CN105053829A - 冬麦种子胚芽活性多肽营养素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
冬麦种子胚芽活性多肽营养素的制备方法，涉及营养素。将冬麦浸润；将浸润后的冬麦进行低温处理；将低温处理后的冬麦破碎得细胞浆液，再用EDTA和蛋白酶K处理后保存；将EDTA和蛋白酶K处理后的细胞浆液以胚芽自己的细胞DNA/RNA为扩增的模板，增加DNA/RNA循环扩增的营养元素，设置细胞浆液在模拟的温控环境下培养，35个循环；在温度预先设置好的恒温加热器中完成，加热器放置在旋转式摇床上，得母液；将达到预期扩增时间后的母液超声波处理，离心，收集上清液，分离纯化处理，低温真空浓缩，喷雾干燥后，即得冬麦种子胚芽活性多肽营养素。不使用化学溶剂、没有化学改性、没有破坏原有成分与结构、没有任何添加剂。
Description
技术领域
本发明涉及营养素，尤其是涉及冬麦种子胚芽活性多肽营养素的制备方法，所述冬麦包括冬小麦、冬燕麦、冬裸麦等。
背景技术
春化处理，是植物(胚)感受大自然温度湿度的一种机能，许多冬性植物接受春化处理后，不仅提高了对胚乳的营养利用率、发芽率、种子活性、种子产量、抗病虫害能力，而且缩短了苗穗期，限制了主茎的顶端生长优势，促进分蘖能力，促进营养生长向生殖生长的转化；同时，提高了抵抗自然不利条件的能力，例如抗旱、抗寒、抗涝、抗高温等。此外，春花处理过的种子，可以把春花效果转移至没有春花处理的种子里，让没有严格春花处理的种子得到春花的效果。
中国专利CN1383745公开一种酪蛋白及其复合营养素，该营养素由酪蛋白、酪蛋白复合多肽、低聚糖、磷脂、微量元素、维生素和可食用的载体和/或赋形剂制成；该发明以酪蛋白为基质在其中添加具有多种生物活性的多肽,使该发明具有延缓衰老、调理肠道、抗诱变、可全面促进营养素吸收。
中国专利CN102524514A公开一种从脱脂小麦胚芽粉中提取活性多肽的方法及应用,该方法通过复合蛋白酶对脱脂小麦胚芽粉进行水解,得粗制多肽液,然后进行脱色,滤纸过滤,微滤膜过滤,纳滤膜过滤,得多肽浓缩液,再通过大孔树脂柱处理得产品。
中国专利CN102150910A公开一种小麦胚芽饮料,主要由小麦胚芽蛋白酶解制备的小分子肽、维生素E和二十八烷醇组成。制备方法：1)将小麦胚芽蛋白提纯,并经二级酶解制成小分子肽溶液；2)采用超临界CO2萃取和分子蒸馏技术,从小麦胚芽中萃取和制备维生素E；3)采用超临界CO2萃取和多重结晶技术,从小麦胚芽中萃取和制备二十八烷醇；4)加入吐温80,将维生素E和二十八烷醇制备成乳剂；将小麦胚芽的主要营养成分维生素E、二十八烷醇、小麦胚芽蛋白分离提纯,通过酶解技术制备小分子肽,将维生素E、二十八烷醇制成乳剂,按一定比例将三种营养成分重新组合,配以辅料,制备出具有抗疲劳、抗氧化、抗高血压等功能的小麦胚芽饮料。
中国专利CN101513218公开一种从小麦胚芽中提取抗氧化活性小肽营养粉的方法,其步骤为：小麦胚芽粉碎后经萃取将其中的非蛋白除去,然后加入蛋白酶和肽酶后得到小肽营养液,最后浓缩、干燥得到小肽营养粉。
中国专利CN102168124A公开一种复合酶结合碱法制备小麦胚芽活性多肽的方法。该方法以脱脂小麦胚芽为原料,首先对其进行脱糖,脱糖后离心分离；得到的固形物用复合酶对其进行水解,然后调节溶液的pH8～9进行碱提,碱提后进行离心分离；离心分离后上清液通过膜进行分离,通过最小分子量膜的液体再进行透析脱盐；各级分离物采用双效浓缩后喷雾干燥得到不同分子量的生物活性肽粉。
发明内容
本发明的目的在于提供一种冬麦种子胚芽活性多肽营养素的制备方法，所述冬麦包括冬小麦、冬燕麦、冬裸麦等。
本发明包括以下步骤：
1)将冬麦浸润；
2)将浸润后的冬麦进行低温处理；
3)将低温处理后的冬麦破碎得细胞浆液，再用EDTA和蛋白酶K处理后保存；
