CN105053524A - 菜籽粕微生物发酵饲料及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种菜籽粕微生物发酵饲料及其制备方法和应用，其中菜籽粕微生物发酵饲料以菜籽粕为发酵原料，通过纳豆芽孢杆菌和鼠李糖乳杆菌发酵制备得到；制备方法为：将纳豆芽孢杆菌培养成纳豆芽孢杆菌菌液；将鼠李糖乳杆菌培养成鼠李糖乳杆菌菌液；将菜籽粕与水混合制成发酵原料，在发酵原料中接入纳豆芽孢杆菌进行发酵48小时；然后接入鼠李糖乳杆菌继续发酵至96小时。本发明利用混合微生物发酵法制备菜籽粕微生物发酵饲料，菜籽粕原料来源广泛，饲料营养保健特性，改善禽畜生长性能，可应用于为动物饲料。

Description

菜籽粕微生物发酵饲料及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种菜籽粕微生物发酵饲料及其制备方法和应用。

背景技术

随着生活水平的提高，膳食结构改变巨大，人们对肉蛋奶的消费逐年增加。中国作为全世界禽畜养殖大国，人工养殖比例逐年提高，对饲料的需求不断增加。而全球范围内资源的衰减，以及现代畜牧业和饲料工业的快速发展等各方面的综合作用，导致世界性的鱼粉、豆粕等主要的蛋白质饲料资源紧缺和价格上涨，给饲料工业带来了严峻的挑战。大力开发新型高效环保绿色饲料具有重要的社会意义和经济效益。

菜籽粕营养价值高，富含蛋白质和氨基酸，是一种来源广且稳定相对廉价的蛋白质饲料资源，利用菜籽粕开发新型的微生物发酵饲料，使其不仅能够降低抗营养因子而作为饲料满足动物的生存需求，而且能够成为一种低成本、维护动物的机体健康且提高动物生长性能的具有保健功效的添加剂，可以极大地提高菜籽粕的利用价值和经济效益，对动物营养保健方面展现出了广阔的发展前景。但是如果将菜籽粕直接应用在饲料中会一定程度上存在着氨基酸不平衡、含有有毒物质和抗营养因子危害禽畜健康、降低饲料适口性等问题，影响禽畜对其消化吸收利用，降低养殖的生产效益。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种营养保健，改善禽畜生长性能，提高饲料适口性的的菜籽粕微生物发酵饲料，还提供了该菜籽粕微生物发酵饲料的制备方法和在提高动物生长性能方面的应用，该制备方法非常适合应用于现代化饲料产业中。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种菜籽粕微生物发酵饲料，所述菜籽粕微生物发酵饲料以菜籽粕为发酵原料，通过纳豆芽孢杆菌和鼠李糖乳杆菌发酵制备得到。

上述的菜籽粕微生物发酵饲料，优选的，所述纳豆芽孢杆菌为纳豆芽孢杆菌(Bacillusnatto)L08，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.5769。

上述的菜籽粕微生物发酵饲料，优选的，所述鼠李糖乳杆菌为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)Lr.M8，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.3002。

作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述菜籽粕微生物发酵饲料的制备方法，包括以下步骤：

S1、将纳豆芽孢杆菌培养成纳豆芽孢杆菌菌液；

S2、将鼠李糖乳杆菌培养成鼠李糖乳杆菌菌液；

S3、将菜籽粕与水混合制成发酵原料，在所述发酵原料中接入步骤S1制备得到的纳豆芽孢杆菌菌液进行发酵48小时；然后接入步骤S2制备得到的鼠李糖乳杆菌菌液继续发酵至96小时。

上述的制备方法，优选的，所述步骤S1具体为：将纳豆芽孢杆菌以0.5g/100mL～1g/100mL的接种量接种于芽孢杆菌富集液体培养基中，以36℃～38℃振荡培养16小时，震荡速度为120r/min～180r/min。

上述的制备方法，优选的，所述步骤S2具体为：将纳豆芽孢杆菌以0.5g/100mL～1.2g/100mL的接种量接种于MRS液体培养基中，以32℃～38℃培养18小时。

上述的制备方法，优选的，所述步骤S3中，所述纳豆芽孢杆菌菌液的接种量为1wt％～1.5wt％；所述鼠李糖乳杆菌菌液的接种量为1wt％～1.5wt％。

作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述菜籽粕微生物发酵饲料或上述制备方法制备得到的微生物发酵饲料做为动物饲料中的应用。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)本发明提供了一种菜籽粕微生物发酵饲料，利用混合微生物发酵法，先接种纳豆芽孢杆菌，再接入鼠李糖乳杆菌，能够充分利用菌种的优势使得菜籽粕的营养物质产量得到最大化，营养保健功效多样且成本低廉，能够提高动物的生长特性；同时采用原料为菜籽粕，资源丰富且成本低廉，非常适合现代化饲料产业。

