CN105051539A - 用于使用发光检测生物分子的方法和试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含至少两个不同尺寸的金属原子量子簇(AQC)之电荷转移复合物和生物素结合分子(优选链霉亲和素)的发光复合物及其用于检测生物素化化合物的用途。本发明还涉及包含AQC的电荷转移复合物和生物分子的缀合物的用途及其用于基于AQC纳米系统的发光性能检测样品中生物分子的结合伴侣的用途。
Description
技术领域
本发明涉及用于使用与金属原子量子簇(atomicquantumcluster,AQC)之电荷转移复合物(charge-transfercomplex)偶联的目的生物分子的结合伴侣检测生物分子的方法和试剂。本发明还涉及使用金属原子量子簇之电荷转移复合物和生物素化分子的竞争性结合测定。
背景技术
荧光染料与生物分子如多核苷酸、蛋白质、脂质等的缀合可用于检测、分离和/或鉴定生物分子。这种缀合物通常来源于染料与能够结合给定靶标或结合伴侣之试剂的结合。对于旨在用作检测蛋白质或核酸之标记(marker)的染料来说,有多种性质可能是期望的。这些可包括在不影响其周围基质的情况下被激发的能力、容易检测、高量子产量、对于培养基的适应性、稳定性、长平均寿命、无毒性、荧光参数随时间的再现性以及允许染料与核苷酸或其他期望靶标连接的反应性基团的存在。
今天,仅有的已知具有大于200nm的巨大斯托克斯位移和超过1微秒的慢衰减时间的一些荧光系统是基于稀土离子的。但是,它们表现出多种缺点,例如:难以在不损失其荧光特性的情况下将其引入到基质中;存在对应于每一种稀土的固定且特定的激发、发射和斯托克斯位移特性,因此不易改变,并且它们是昂贵且稀有的材料。这些系统的实例描述在以下文献中:Sardar,D.K.等,Biophotonics,January2008;Resch-Genger,U.,AdvancedFluorescenceReportersinChemisrtyandBiologyIISpringerSeriesonFluorescence,2010,第9卷,第1部分,3-40;HarmaH.等,AnalyticalChemistry,2005,77,2643-2648;US7465747B2;US2010/0224831A1和US4283382。
因此,有必要使荧光染料与生物分子缀合,这可用作发光探针并且克服了基于稀土元素的含染料之缀合物的这些缺点。
发明内容
本发明的作者惊奇地发现,AQC的电荷转移复合物与链霉亲和素相互作用导致其荧光发射强度增加,并且该作用可在生物素或生物素结合分子的存在下逆转。不希望受到任何理论的约束,认为AQC的电荷转移复合物与链霉亲和素的相互作用导致AQC的构象改变,这导致强度增加,并且认为AQC的电荷转移复合物与链霉亲和素通过生物素结合口袋(biotin-bindingpocket)相互作用,由于生物素对链霉亲和素更高的亲和力导致该相互作用在生物素或生物素结合分子的存在下被逆转。
由于AQC包含金属过渡元素,这些可选自在以非常低的浓度存在时无毒的那些,例如Au或Ag。此外,这些元素极大的天然丰度使得这成为一种完全可持续的方法。此外,AQC和包含所述AQC的复合物表现出以下优点:
-在自然光和室温下储存至少1年的时期稳定而不失去其性质,
-在3至10的pH范围下稳定,
-可被浓缩直至干而不失去其荧光性能,即使以干燥的形式,
-一旦干燥,可再溶解而不失去其荧光性能,并且还
-在比基于稀土元素的发光系统所使用浓度低的浓度下使用。
该观察允许在链霉亲和素或生物素结合分子的存在下使用AQC的电荷转移复合物检测生物素或生物素化分子。