4)将EDTA和蛋白酶K处理后的细胞浆液以胚芽自己的细胞DNA/RNA为扩增的模板，增加DNA/RNA循环扩增的营养元素，设置细胞浆液在模拟的温控环境下培养，35个循环，每个循环温度与时间设置如下：
70℃60s；
40℃60s；
60℃180s；
在温度预先设置好的恒温加热器中完成，加热器放置在旋转式摇床上，得母液；
5)将步骤4)达到预期扩增时间后的母液超声波处理，离心，收集上清液，分离纯化处理，低温(4～18℃)真空浓缩，喷雾干燥后，即得冬麦种子胚芽活性多肽营养素，呈黄色粉状，有青麦苗与发酵特殊气味与滋味。
在步骤1)中，所述浸润可采用无菌开水浸泡24h。
在步骤2)中，所述低温处理可分两阶段进行，第一阶段的温度为0～3℃，第一阶段的处理时间为10～30h，优选24h，第二阶段的温度为7～9℃，第二阶段的处理时间为10～30h，优选24h，低温处理可循环4～6，最好5次。
在步骤3)中，所述破碎可采用匀浆机破碎，匀浆机的胶体磨细度1～7μm,1.1KW；经破碎后的细胞浆液保持原细胞结构；
所述EDTA的摩尔浓度可为0.005～0.01mol/L；所述蛋白酶K的质量浓度可为50μg/ml，蛋白酶K可用50mMTris-HCL,10mMCaCL2pH7.5缓冲液配制；
所述处理的温度可为55～65℃，处理的时间可为5～48h，所述处理的温度优选58℃，处理的时间优选36h；所述处理是将蛋白酶K与细胞浆液共同孵育，充分保护并暴露胚芽内的发芽早期DNA/RNA，蛋白酶K已经把细胞内的DNA/RNA酶灭活；
所述保存的温度可为4～8℃；该细胞匀浆包含目标活性物的DNA/RNA(编码降糖肽，谷光甘肽，丙氨酰-谷氨酰胺二肽，甘氨酰-谷氨酰胺二肽及其它容易消化的小分子肽)及其中所含的所有发芽时期胚芽内活性酶与调节因子。
在步骤4)中，所述DNA/RNA循环扩增的营养元素可采用外源镁、dNTP和TaqDNA聚合酶，所述外源镁可采用Mg++，4.5～5.5mM，摩尔用量为200μmol/L；dNTP采用1MTris-HCl缓冲液，pH7.0～7.5，摩尔用量为200μmol/L；TaqDNA聚合酶的用量为2.5万单位/10L；所述旋转式摇床的转速可为60～100r/min。
在步骤5)中，所述超声波处理的超声波功率可为450W，超声波处理的时间可为12～15min；所述分离可在4～8℃离心机8000r/m速度离心10～15min；所得冬麦种子胚芽活性多肽营养素可进行总蛋白质浓度、多肽分子量分布等参数测定；当所得母液不用于鉴别多肽分子量与氨基酸组成分析时，不再分离纯化处理。
所述冬麦种子胚芽活性多肽营养素包括：
分子量≦130，占25％；
分子量131～500，占49％；
分子量501～1000，占17％
分子量1001～2000，占6％；
分子量2001～5000，占2％；
分子量≧5001D，≦1％；
其中有：
由5～9个氨基酸组成的极容易消化吸收小麦胚芽活性肽：相对分子量500～1000Da,富含谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酰谷氨酰胺、丙氨酰谷氨酰胺片段；
由2～4个氨基酸组成的低聚肽，相对分子量131～500之间，包括具有抗氧化(消除自由基)特色谷胱甘肽(GSH)；具有降血压作用的VAL-ALA-TYR(缬氨酰-丙氨酰-酪氨酰胺)；以及单独存在的游离甘氨酰谷氨酰胺、丙氨酰谷氨酰胺。
本发明所制得的冬麦种子胚芽活性多肽营养素，具有不使用化学溶剂、没有化学改性、没有破坏原有成分与结构、没有任何添加剂(包括辅助溶剂、保鲜、防腐、抗凝、防潮、风味剂)等优点。
本发明所制得的冬麦种子胚芽活性多肽营养素，是生物活性多肽物质，是冬性种子(包括冬小麦/燕麦/裸麦)胚芽内预先存在的活性物质，与细胞外RNA编码蛋白质同源，具有感应自然变化、启动RNA翻译成蛋白质、利用胚乳营养(淀粉)，抗氧化，信号源(激素)等作用。
