶解液，然后采用凝胶成像系统进行凝胶电泳实验，1h后采用凝胶成像系统进行紫外检测即可。
所述步骤(7)中采用凝胶成像系统进行凝胶电泳实验的条件是指琼脂糖胶的质量浓度为1.2％，电压为80V，温度为常温，进样方式为点样，进样量为10μL。
所述步骤(7)中采用凝胶成像系统进行紫外检测的条件是指波长为254nm，温度为常温，进样量为10μL。
结果见图8，由图可知，未经处理的正常K562细胞没有凋亡条带出现，且同VB处理组相比，经VB-Au纳米颗粒复合物处理的K562细胞经提取DNAladder后可见清晰条带，并且随着处理时间的延长，条带越清晰。由此可见，同单独VB处理组相比，VB-Au纳米颗粒复合物促使K562细胞发生凋亡的效果最好。
实施例9
向处于对数期的K562细胞中加入等量的Au、VB、VB-Au，分别培养48h，其中，未处理的正常细胞作为对照。收集处理的细胞，用RIPA缓冲液进行裂解提取蛋白，随后用BCA试剂盒测定蛋白浓度，然后将等量样品上样到配制好的10％SDS-PAGE胶上，进行电泳，随后进行转膜、封闭、孵育抗体及显影。结果见图9，由图可知，同其他对照组相比，经VB-Au纳米颗粒复合物处理的K562细胞，促凋亡蛋白Cleavedcas9、Cleavedcas8和Cleavedcas3的表达量明显增加，因而，VB-Au纳米颗粒复合物可更好的促使K562细胞发生凋亡。
实施例10
取处于对数期的K562细胞，对8只裸鼠(6周龄的雌鼠)进行皮下植瘤，每2天观察一次肿瘤生长情况。约植瘤后一周，待肿瘤生长至200mm3，将植瘤鼠随机分四组，分别经腹腔注射PBS、Au、VB和VB-Au，注射剂量为200μL/次，隔天给药并持续给药2-3周。给药结束后，处死裸鼠并取出肿瘤。经石蜡包埋，制成切片，经H-E染色观察不同组之间肿瘤组织中肿瘤细胞的凋亡情况。结果见图10，由图可知，同其他对照组相比，经VB-Au纳米颗粒复合物注射后，小鼠肿瘤的体积明显减小，且肿瘤组织中肿瘤细胞的凋亡显著增加，说明VB-Au纳米颗粒复合物可更有效的抑制肿瘤生长，促使肿瘤细胞的凋亡。
Claims (4)
1.毛蕊花苷-金纳米颗粒复合物在治疗人或动物白血病中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于将毛蕊花苷包被金纳米颗粒制备成毛蕊花苷-金纳米颗粒复合物。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于毛蕊花苷-金纳米颗粒复合物在制备诱导人白血病细胞K562凋亡的药物中的应用。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于毛蕊花苷-金纳米颗粒复合物在抑制人白血病恶性肿瘤生长，诱导肿瘤组织中肿瘤细胞凋亡的药物中的应用。
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