因此,在第一个方面,本发明涉及复合物,其包含生物素结合分子和通式(I)的至少两个不同尺寸的金属原子量子簇(AQC)Mn和M’n’的电荷转移复合物:
Mn +M’n′ -(I),
其中
金属AQC的金属M和M’是相同金属或不同金属,
Mn是以其氧化形式Mn +存在的较小AQC,
M’n’是以其还原形式M’n’ -存在的较大AQC,
Mn +和M’n’ -通过静电相互作用结合,
n和n′分别为M和M’的金属原子数目,并且
n小于n′,
其中所述生物素结合分子与所述电荷转移复合物不共价结合。
在另一个方面,本发明涉及成套试剂盒(kit-of-parts),其包含一起的或分开的:
(i)至少两个不同尺寸的金属原子量子簇(AQC)Mn和M’n’的电荷转移复合物,其中所述电荷转移复合物具有权利要求1限定的式I,并且其中所述金属AQC的M和M’是相同金属或不同金属,Mn是以其氧化形式Mn +存在的较小AQC,M’n’是以其还原形式M’n’ -存在的较大AQC,Mn +和M’n’ -通过静电相互作用结合,n和n′分别为金属原子的数目,以及
(ii)生物素结合分子。
在另一个方面,本发明涉及用于检测样品中的生物素化分子的方法,其包括以下步骤:
(i)使所述样品与根据本发明的复合物在足以使生物素化分子与复合物中的生物素结合分子结合的条件下接触,以及
(ii)检测在步骤(i)的所述接触之后在CTC的激发波长下响应于所述样品之激发的所述CTC的荧光发射强度的变化,
其中接触步骤后CTC发射的荧光强度的降低指示样品中存在生物素化分子。
在另一个方面,本发明涉及缀合物,其包含生物分子和通式(I)的至少两个不同尺寸的金属AQCMn和M’n’的电荷转移复合物:
Mn +M’n′ -(I),
其中
金属AQC的金属M和M’是相同金属或不同金属,
Mn是以其氧化形式Mn +存在的较小AQC,
M’n’是以其还原形式M’n’ -存在的较大AQC,
Mn +和M’n’ -通过静电相互作用结合,
n和n′分别为M和M’的金属原子数目,并且
n小于n′,
其中所述缀合物还包含与所述原子量子簇M和M’连接的ω-羟基酸配体和ω-巯基酸配体,其中所述生物分子与所述ω-羟基酸配体和/或所述ω-巯基酸配体连接。
在一些方面中,本发明涉及根据本发明的缀合物,其用于检测样品中的生物分子或用于检测细胞内组分。
附图简述
图1示出了在存在链霉亲和素并且(A)不存在生物素化分子、(B)存在0.1mmol生物素化寡核苷酸和(C)存在0.5mmol生物素化寡核苷酸的情况下的AQC-CTC的发射光谱。
图2示出了在存在链霉亲和素和HABA并且(A)不存在生物素化寡核苷酸和(B)存在生物素化寡核苷酸的情况下的AQC-CTC的发射光谱。
术语定义
本文中使用的术语“抗体”指免疫球蛋白分子以及免疫球蛋白分子的免疫活性部分,即,包含与抗原特异性结合(“与其免疫反应”)的抗原结合位点的分子。非限制性实例包括抗体、抗体片段、重组抗体、非人抗体、嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。在结构上,最简单的天然存在抗体(例如,IgG)包含4条多肽链,即通过二硫键相互连接的两条重(H)链和两条轻(L)链。免疫球蛋白代表一个大的分子家族,其包括若干类分子,例如IgD、IgG、IgA、IgM和IgE。术语“免疫球蛋白分子”包括例如杂合抗体或经修饰抗体(alteredantibody)及其片段。已表明,抗体的抗原结合功能可由天然存在抗体的片段来执行。这些片段统称为“抗原结合单位”。抗原结合单位基于其分子结构可广泛分为“单链”(“Sc”)和“非单链”(“Nsc”)类型。术语“抗体”还涵盖多种物种起源的免疫球蛋白分子,所述物种包括无脊椎动物和脊椎动物。