CN105056234A - 一种光热治疗肿瘤的主动靶向纳米球及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及光热治疗肿瘤的主动靶向纳米球及其制备方法与应用，有效解决现有肿瘤治疗药物副作用大、治疗效果不佳的问题，方法是，取CuCl2溶解于聚维酮溶液中，将Na2S溶解于超纯水，将CuCl2溶液和Na2S溶液合并反应，沉淀干燥成硫化铜纳米粒子，溶于含有壳聚糖的醋酸溶液中，成PVP-Cu2-xS溶液；取多西他赛溶于甲醇，加入到PVP-Cu2-xS溶液中，再加入三聚磷酸钠，沉淀为被动靶向纳米球；取叶酸加入被动靶向纳米球，再加1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，离心，除去上清液，即得主动靶向纳米球，本发明方法稳定可靠，所得产品性能稳定，使用方便，效果好，易操作，原料来源丰富，成本低，副作用小，能有效抑制肿瘤细胞的增殖。
Description
技术领域
本发明涉及医药，特别是一种光热治疗肿瘤的主动靶向纳米球及其制备方法与应用。
背景技术
肿瘤组织的病理生理特征与正常组织存在显著不同，主要表现为肿瘤部位血管渗透性强，大分子药物、载体等可通过渗透和滞留增强效应(即EPR效应)穿透血管内皮细胞进入肿瘤组织，可长时间、高浓度蓄积在肿瘤部位。纳米粒（Nanoparticles，NPs），包括纳米球和纳米囊，是将药物分子负载或包裹到纳米材料，利用纳米载体的靶向性、缓释性和肿瘤部位的EPR效应，通过静脉注射的方式将纳米粒输送到肿瘤部位，实现高效靶向治疗的目的。NPs已成为现代给药系统研究的热点，在生物医学领域具有非常大的应用前景。主动靶向给药系统是用修饰的药物载体作为“导弹”，将药物定向地运送到靶区浓集发挥药效的药物传递系统。主动靶向给药系统因其靶向性较强、毒副作用小，越来越受到医药界的重视，目前研究较多的是肿瘤靶向给药系统。
近年来提出的近红外光介导的光热治疗，能够对肿瘤组织进行定点清除并且对正常组织具有较低的毒副作用，为肿瘤的治疗提供了新的方法。最新报道的半导体硫化铜(Cu2-xS)纳米粒子，制备工艺简单、成本低廉、并且具有突出的光热稳定性和良好的生物相容性，成为了当今纳米医学领域研究的热点。
目前，通过纳米载体负载Cu2-xS纳米粒子和化疗药物，并通过肿瘤靶向分子修饰形成主动靶向药物转运系统，特别是在肿瘤热化治疗药物中的应用尚未见公开报道。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种光热治疗肿瘤的主动靶向纳米球及其制备方法与应用，可有效解决现有肿瘤治疗药物副作用大、治疗效果不佳的问题。
本发明解决的技术方案是，该主动靶向纳米球是由肿瘤靶向分子、硫化铜纳米粒子和化疗药物构成，所述的肿瘤靶向分子为叶酸；所述的硫化铜为聚维酮或柠檬酸修饰后的一种；所述的化疗药物为多西他赛（DTX），其制备方法是：
1）合成硫化铜纳米粒子：称取0.4~0.6mmoLCuCl2溶解于8~12mL浓度为0.2g/mL的聚维酮（PVP）溶液中，磁力搅拌下形成淡蓝色溶液；另将1.2~1.8mmoLNa2S溶解于8~12mL超纯水，成Na2S溶液，将淡蓝色溶液和Na2S溶液合并，180℃水浴反应12h，1200r/min离心10min，得黑绿色沉淀物，黑绿色沉淀物用40~60mL乙醇洗3次，60℃真空干燥，成硫化铜纳米粒子（PVP-Cu2-xS）；
2）制备被动靶向纳米球：称取6~9mg硫化铜纳米粒子（PVP-Cu2-xS）溶于含有壳聚糖的醋酸溶液8~12mL中，醋酸溶液质量浓度为1%，醋酸溶液中壳聚糖的含量为2mg/mL，室温搅拌1.5h，成PVP-Cu2-xS溶液；另称取4~6mg多西他赛（DTX）溶于4~6mL甲醇，加入到PVP-Cu2-xS溶液中，搅拌30min，注入3.2~4.8mL三聚磷酸钠（TPP），搅拌2.5h，400w探超40次，1200r/min离心30min，除去上清液，即成被动靶向纳米球（DTX-Cu2-xS-NPs）；