本发明所制得的冬麦种子胚芽活性多肽营养素可作为食品营养素，具有抗氧化、改善胰岛素抵抗、降低异常高血糖等作用；保存了种子发芽期所有生物活性物质，包括维生素，酶，多肽等。
具体实施方式
以下实施例将对本发明作进一步的说明。
本发明实施例包括以下步骤：
1)将公斤级冬麦浸润；所述浸润可采用烧开无菌水浸泡即浸润24h。
2)将浸润后的冬麦进行低温处理，所述低温处理分两阶段进行，第一阶段的温度为0～3℃，第一阶段的处理时间为10～30h，优选24h，第二阶段的温度为7～9℃，第二阶段的处理时间为10～30h，优选24h，低温处理可循环4～6，最好5次；
3)将低温处理后的冬麦用匀浆机(胶体磨，细度1～7μm,1.1KW)破碎，保持原细胞结构，EDTA(0.005～0.01mol/L)和蛋白酶K处理该细胞浆液，(蛋白酶K的浓度50μg/ml，用50mMTris-HCL,10mMCaCL2pH7.5缓冲液配制)，蛋白酶K与胚芽细胞浆液共同孵育在温度55～65℃，(最理想温度58℃)；孵育时间5～48h，最佳孵育时间36h；充分保护并暴露胚芽内的发芽早期DNA/RNA。蛋白酶K已经把细胞内的DNA/RNA酶灭活。
在4～8℃保存以上匀浆，该细胞匀浆包含目标活性物的DNA/RNA(编码降糖肽，谷光甘肽，丙氨酰-谷氨酰胺二肽，甘氨酰-谷氨酰胺二肽及其它容易消化的小分子肽)及其中所含的所有发芽时期胚芽内活性酶与调节因子。
4)母液细胞匀浆原位扩增(类似PCR扩增)：模仿离体临床PCR，给母液胚芽细胞浆液系统提供DNA/RNA循环扩增的营养元素及条件，以胚芽自己的细胞DNA/RNA为扩增的模板，增加外源镁(Mg++4.5～5.5mM,200μmol/L)、dNTP(200μmol/L，用1MTris-HCl缓冲液调节pH7.0～7.5)和TaqDNA聚合酶(2.5万单位/10L)，设置细胞浆液在模拟的温控环境下培养，35个循环，每个循环温度与时间设置：
70℃60s；
40℃60s；
60℃180s；
在温度预先设置好的恒温加热器中完成，加热器放置在旋转式摇床上(60～100r/min)。
5)收集与鉴别母液中活性物；达到预期的扩增时间，母液用450W超声波处理12～15min，在4～8℃离心机8000r/min速度离心10～15min，收集上清液，进行总蛋白质浓度、多肽分子量分布等测定。
如果不是用来鉴别多肽分子量与氨基酸组成分析，就不再分离纯化处理。
以上母液冬麦种子胚芽活性多肽营养素包括：
分子量≦130，占25％；
分子量131～500，占49％；
分子量501～1000，占17％
分子量1001～2000，占6％；
分子量2001～5000，占2％；
分子量≧5001D，≦1％；
其中有：
由5～9个氨基酸组成的极容易消化吸收小麦胚芽活性肽：相对分子量500～1000Da,富含谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酰谷氨酰胺、丙氨酰谷氨酰胺片段；
由2～4个氨基酸组成的低聚肽，相对分子量131～500之间，包括具有抗氧化(消除自由基)特色谷胱甘肽(GSH)；具有降血压作用的VAL-ALA-TYR(缬氨酰-丙氨酰-酪氨酰胺)；以及单独存在的游离甘氨酰谷氨酰胺、丙氨酰谷氨酰胺；
以上母液经过低温(4～18℃)真空浓缩，喷雾干燥，得到黄色粉状，有青麦苗与发酵特殊气味与滋味。
6、母液处理低温吸胀小麦种子
大批量的种子，只要10～15℃吸胀后，用1％～3％以上母液处理48～72h，免除超大型冷冻设备和繁琐的春花过程，就可以得到部分春花的结果，总蛋白质浓度、活性多肽含量、小分子量物质占的比例、酶的活性等等都得到提高。由此类似半发酵加工成的营养产品，营养成分提高了，营养食疗的效果得到充分强化。以下是经过处理和未经过母液处理的吸胀发芽小麦种子(100g)的营养成分对比。