术语“人”在应用于抗体或抗原结合单位时指由人基因表达的免疫球蛋白分子或其片段。术语“人源化”在应用于非人(例如啮齿类动物或灵长类动物)抗体时是包含来源于非人免疫球蛋白的最小序列的杂合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段。在大多数情况下,人源化抗体是人免疫球蛋白(接受者抗体),其中来自接受者之互补决定区(complementarydeterminingregion,CDR)的残基被来自非人物种之CDR(供体抗体)的具有所期望特异性、亲和性和能力的残基取代,所述非人物种例如小鼠、大鼠、兔或灵长类动物。在一些情况下,人免疫球蛋白的Fv框架区(frameworkregion,FR)被对应的非人残基取代。此外,人源化抗体可包含接受者抗体和所导入CDR或框架序列两者中都不存在的残基。进行这些修饰以进一步改善和优化抗体的性能并在被引入人体中时使免疫原性最小化。一般而言,人源化抗体可包含至少一个并且通常两个可变结构域的基本全部,其中CDR区的全部或基本全部对应于非人免疫球蛋白的那些,并且FR区的全部或基本全部是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体还可包含免疫球蛋白恒定区(constantregion,Fc)(通常是人免疫球蛋白的恒定区)的至少一部分。
本文中使用的术语“约”指偏离指定值的微小变化,优选在该指定值的10%以内。然而,术语“约”根据例如所使用的实验技术可指较大的变化限度。本领域技术人员理解指定值的所述变化,并且它们出现在本发明的上下文中。此外,为了提供更精确的描述,本文件中提供的一些数量表达未用术语“约”进行描述。应当理解,不管术语“约”是否被明确使用,本文件中所给定的每个数量试图指代实际的给定值,并且其还试图指代该给定值的近似值,所述近似值可根据本领域中的公知常识合理地推导出,其包括因用于该给定值的实验条件和/或测量而导致的等同值和近似值。
术语“原子量子簇”(缩写为AQC)在本文中被理解为金属原子量子簇。金属原子量子簇专一地由零氧化态金属原子形成,在本发明中优选用等于或少于309个金属原子形成(Mn,n<309)。AQC随时间保持稳定。优选地,本发明的AQC的尺寸包括约0.3nm至2.2nm,优选约0.3nm至2nm,更优选约0.3nm至1.8nm。这些金属AQC不会长时间表现的像“金属”,并且其表现变得与分子相似。因此,这些簇中出现在全部纳米颗粒、微米颗粒或金属材料中都观察不到的新特性。因此,AQC的物理化学性质不能简单地由纳米微米颗粒的那些物理化学性质推断出。
本文中使用的术语“亲和素”指在鸟、爬行动物和两栖动物的卵清和组织中发现的糖蛋白,并且其能够以高亲和力与生物素以及与亲和素生物素结合分子的任何表达或改造形式(例如链霉亲和素、中性亲和素等)结合。该术语包括在原鸡(Gallusgallus)的卵中天然发现的亲和素(NCBI登录号NM_205320.1/GL45384353en)以及其他物种中之所述蛋白质的直系同源物(orthologues)。
本文中使用的“结合伴侣”指对与其结合的结合伴侣或靶分子表现出结合选择性的分子。结合剂可以是生物分子,例如多肽(例如抗体或蛋白质)、基于多肽的毒素、氨基酸、核苷酸、多核苷酸(包括DNA和RNA)、脂质和碳水化合物,或其组合。结合剂还可以是半抗原、药物、离子络合剂(例如金属螯合剂)、微米颗粒、合成或天然聚合物、细胞、病毒或其他荧光分子(包括根据本发明的染料分子)。