3）制备主动靶向纳米球：称取1.6~2.4mg叶酸（FA）加入4~6mL步骤（2）制备的DTX-Cu2-xS-NPs，再加入8~12mg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)，室温避光搅拌1h，得黄色纳米混悬液，1200r/min离心30min，除去上清液，即得主动靶向纳米球（FA-DTX-Cu2-xS-NPs）。
本发明制备的主动靶向纳米球（FA-DTX-Cu2-xS-NPs）有效用于光热治疗肿瘤，实现主动靶向纳米球（FA-DTX-Cu2-xS-NPs）在制备光热治疗肿瘤药物中的应用。
本发明是以肿瘤靶向分子作为靶弹头，结合硫化铜光热转换特性，实现肿瘤热化疗联合靶向治疗，有效克服了肿瘤治疗药物副作用大、治疗效果不佳的问题，方法稳定可靠，所得产品性能稳定，使用方便，效果好，易操作，原料来源丰富，成本低，副作用小，能有效抑制肿瘤细胞的增殖，是肿瘤靶向治疗中药物上的创新，经济和社会效益巨大。
附图说明
图1为本发明水溶性硫化铜光照时间-温度变化图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中，可由以下实施例给出。
实施例1
本发明在具体实施中，由以下步骤实现：
1）合成硫化铜纳米粒子：称取0.4mmoLCuCl2溶解于8mL浓度为0.2g/mL的聚维酮（PVP）溶液中，磁力搅拌下形成淡蓝色溶液；另将1.2mmoLNa2S溶解于8mL超纯水，成Na2S溶液，将淡蓝色溶液和Na2S溶液合并，置于反应釜中，180℃水浴反应12h，1200r/min离心10min，得黑绿色沉淀物，黑绿色沉淀物用40mL乙醇洗3次，60℃真空干燥，成硫化铜纳米粒子（PVP-Cu2-xS）；
2）制备被动靶向纳米球：称取6mg硫化铜纳米粒子（PVP-Cu2-xS）溶于含有壳聚糖的醋酸溶液8mL中，醋酸溶液质量浓度为1%，醋酸溶液中壳聚糖的含量为2mg/mL，室温搅拌1.5h，成PVP-Cu2-xS溶液；另称取4mg多西他赛（DTX）溶于4mL甲醇，加入到PVP-Cu2-xS溶液中，搅拌30min，注入3.2mL三聚磷酸钠（TPP），搅拌2.5h，400w探超40次，1200r/min离心30min，除去上清液，即成被动靶向纳米球（DTX-Cu2-xS-NPs）；
3）制备主动靶向纳米球：称取1.6mg叶酸（FA）加入4mL步骤（2）制备的DTX-Cu2-xS-NPs中，再加入8mg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)，室温避光搅拌1h，得黄色纳米混悬液，1200r/min离心30min，除去上清液，即得主动靶向纳米球（FA-DTX-Cu2-xS-NPs）。
实施例2
本发明在具体实施中，也可由以下步骤实现：
1）合成硫化铜纳米粒子：称取0.5mmoLCuCl2溶解于10mL浓度为0.2g/mL的聚维酮（PVP）溶液中，磁力搅拌下形成淡蓝色溶液；另将1.5mmoLNa2S溶解于10mL超纯水，成Na2S溶液，将淡蓝色溶液和Na2S溶液合并，置于反应釜中，180℃水浴反应12h，1200r/min离心10min，得黑绿色沉淀物，黑绿色沉淀物用50mL乙醇洗3次，60℃真空干燥，成硫化铜纳米粒子（PVP-Cu2-xS）；
2）制备被动靶向纳米球：称取7.5mg硫化铜纳米粒子（PVP-Cu2-xS）溶于含有壳聚糖的醋酸溶液10mL中，醋酸溶液质量浓度为1%，醋酸溶液中壳聚糖的含量为2mg/mL，室温搅拌1.5h，成PVP-Cu2-xS溶液；另称取5mg多西他赛（DTX）溶于5mL甲醇，加入到PVP-Cu2-xS溶液中，搅拌30min，注入4mL三聚磷酸钠（TPP），搅拌2.5h，400w探超40次，1200r/min离心30min，除去上清液，即成被动靶向纳米球（DTX-Cu2-xS-NPs）；