表1
从表1的对照可以看出，春花处理后发芽的种子所含的活性成分，有显著提高含量，尤其是活性多肽和蛋白质含量。显然，为了胚芽的生长，种子准备了所有细胞分裂生命活动所需要的一切材料。尤其是酶、调节系统、指挥细胞繁殖与分化的信号、激素、能量来源和细胞结构材料来源等等。
经过以上简化的春花处理种子，发芽5天，就可以磨浆机打碎/超声波粉碎，磨浆(胶体磨)，超声波(粉碎机)灭菌，喷雾干燥，包装成品，金属探测，检验入库。
超声波灭菌利用驰飞50W超声波粉碎机，与JML-80胶体磨配合使用，具有搅拌机、清洗机功能。驰飞超声波粉碎机功率50W,工作频率40KHZ，灭菌温度45～50℃，作用时间10～15min，可以在胶体磨进料口与出料空同时安装二套。利用超声波的空化作用、热作用、胶体磨的机械剪切作用等，可以在比较低温条件下，很短时间内破坏微生物细胞，还能对胚芽细胞进行破碎、均质、裂解大分子营养物质，从而更好的提高和保存胚芽营养品质。
本发明所制得的冬麦种子胚芽活性多肽营养素，不使用化学溶剂，没有化学改性，没有破坏原有成分与结构，没有任何添加剂(包括辅助溶剂、保鲜、防腐、抗凝、防潮、风味剂)
成品的理化指标：
水分：≦7.0
蛋白质：≧35％
低聚肽占蛋白质的：≧65％
碳水化合物：≦40％
脂肪酸：≦6.5％
砷(以As计)≦0.3mg/kg
铅(以Pb计)≦0.5mg/kg
卫生指标：
菌落总数CUF/g≦30000
大肠菌群MPN/100g≦40
致病菌不得检出
霉菌CFU/g≦25
酵母菌CFU/g≦25
本发明所制得的冬麦种子胚芽活性多肽营养素，是生物活性多肽物质，是冬性种子(冬小麦/燕麦/裸麦)胚芽内预先存在的活性物质，与细胞外RNA编码蛋白质同源，具有感应自然变化、启动RNA翻译成蛋白质、利用胚乳营养(淀粉)，抗氧化，信号源(激素)等作用；作为食品营养素，具有抗氧化、改善胰岛素抵抗、降低异常高血糖等作用；保存了种子发芽期所有生物活性物质，包括维生素，酶，多肽等。
以下给出所制备的冬麦种子胚芽活性多肽营养素使用案例：
例1李**先生的调理案例(调理高血糖高血脂)
李**先生，漳州退休干部，60岁，调理前体检结果：空腹血糖10.66，服二甲双胍等3种降糖药，血糖控制不理想；总胆固醇5.79，甘油三酯4.62，均高于正常值。
调理一个月后再次体检，结果如下：空腹血糖4.36(停药)，总胆固醇3.51，甘油三酯0.67，都达到正常范围。
例2：李**调理肥胖及高尿酸
李**，男，23岁，龙岩人，调理前体检结果：体重121.2kg,尿酸639μmol/l。
调理38天，调理结束后一个月再次体检，结果如下：体重98kg；尿酸442μmol/l。
Claims (10)
1.冬麦种子胚芽活性多肽营养素的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将冬麦浸润；
2)将浸润后的冬麦进行低温处理；
3)将低温处理后的冬麦破碎得细胞浆液，再用EDTA和蛋白酶K处理后保存；
4)将EDTA和蛋白酶K处理后的细胞浆液以胚芽自己的细胞DNA/RNA为扩增的模板，增加DNA/RNA循环扩增的营养元素，设置细胞浆液在模拟的温控环境下培养，35个循环，每个循环温度与时间设置如下：
70℃60s；
40℃60s；
60℃180s；
在温度预先设置好的恒温加热器中完成，加热器放置在旋转式摇床上，得母液；
5)将步骤4)达到预期扩增时间后的母液超声波处理，离心，收集上清液，分离纯化处理，4～18℃下真空浓缩，喷雾干燥后，即得冬麦种子胚芽活性多肽营养素，呈黄色粉状，有青麦苗与发酵特殊气味与滋味。
2.如权利要求1所述冬麦种子胚芽活性多肽营养素的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述冬麦包括但不限于冬小麦、冬燕麦、冬裸麦。