本文中使用的术语“生物样品”指来源于生物的任何样品,包括但不局限于培养的细胞、骨髓;血液;血细胞(例如,白细胞、红细胞等);腹水;组织或细针活检样品;包含细胞的体液;自由浮动的核酸;痰;尿;脑脊液、腹膜液;胸膜液(pleuralfluid);洗涤液或灌洗液例如导管灌洗液或支气管肺泡灌洗液;抽吸物;刮屑;骨髓试样;组织活检试样;手术试样;其他体液、分泌物和/或排泄物;和/或来自其的细胞。在一些实施方案中,样品包括从患者获得的细胞。所述细胞可以例如来自血液、骨髓和/或来自来源于实体器官的组织,例如脑、脾、骨、心脏、血管、肺、肾、肝、垂体、内分泌腺、淋巴结、分散的原代细胞(dispersedprimarycell)、肿瘤细胞。生物样品可包括组织的切片,包括但不局限于出于组织学目的而取出的冷冻或固定切片。在一些实施方案中,样品可以是体液,包括但不局限于血液、淋巴液、腹水、妇科流体(gynecologicalfluid)和尿。样品可通过本领域中已知的任意广泛多种方法从对象获得,所述方法包括但不局限于活检(例如,细针抽吸或组织活检)、手术和收集体液(例如,血液、淋巴液等)。生物样品还包括通过加工上述任意样品获得的任何材料。所获得的样品可例如包括从生物样品提取或通过对样品进行以下技术所得到的核酸或蛋白质,所述技术例如扩增或逆转录mRNA,或分离和/或纯化某些组分。
本文中使用的术语“生物分子”是本领域专家技术人员所已知的并且指通过活生物体产生的任何有机分子或者指这样的化合物之任何人工产生的衍生物,包括大聚合分子例如蛋白质、多糖、碳水化合物、脂质、核酸和寡核苷酸以及小分子例如初级代谢物、次级代谢物和天然产物。
本文中使用的术语“生物素结合分子”旨在涵盖能够与生物素或任何生物素化合物紧密结合但非共价结合的任何化合物。
术语“生物素化分子”应被理解为经修饰的生物素或生物素类似物与另一部分的缀合物,所述另一部分例如生物分子,例如核酸分子(包括单链或双链DNA、RNA、DNA/RNA嵌合分子、核酸类似物和包含或引入核苷酸序列的任何分子,例如肽核酸(PNA)或其任何修饰形式)、蛋白质(包括糖蛋白、酶、肽文库或展示产物以及抗体或其衍生物)、肽、碳水化合物或多糖、脂质等,其中所述其他部分与经修饰的生物素或生物素类似物共价连接。很多生物素化配体是市售可得的或者可通过标准方法制备。用于使生物分子(例如核酸分子或蛋白质分子)与生物素偶联的方法在本领域中是公知的(Bayer和Wilchek,MethodsinMolec.Biology10,143.1992)。
术语“电荷转移复合物”也称为CT复合物或电子-供体-受体复合物在本文中被理解为至少两个AQC的联合,其中一部分的电子电荷(即电子)在AQC之间转移,从而导致一个AQC形成氧化形式而另一个AQC形成还原形式。产生的静电相互作用(即静电吸引)为分子复合物提供了稳定力。将从其转移电荷的源AQC称为电子供体而将接受的AQC称为电子受体。在本发明中:
-Mn是电子供体,其是复合物中的较小AQC,而
-M’n’是电子受体,其是复合物中的较大AQC。
CTC通过分解纳米微脂囊(nanosome)形成。分解纳米微脂囊的步骤是此前合成的纳米微囊体的去稳定过程。该步骤可通过不同的机制来实现。在一个优选实施方案中,破坏纳米微脂囊或使其去稳定的步骤通过超速离心来实现,但是本领域中已知的用于破坏纳米微脂囊的任何其他方式也是可用的,例如热处理或pH变化。电荷转移机制发生在纳米微脂囊的分解步骤过程中。因此,纳米微囊体被去稳定并形成通式(I)的电荷转移复合物。
存在不同的方法来获得用于本发明的CTC。
一种方法包括制备AQC(Mn和M’n’)的水溶液的步骤。优选地,这两种溶液具有几乎相同的AQC浓度,即两种溶液是等摩尔的或接近等摩尔的。在下一个步骤中,将两种溶液混合并一起搅拌以允许电荷-转移机制发生。在一个优选实施方案中,反应温度是20℃至80℃。在另一个实施方案中,反应时间是5分钟至3小时。