3）制备主动靶向纳米球：称取2mg叶酸（FA）加入5mL步骤（2）制备的DTX-Cu2-xS-NPs中，再加入10mg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)，室温避光搅拌1h，得黄色纳米混悬液，1200r/min离心30min，除去上清液，即得主动靶向纳米球（FA-DTX-Cu2-xS-NPs）。
实施例3
本发明在具体实施中，也可由以下步骤实现：
1）合成硫化铜纳米粒子：称取0.6mmoLCuCl2溶解于12mL浓度为0.2g/mL的聚维酮（PVP）溶液中，磁力搅拌下形成淡蓝色溶液；另将1.8mmoLNa2S溶解于12mL超纯水，成Na2S溶液，将淡蓝色溶液和Na2S溶液合并，置于反应釜中，180℃水浴反应12h，1200r/min离心10min，得黑绿色沉淀物，黑绿色沉淀物用60mL乙醇洗3次，60℃真空干燥，成硫化铜纳米粒子（PVP-Cu2-xS）；
2）制备被动靶向纳米球：称取9mg硫化铜纳米粒子（PVP-Cu2-xS）溶于含有壳聚糖的醋酸溶液12mL中，醋酸溶液质量浓度为1%，醋酸溶液中壳聚糖的含量为2mg/mL，室温搅拌1.5h，成PVP-Cu2-xS溶液；另称取6mg多西他赛（DTX）溶于6mL甲醇，加入到PVP-Cu2-xS溶液中，搅拌30min，注入4.8mL三聚磷酸钠（TPP），搅拌2.5h，400w探超40次，1200r/min离心30min，除去上清液，即成被动靶向纳米球（DTX-Cu2-xS-NPs）；
3）制备主动靶向纳米球：称取2.4mg叶酸（FA）加入6mL步骤（2）制备的DTX-Cu2-xS-NPs中，再加入12mg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)，室温避光搅拌1h，得黄色纳米混悬液，1200r/min离心30min，除去上清液，即得主动靶向纳米球（FA-DTX-Cu2-xS-NPs）。
上述制备的主动靶向纳米球（FA-DTX-Cu2-xS-NPs）可有效用于肿瘤热化疗联合靶向治疗，实现主动靶向纳米球（FA-DTX-Cu2-xS-NPs）在治疗肿瘤热化疗联合靶向药物中的应用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
本发明的主动靶向纳米球（FA-DTX-Cu2-xS-NPs）作为药物载体可以负载硫化铜和化疗药物，特别是难溶性药物，有效用于制备抗肿瘤药物，采用静脉注射给药、结合980nm近红外激光照射，实现肿瘤热化疗联合治疗。硫化铜具有光热转换特性和肿瘤靶向性的特点，结合对肿瘤部位进行激光照射，可促使药物转运系统在肿瘤部位释放药物，从而实现肿瘤热化靶向治疗的作用；本发明体物理化学稳定性良好，制备条件简单可行，原料来源丰富，成本低，副作用小，能有效抑制肿瘤细胞的增殖，是肿瘤靶向治疗药物上的创新，并经试验取得了非常满意的有益技术效果，有关试验资料如下：
一、本发明的主动靶向纳米球的理化性质考察
上述所制备的水溶性硫化铜光照时间-温度变化图（见图1），从图可知：硫化铜纳米材料在980nm激光照射下，具有明显的产热性能，可作为肿瘤热疗的热敏剂。另从硫化铜及主动靶向纳米球透射电镜照片，表明硫化铜为50nm左右的纳米晶体，且大小均匀。负载多西他赛的主动靶向纳米球的粒子大小的测定，使用Nano-ZS90型激光粒度分析仪进行，测得粒径为200-300nm。
二、本发明的主动靶向纳米球对肿瘤细胞生长的抑制活性的测定
将制得的负载多西他赛的主动靶向纳米球，加入到癌细胞中进行培养，给药后4h后用780～1100nm波长的宽波长光源或者980nm激光光照，光照时间1～5min，继续培养24h，测定癌细胞的存活率。将MCF-7乳腺癌细胞(由上海细胞库提供)用作待考察的癌细胞。具体实验如下：