(2)目前，对菜籽粕的微生物发酵主要集中在以脱毒或者单纯提高蛋白含量为主；使其在作为饲料应用方面功效较单一；本发明的菜籽粕微生物发酵饲料不仅具有脱毒、提高蛋白质的含量的功效，还能够使其具有溶血栓，抗氧化等保健功效，对动物的生长发育极具优势。

(3)本发明提供了一种菜籽粕微生物发酵饲料的制备方法，采用吸水性良好的菜籽粕为原料，含有多种氨基酸等营养物质，可以得到富含高益生菌活菌含量的菜籽粕微生物发酵饲料，丰富的活菌能够在动物的肠道发挥益生功效，达到对动物的保健效果。

纳豆芽孢杆菌(Bacillusnatto)L08，于2012年2月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCCNo.5769。

鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)Lr.M8，于2009年4月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCCNo.3002。

附图说明

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。

图1为菜籽粕发酵前后蛋白质种类和含量变化的SDS-PAGE电泳检测图。

图2为不同的接种方法对发酵菜籽粕中纳豆激酶活力的影响的结果图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。

实施例

以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。

实施例1：

本发明的一种菜籽粕微生物发酵饲料，其制备方法具体包括以下步骤：

S1、将纳豆芽孢杆菌培养成纳豆芽孢杆菌菌液：将纳豆芽孢杆菌以1g/100mL的接种量接种于芽孢杆菌富集液体培养基中(芽孢杆菌富集液体培养基的成分:蛋白胨10g、牛肉粉3g、氯化钠5g，pH7.3)，以37℃振荡培养16个小时，震荡速度为120r/min。在步骤S1中，纳豆芽孢杆菌为纳豆芽孢杆菌(Bacillusnatto)L08，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.5769。

纳豆芽孢杆菌(Bacillusnatto)L08属于革兰氏阳性，大小为0.7μm～0.8μm×2.0μm～3.0μm，芽孢椭圆形或柱状，中生或偏中生，有鞭毛，能运动；在营养琼芝培养基上生长2天后，菌落为圆形，直径约为3mm左右，边缘不整齐，突起；生长温度最高为45℃～55℃，最低为5℃～20℃。

S2、将鼠李糖乳杆菌培养成鼠李糖乳杆菌菌液：将纳豆芽孢杆菌以1.0g/100mL的接种量接种于MRS液体培养基(MRS液体培养基的成分：酪蛋白胨10.0克、牛肉浸取物10.0克、酵母提取液5.0克、葡萄糖5.0克、乙酸钠5.0克、柠檬酸二胺2.0克、吐温801.0克、磷酸氢二钾2.0克、七水硫酸镁0.2克、七水硫酸锰0.05克、碳酸钙20.0克、蒸馏水1.0升，pH6.8)中，以37℃培养18个小时。在步骤S2中，鼠李糖乳杆菌为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)Lr.M8，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.3002。

鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)Lr.M8为G+，大小为0.7μm～1.1μmX2.0μm～3.8μm，链状，无鞭毛与纤毛，不会移动，在MRS培养基上，培养3天后可形成2～4毫米直径的菌落，菌落呈奶油白色，不透明，边缘整齐，突起，表面湿润。最适生长温度为30-42℃，最高生长温度为50℃。

S3、制备微生物发酵饲料：

S3-1：取30g粉碎过40目筛的菜籽粕，置于500mL的三角瓶中，加入31.5mL蒸馏水，搅拌均匀密封灭菌15min。待冷却后打散至质地蓬松制成发酵原料。

S3-2：在发酵原料中接入1.53wt％的纳豆芽孢杆菌进行发酵48小时；然后接入1.53wt％的鼠李糖乳杆菌，搅拌均匀后置于36.86℃下继续发酵至96小时，完成菜籽粕微生物发酵饲料的制备。

实施例2

本发明的一种菜籽粕微生物发酵饲料，其制备方法具体包括以下步骤：

S1、将纳豆芽孢杆菌培养成纳豆芽孢杆菌菌液：将纳豆芽孢杆菌以1g/100mL的接种量接种于芽孢杆菌富集液体培养基中，以37℃振荡培养16小时，震荡速度为120r/min。本实施例步骤S1中的纳豆芽孢杆菌与实施例1相同。