用于获得用于本发明的电荷转移复合物,特别是另外包含有机配体(其中所述有机配体是与原子量子簇(Mn和M’n’)连接的两亲分子,例如ω-羟基酸和ω-巯基酸)的电荷转移复合物的另一种方法包括以下步骤:
a)通过在水性介质中碱存在下混合ω-羟基酸和ω-巯基酸来制备纳米微脂囊,
b)向步骤a)中制备的混合物添加至少一种金属盐,
c)还原步骤b)中获得的混合物,并且
d)破坏步骤c)中获得的混合物中存在的纳米微脂囊。
在本文中术语“纳米微脂囊”涉及人工制备的纳米尺寸的囊泡。因此,术语“纳米微脂囊”指通过一层具有两个亲水基团的两亲分子(例如脂质)形成的球形纳米超分子结构,所述两个亲水基团各自结合在脂肪族-(CH2)n-链的每个末端或者结合在脂肪族CH3-(CH2)n-链的倒数第三χ、倒数第二ψ的位置。
在本发明的纳米微脂囊中形成所述单层的两亲分子包含:
-亲水基团,例如羧基(COOH)、羧酸根(COO-)或磷酸根(PO4-)基团,例如,这些基团在囊泡的外表面上、在脂肪链的一个末端以及
-经基团例如-OH、-SH、-NH2、-NH-、-Cl、-PH3、-SR、-OR、-NR2、-NHR或-NR-在倒数第三χ、倒数第二ψ位置取代的脂肪族CH3-(CH2)n-链或者在最后ω位置取代的脂肪族-(CH2)n-链,其中R表示能够形成纳米微脂囊的短烃链(C1-C4)有机基团,其位于囊泡的内部、在脂肪链的另一端或者在所述脂肪链之相对于亲水基团的最后位置,所述基团形成内径小于或等于10nm,优选小于或等于约5nm,更优选0.8nm至4nm的纳米腔。在一个具体实施方案中,纳米腔的内径是约1.5nm至1.8nm。
在一个优选实施方案中,术语“纳米微脂囊”指通过ω-羟基酸和ω-巯基酸形成的球形纳米超分子结构。在这一具体实施方案中,纳米微脂囊包含如上文所定义的ω-羟基酸(HO-(CH2)m-COOH)和ω-巯基酸(HS-(CH2)p-COOH)。纳米微脂囊中存在的ω-羟基酸和ω-巯基酸形成球形单层,酸基团-COOH(或-COO-,如果使用相应酸的盐的话)朝向于纳米系统(即纳米微脂囊)外表面而朝向内部的-OH和-SH基团形成纳米微脂囊中的内腔,从而形成两个大致同心的球,或者是如在文献中所提及的脂肪酸“流星锤”(“bola”)的形式。这种球形单层的厚度可以是约2nm至10nm,优选约5nm。
纳米微脂囊的内腔是封闭的。所述内腔的内径小于或等于10nm,优选小于或等于约5nm,并且更优选地所述内腔的内径是约0.8nm至4nm。在一个具体实施方案中,该纳米内腔的直径是约1.5nm至1.8nm。在纳米微脂囊的这一具体实施方案中,所述纳米腔通过羟基-OH和巯基-SH基团形成,然而,可将这些官能团替换成也与金属相互作用的其他官能团,例如-NH2、-NH-、-Cl、-PH3、-SR、-OR、-NR2、-NHR、-NR-,其中R表示能够形成纳米微脂囊的短烃链(C1-C4)有机基团是可能的。
可使用以下作为通过混合ω-羟基酸和ω-巯基酸制备纳米微脂囊的步骤a)中的碱:四丁基氢氧化铵、四辛基氢氧化铵、三乙基苄基氢氧化铵、三正辛基甲基氢氧化铵、三甲基癸基氢氧化铵、四甲基氢氧化铵、四乙基氢氧化铵或具有庞大基团(例如抗衡离子)的任何其他氢氧化物,优选四丁基氢氧化铵。