将MCF-7细胞培养在含胎牛血清(FBS)10%，青链霉素混合液1%的RPMI1640培养基中，培养箱条件为37℃、5%CO2，每2～3天传代一次。收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，96孔板每孔加入200μL，铺板使待测细胞调密度至6×103个/孔，(边缘孔用无菌PBS填充)。置于5%CO2，37℃孵育24h，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入浓度梯度（0.001、0.01、0.1、1μg/mL）的实施例1中的负载多西他赛的主动靶向纳米球，设置复孔为4～6个。光照组放置在980nm近红外光2w/cm2中2min，保持光照过程中温度在37℃，光照结束后用铝箔包裹将细胞板置于CO2培养箱中孵育24h，对于无光照组而言，则直接用铝箔包裹将细胞板置于CO2培养箱中孵育24h，终止培养，吸出含药培养基，加入预冷的50%三氯乙酸（TCA）50μL，4℃放置1h。倒掉固定液，每孔用去离子水洗5遍，甩干，空气干燥。每孔加入50μL的磺酰罗丹明B（SRB）溶液，静置放置30min，未与蛋白结合的SRB用1%醋酸洗5遍，空气干燥。结合的SRB用50μL10mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）碱溶解。在515nm处测定每孔的光密度（OD）值。存活率的计算公式：存活率=实验组OD值/对照组OD值，其中实验组和对照组均为扣除空白对照组后的值。
实验证明，于980nm近红外光下照射2min，本发明药物转运系统可直接影响MCF-7细胞的增殖，光照组比不光照组细胞增殖抑制率约增加15%左右，表明本发明制备的主动靶向纳米球（FA-DTX-Cu2-xS-NPs）具有抑制肿瘤细胞的功效，有效用于光热治疗肿瘤，是治疗肿瘤药物上的一大创新，具有很强的实用价值。
Claims (6)
1.一种光热治疗肿瘤的主动靶向纳米球，该主动靶向纳米球是由肿瘤靶向分子、硫化铜纳米粒子和化疗药物构成，所述的肿瘤靶向分子为叶酸；所述的硫化铜为聚维酮或柠檬酸修饰后的一种；所述的化疗药物为多西他赛。
2.一种光热治疗肿瘤的主动靶向纳米球及其制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：
1）合成硫化铜纳米粒子：称取0.4~0.6mmoLCuCl2溶解于8~12mL浓度为0.2g/mL的聚维酮溶液中，磁力搅拌下形成淡蓝色溶液；另将1.2~1.8mmoLNa2S溶解于8~12mL超纯水，成Na2S溶液，将淡蓝色溶液和Na2S溶液合并，180℃水浴反应12h，1200r/min离心10min，得黑绿色沉淀物，黑绿色沉淀物用40~60mL乙醇洗3次，60℃真空干燥，成硫化铜纳米粒子；
2）制备被动靶向纳米球：称取6~9mg硫化铜纳米粒子溶于含有壳聚糖的醋酸溶液8~12mL中，醋酸溶液质量浓度为1%，醋酸溶液中壳聚糖的含量为2mg/mL，室温搅拌1.5h，成PVP-Cu2-xS溶液；另称取4~6mg多西他赛溶于4~6mL甲醇，加入到PVP-Cu2-xS溶液中，搅拌30min，注入3.2~4.8mL三聚磷酸钠，搅拌2.5h，400w探超40次，1200r/min离心30min，除去上清液，即成被动靶向纳米球；
3）制备主动靶向纳米球：称取1.6~2.4mg叶酸加入4~6mL步骤2）制备的DTX-Cu2-xS-NPs，再加入8~12mg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，室温避光搅拌1h，得黄色纳米混悬液，1200r/min离心30min，除去上清液，即得主动靶向纳米球。
3.根据权利要求2所述的光热治疗肿瘤的主动靶向纳米球及其制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：
1）合成硫化铜纳米粒子：称取0.4mmoLCuCl2溶解于8mL浓度为0.2g/mL的聚维酮溶液中，磁力搅拌下形成淡蓝色溶液；另将1.2mmoLNa2S溶解于8mL超纯水，成Na2S溶液，将淡蓝色溶液和Na2S溶液合并，置于反应釜中，180℃水浴反应12h，1200r/min离心10min，得黑绿色沉淀物，黑绿色沉淀物用40mL乙醇洗3次，60℃真空干燥，成硫化铜纳米粒子；