S2、将鼠李糖乳杆菌培养成鼠李糖乳杆菌菌液：将纳豆芽孢杆菌以1.2g/100mL的接种量接种于MRS液体培养基中，以37℃培养18小时。本实施例步骤S2中的鼠李糖乳杆菌与实施例1相同。

S3、制备微生物发酵饲料：

S3-1：取30g粉碎过40目筛的菜籽粕、0.6g麸皮置于500mL的三角瓶中，加入32mL蒸馏水，搅拌均匀密封灭菌15min。待冷却后打散至质地蓬松制成发酵原料。

S3-2：在发酵原料中接入1.5wt％的纳豆芽孢杆菌进行发酵48小时；然后接入1.5wt％的鼠李糖乳杆菌，搅拌均匀后置于37℃下继续发酵至96小时，完成菜籽粕微生物发酵饲料的制备。

对比例1

未经发酵处理的菜籽粕。

考察菜籽粕发酵过程中蛋白质成分及含量的变化：

按照实施例1的方法，将菜籽粕进行发酵，分别于第第0d、1d、2d、3d、4d进行SDS-PAGE电泳检测。其中发酵0d的菜籽粕为未发酵的菜籽粕；发酵1d的菜籽粕和发酵2d的菜籽粕为接种了纳豆芽孢杆菌进行发酵的菜籽粕；发酵3d的菜籽粕和发酵4d的菜籽粕为接种了纳豆芽孢杆菌和鼠李糖乳杆菌进行发酵的菜籽粕。

检测结果参见图1，其中，M为蛋白质标准，A为发酵前菜籽粕，B为发酵1d的菜籽粕，C为发酵2d后的菜籽粕，D为发酵3d后的菜籽粕，E为发酵4d的菜籽粕。

从图1中可以看出：未发酵的菜籽粕蛋白的分子量集中在10～35kDa，在发酵的1d时，由于菌株还处于适应期，微生物刚开始利用菜籽粕中的营养物质生长，其中大分子量的蛋白质浓度变化不大，而10kDa的小分子蛋白浓度有所提高；第2d开始，蛋白质条带颜色明显加深，证明微生物经发酵用降解了一定菜籽的大分子蛋白；同时随着发酵时间的增长，蛋白质条带的尾部出现的涣散现象也越发明显，这证明了微生物发酵后的菜籽粕中小肽的含量有明显增长。当到达第4d发酵末期时，菜籽粕中总蛋白的浓度不再增加，而大分子的蛋白质基本已被降解为10KDa以下的小肽，虽然在发酵过程中原菜籽粕里的大分子蛋白含量并不高，也没有明显降为小分子蛋白的趋势，但整体蛋白浓度有较明显的提升，而小肽类的含量增加明显，可视为菜籽小肽含量升高，发酵效果明显。

考察菜籽粕发酵前后氨基酸组成的变化：

分别检测实施例1的菜籽粕微生物发酵饲料和对比例1中未经发酵的菜籽粕中氨基酸含量的变化，检测结果参见表1。

表1：菜籽粕发酵前后氨基酸组成的变化结果表(g/100g)

ND：未检测

从表1中各氨基酸的含量可知：菜籽粕经发酵后，各种氨基酸的含量均有较大程度的增加，证明采用本发明的方法对菜籽粕进行发酵，可显著提高菜籽粕中氨基酸的含量。

实施例3

取20g粉碎过40目筛的菜籽粕置于300mL的三角瓶中，加入32mL蒸馏水，搅拌均匀密封灭菌15min；待冷却后打散至质地蓬松制成发酵原料。将发酵原料分别按照以下三种方式进行发酵：

A：在发酵原料中同时接入1wt％的纳豆芽孢杆菌和1wt％的鼠李糖乳杆菌，搅拌均匀后置于37℃下继续发酵至96小时，完成菜籽粕微生物发酵饲料的制备。

B：在发酵原料中接入1wt％的纳豆芽孢杆菌进行发酵48小时；然后接入1wt％的鼠李糖乳杆菌，搅拌均匀后置于37℃下继续发酵至96小时，完成菜籽粕微生物发酵饲料的制备。

C：在发酵原料中接入1wt％的鼠李糖乳杆菌进行发酵48小时；然后接入1wt％的纳豆芽孢杆菌，搅拌均匀后置于37℃下继续发酵至96小时，完成菜籽粕微生物发酵饲料的制备。