3.如权利要求1所述冬麦种子胚芽活性多肽营养素的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述浸润采用无菌开水浸泡24h。
4.如权利要求1所述冬麦种子胚芽活性多肽营养素的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述低温处理分两阶段进行，第一阶段的温度为0～3℃，第一阶段的处理时间为10～30h，第二阶段的温度为7～9℃，第二阶段的处理时间为10～30h，低温处理循环4～6；所述第一阶段的处理时间优选24h，第二阶段的处理时间优选24h，低温处理循环优选5次。
5.如权利要求1所述冬麦种子胚芽活性多肽营养素的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述破碎是采用匀浆机破碎，匀浆机的胶体磨细度1～7μm,1.1KW。
6.如权利要求1所述冬麦种子胚芽活性多肽营养素的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述EDTA的摩尔浓度为0.005～0.01mol/L；所述蛋白酶K的质量浓度为50μg/ml，蛋白酶K用50mMTris-HCL,10mMCaCL2pH7.5缓冲液配制。
7.如权利要求1所述冬麦种子胚芽活性多肽营养素的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述处理的温度为55～65℃，处理的时间为5～48h，所述处理的温度优选58℃，处理的时间优选36h；所述处理是将蛋白酶K与细胞浆液共同孵育，充分保护并暴露胚芽内的发芽早期DNA/RNA，蛋白酶K已经把细胞内的DNA/RNA酶灭活；所述保存的温度可为4～8℃。
8.如权利要求1所述冬麦种子胚芽活性多肽营养素的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述DNA/RNA循环扩增的营养元素采用外源镁、dNTP和TaqDNA聚合酶；所述旋转式摇床的转速可为60～100r/min。
9.如权利要求8所述冬麦种子胚芽活性多肽营养素的制备方法，其特征在于所述外源镁采用Mg++，4.5～5.5mM，摩尔用量为200μmol/L；dNTP采用1MTris-HCl缓冲液，pH7.0～7.5，摩尔用量为200μmol/L；TaqDNA聚合酶的用量为2.5万单位/10L。
10.如权利要求1所述冬麦种子胚芽活性多肽营养素的制备方法，其特征在于在步骤5)中，所述超声波处理的超声波功率为450W，超声波处理的时间为12～15min；所述分离可在4～8℃离心机8000r/m速度离心10～15min。
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20170704 Address after: The Lake District of Xiamen City, Fujian province 361000 Luling Road No. 15 room 1104 Applicant after: Lian Jiping Applicant after: Zeng Qinggui Address before: 361100 Fujian city of Xiamen province Tong'an District Zhongzhou Binhai City 47 building room 2003 Applicant before: Zeng Qingyun |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20151118 |