在步骤b)中,可使用过渡金属的金属盐或其组合。金属盐的非限制性实例是过渡金属的硝酸盐、硫酸盐、亚硫酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、磷酸盐、氢氧化物、氰酸盐、羧酸盐、硫代苹果酸盐、硫代葡萄糖酸盐(thioglucoSate)。作为单金属盐使用或与其他金属盐组合使用的这些金属盐的实例是AgNO3、CH3COOAg、Ag3AsO4、AgBrO3、AgBr、Ag2CO3、AgClO3、AgCl、AgCrO4、AgOCN、AgIO3、AgI、Ag2O、AgClO4、Ag3PO4、Ag2SO4、Ag2S、Ag2SO3、CuSO4、CuCl2、CuBr2、CuI2、Cu2S、CuSCN、CuCN、CuCO3、Cu2O、Cu(OH)2、Cu(NO3)2、Cu(ClO4)2、Cu(HCO2)2或Cu(CO2CH3)2。组合使用的金金属盐的非限制性实例是HAuCl4、AuCl、AuCl3、HAuCl4、HAuCl4·水溶液、KAuCl4、LiAuCl4、(CH3)2SAuCl、C3H9AuClP、C6H15AuClP、C18H15AuClP、C8H11AuClP、C5H5AuCl3N、(C4H9)3PAuCl、C27H36AuClN2、C21H12AuClF9P、C20H27AuClP、C33H49AuClP、C42H63AuClO3P、C21H24AuClN2、C35H49AuF6NO4PS2或(C20H15AuF6NO4PS2)·2C7H8。
在用于使步骤c)中获得的混合物还原的步骤c)中使用的还原体系或还原剂的非限制实例可以是NaBH4、DIBAH、LiAlH4、N2H4或SnCl2以及较温和的还原剂例如次磷酸钠、胺、糖、有机酸、聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)、UV-VIS辐射、超声波和光还原。
在本发明方法的步骤b)和c)之后,形成“包含AQC的纳米微脂囊”。这些“包含AQC的纳米微脂囊”包含在其内腔内部的(即包囊化的)至少两个不同尺寸的AQC(即,Mn和M’n’)。
这些“包含AQC的纳米微脂囊”的一个具体实例在Gaillard,C.,JournalofColloidandInterfaceScience,2209,337,2,610-613中进行了描述,其描述了这些纳米系统内部的金颗粒合成。
分解纳米微脂囊的步骤是此前合成的纳米微脂囊的去稳定过程。该步骤可通过不同的机制来实现。在一个优选实施方案中,破坏纳米微脂囊或使其去稳定的步骤通过超速离心来实现,但是本领域中已知的用于破坏纳米微脂囊的任何其他方式也是可用的,例如热处理或pH变化。电荷转移机制发生在纳米微脂囊的分解步骤过程中。因此,纳米微囊体被去稳定并形成通式(I)的电荷转移复合物。
还可通过破坏除纳米微脂囊之外的其他纳米系统来获得本发明中使用的电荷转移复合物,所述其他纳米系统在其内腔中包含至少两个不同尺寸的AQC(即,Mn和M’n’)。
术语“纳米系统”指通过一层或两层两亲分子形成的球样纳米超分子结构,其中所述两亲分子在纳米系统的内部形成纳米腔。具体地,纳米系统的外径为约等于或小于20nm,优选等于或小于18nm,并且更优选等于或小于15nm。纳米系统的内部包含至少一个内径小于或等于10nm,优选小于或等于约5nm,更优选0.8nm至4nm的纳米腔。在一个具体实施方案中,纳米腔的内径为约1.5nm至1.8nm。纳米系统的非限制性实例是纳米微脂囊,但还可以是胶束、反胶束、纳米乳剂或微乳剂。在一个优选实施方案中,纳米系统是纳米微脂囊。
表述“球样”指其在形状上具有与球形类似的立体几何图形。
形成纳米系统的两亲分子可以是相同的或不同的,优选两种不同类型的分子,并且每种分子同时具备亲水和亲脂特性。
亲脂特性由一般是烃部分的基团给予,例如形式CH3-(CH2)n-或-(CH2)n-(30>n>2,优选20>n>10)的脂肪链。
亲水特性由亲水基团给予。亲水基团可以是带电基团或极性不带电基团。带电基团选自阴离子基团,优选选自由羧酸盐、硫酸盐、磺酸盐和磷酸盐形成的基团。极性不带电基团选自由-OH、-SH、-NH2、-NH-、-Cl、-PH3、-SR、-OR、-NR2、-NHR和-NR-形成的基团,其中R表示短烃链(C1-C4)有机烷基基团,优选甲基、乙基或丙基。