考察A、B、C三种接种方式对发酵菜籽粕中纳豆激酶活力的影响：

分别将A、B、C三种接种方式制备得到的菜籽粕微生物发酵饲料点样于平板培养基中，查看平板培养基中透明圈的情况，考察结果参见图2。

从图2中可知：采用B的接种方式制备菜籽粕微生物发酵饲料，纳豆激酶活力最强。

分别考察察A、B、C三种接种方式对发酵菜籽粕中有益菌数的影响，考察结果列于表2中。

表2：接种方式对发酵菜籽粕中有益菌菌数的影响结果表

从表2中可知：采用B的接种方式制备菜籽粕微生物发酵饲料，纳豆芽孢杆菌和短乳杆菌M8的菌数明显高于A和C的接种方式。

实施例4

一种实施例1、2的菜籽粕微生物发酵饲料和对比例1的菜籽粕在做为动物饲料中的应用，具体的应用方法为：

分别取30g实施例1的菜籽粕微生物发酵饲料、30g实施例2的菜籽粕微生物发酵饲料、30g对比例1的菜籽粕，在每一份原料中加入300mL蒸馏水，浸提45min，浸提过程中每15min搅拌一次，纱布粗过滤，收集粗滤液；滤渣再次用300mL蒸馏水浸提45min，浸提过程中每15min搅拌一次，纱布过滤，收集粗滤液，与上一次收集的粗滤液合并。将收集的粗滤液用滤纸抽滤，收取600mL上清液。

利用旋转蒸发仪浓缩上清液至1/10得到浓缩液，将浓缩液于-40℃下冷冻干燥后4h得干粉，将干粉于-20℃密封保存。

将上述干粉配成浓度为50mg/L溶液，用0.22μm的滤菌膜抽滤除菌后直接添至秀丽线虫的食物E.coliOP50菌液中，按照1∶9的比例涂布于NGM培养基中。将秀丽线虫随机分为3组，每组秀丽线虫不低于30条，考察实施例1、2的菜籽粕微生物发酵饲料和对比例1的菜籽粕对秀丽隐杆线虫生理指标的影响，试验结果如表3所示。

表3：各实施例的饲料喂食秀丽隐杆线虫后的生理指标评价表

从表3中可知：实施例1和实施例2的菜籽粕微生物发酵饲料相比于对比例1中未经发酵的菜籽粕，能显著提高食秀丽隐杆线虫的寿命、产卵数以及生长性能。

综上所述：本发明利用简单原料菜籽粕，选用两株特定菌种采取分步发酵的复配方法，发挥各菌的优势与协同作用，通过提高菜籽粕中纳豆激酶活力、益生菌活菌数、菜籽小肽和氨基酸的含量来提高菜籽粕的营养价值、增加保健功效等多种益生功能来提高动物对其的吸收利用，达到促进机体保持健康，提高动物生长性能从而提升动物的生产性能。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims (8)

1.一种菜籽粕微生物发酵饲料，其特征在于，所述菜籽粕微生物发酵饲料以菜籽粕为发酵原料，通过纳豆芽孢杆菌和鼠李糖乳杆菌发酵制备得到。

2.根据权利要求1所述的菜籽粕微生物发酵饲料，其特征在于，所述纳豆芽孢杆菌为纳豆芽孢杆菌(Bacillusnatto)L08，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.5769。

3.根据权利要求1所述的菜籽粕微生物发酵饲料，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)Lr.M8，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.3002。

4.一种权利要求1至3中任一项所述菜籽粕微生物发酵饲料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将纳豆芽孢杆菌培养成纳豆芽孢杆菌菌液；

S2、将鼠李糖乳杆菌培养成鼠李糖乳杆菌菌液；

S3、将菜籽粕与水混合制成发酵原料，在所述发酵原料中接入步骤S1制备得到的纳豆芽孢杆菌菌液进行发酵48小时；然后接入步骤S2制备得到的鼠李糖乳杆菌菌液继续发酵至96小时。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1具体为：将纳豆芽孢杆菌以0.5g/100mL～1g/100mL的接种量接种于芽孢杆菌富集液体培养基中，以36℃～38℃振荡培养16小时，震荡速度为120r/min～180r/min。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2具体为：将纳豆芽孢杆菌以0.5g/100mL～1.2g/100mL的接种量接种于MRS液体培养基中，以32℃～38℃培养18小时。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述纳豆芽孢杆菌菌液的接种量为1wt％～1.53wt％；所述鼠李糖乳杆菌菌液的接种量为1wt％～1.53wt％。

8.一种权利要求1至3中任一项所述菜籽粕微生物发酵饲料或权利要求4至7中任一项所述制备方法制备得到的微生物发酵饲料做为动物饲料中的应用。