2）制备被动靶向纳米球：称取6mg硫化铜纳米粒子溶于含有壳聚糖的醋酸溶液8mL中，醋酸溶液质量浓度为1%，醋酸溶液中壳聚糖的含量为2mg/mL，室温搅拌1.5h，成PVP-Cu2-xS溶液；另称取4mg多西他赛溶于4mL甲醇，加入到PVP-Cu2-xS溶液中，搅拌30min，注入3.2mL三聚磷酸钠，搅拌2.5h，400w探超40次，1200r/min离心30min，除去上清液，即成被动靶向纳米球；
3）制备主动靶向纳米球：称取1.6mg叶酸加入4mL步骤2）制备的DTX-Cu2-xS-NPs中，再加入8mg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，室温避光搅拌1h，得黄色纳米混悬液，1200r/min离心30min，除去上清液，即得主动靶向纳米球。
4.根据权利要求2所述的光热治疗肿瘤的主动靶向纳米球及其制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：
1）合成硫化铜纳米粒子：称取0.5mmoLCuCl2溶解于10mL浓度为0.2g/mL的聚维酮溶液中，磁力搅拌下形成淡蓝色溶液；另将1.5mmoLNa2S溶解于10mL超纯水，成Na2S溶液，将淡蓝色溶液和Na2S溶液合并，置于反应釜中，180℃水浴反应12h，1200r/min离心10min，得黑绿色沉淀物，黑绿色沉淀物用50mL乙醇洗3次，60℃真空干燥，成硫化铜纳米粒子；
2）制备被动靶向纳米球：称取7.5mg硫化铜纳米粒子溶于含有壳聚糖的醋酸溶液10mL中，醋酸溶液质量浓度为1%，醋酸溶液中壳聚糖的含量为2mg/mL，室温搅拌1.5h，成PVP-Cu2-xS溶液；另称取5mg多西他赛溶于5mL甲醇，加入到PVP-Cu2-xS溶液中，搅拌30min，注入4mL三聚磷酸钠，搅拌2.5h，400w探超40次，1200r/min离心30min，除去上清液，即成被动靶向纳米球；
3）制备主动靶向纳米球：称取2mg叶酸加入5mL步骤2）制备的DTX-Cu2-xS-NPs中，再加入10mg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，室温避光搅拌1h，得黄色纳米混悬液，1200r/min离心30min，除去上清液，即得主动靶向纳米球。
5.根据权利要求2所述的光热治疗肿瘤的主动靶向纳米球及其制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：
1）合成硫化铜纳米粒子：称取0.6mmoLCuCl2溶解于12mL浓度为0.2g/mL的聚维酮溶液中，磁力搅拌下形成淡蓝色溶液；另将1.8mmoLNa2S溶解于12mL超纯水，成Na2S溶液，将淡蓝色溶液和Na2S溶液合并，置于反应釜中，180℃水浴反应12h，1200r/min离心10min，得黑绿色沉淀物，黑绿色沉淀物用60mL乙醇洗3次，60℃真空干燥，成硫化铜纳米粒子；
2）制备被动靶向纳米球：称取9mg硫化铜纳米粒子溶于含有壳聚糖的醋酸溶液12mL中，醋酸溶液质量浓度为1%，醋酸溶液中壳聚糖的含量为2mg/mL，室温搅拌1.5h，成PVP-Cu2-xS溶液；另称取6mg多西他赛溶于6mL甲醇，加入到PVP-Cu2-xS溶液中，搅拌30min，注入4.8mL三聚磷酸钠，搅拌2.5h，400w探超40次，1200r/min离心30min，除去上清液，即成被动靶向纳米球；
3）制备主动靶向纳米球：称取2.4mg叶酸加入6mL步骤2）制备的DTX-Cu2-xS-NPs中，再加入12mg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，室温避光搅拌1h，得黄色纳米混悬液，1200r/min离心30min，除去上清液，即得主动靶向纳米球。
6.权利要求1所述的主动靶向纳米球在制备光热治疗肿瘤药物中的应用。
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