两亲分子可具有一个脂肪族CH3-(CH2)n-链和一个与其结合的亲水基团或两个分别结合在脂肪族-(CH2)n-链的每个末端的亲水基团。
术语“胶束”指两亲分子聚集体。在水性介质中,分子聚集体的亲脂结构域定向于胶束的内部,而亲水结构域与介质接触。在“反胶束”中,分子是这样组织的,使得亲脂区暴露于外部而亲水区朝内部。在现有技术中,也使用术语“微乳剂”来指代“反胶束”,即“微乳剂”是“反胶束”的一个具体实施方案。术语“微乳剂”指由纳米尺寸的液滴形成的具有至少三种组分(水、一般称为油-的有机溶剂和两亲化合物)的单相热力学稳定系统。尽管不是限制性的,但是使用其中水滴分散在有机介质中的油包水微乳剂是本发明特别关注的。在这些油包水微乳剂中,使用涉及在水滴内部包含丙烯酸单体(例如丙烯酰胺或1,6-己二醇二丙烯酸酯)之微乳剂的聚合微乳剂由于其稳定性而也特别引人感兴趣,所述聚合微乳剂通过导入一些引发剂(例如自由基光引发剂)进行聚合。因此,微乳剂液滴可变得更具抗性。
术语“纳米乳剂”指具有至少三种组分(水、有机溶剂和稳定化合物)的两相热力学不稳定系统,但其通过化学或物理处理而暂时稳定并且由纳米液滴形成。纳米液滴的形成是区分纳米乳剂与本领域中已知乳剂的唯一事件,因此术语“纳米乳剂”一般指其中液滴是纳米尺寸的乳剂。
在一个具体实施方案中,纳米系统选自由纳米微脂囊、胶束和反胶束形成的组,优选地,纳米系统是纳米微脂囊。
在其中纳米系统是反胶束的具体实施方案中,反胶束包含至少两种不同的表面活性剂,其中至少一种表面活性剂包含硫醇基或硫醚基作为其极性基团。在一个更具体的实施方案中,所述至少两种表面活性剂是醇乙氧基化物和ω-巯基酸。
纳米系统的内腔是封闭的。如上所述,所述内腔的内径小于或等于10nm,优选小于或等于约5nm,并且更优选地所述内腔的内径为约0.8nm至4nm。在一个具体实施方案中,该纳米内腔的直径是约1.5nm至1.8nm。
可通过凝胶模型(Jelliummodel)由近似值来确定簇激发和发射波长的近似估值(参见例如J.Calvo等,EncyclopediaofNanotechnology,由B.Bhushan编辑,SpringerVerlag,2011)。该模型以相当接近的方式预测簇的禁止能带隙,并由此预测其发射带隙的位置。考虑到特定尺寸的簇中的斯托克斯位移(Stokesshift)是约50nm至100nm,簇的激发带隙可继而由发射带隙预测。下表(表1)示出了根据该模式之针对Au或Ag的AQC的理论数据,即已借助所述凝胶模型计算出Au或Ag的AQC的近似激发波长λexc.和发射波长λem.,其中误差为±50nm:Eem=EF/N1/3;其中Eem=发射能量;N=AQC中原子的数目;并且EF=费密能级(Fermilevel),金和银的费密能级同为约5.5eV。
簇 | λexc.(nm) | λem.(nm) |
A2 | 200-250 | 300 |
A3 | 240-290 | 340 |
A4 | 270-320 | 370 |
A5 | 300-350 | 400 |
A6 | 325-375 | 425 |
A7 | 350-400 | 450 |
A10 | 400-450 | 500 |
A12 | 440-490 | 540 |
A15 | 475-525 | 575 |
A20 | 535-585 | 635 |
A25 | 580-630 | 680 |
A30 | 630-680 | 730 |
A40 | 700-750 | 800 |
在实践中,当使纳米系统对于将纳米系统内腔中的OH和SH基团替换成其他配体有反应时,这些数值还可不同。在不受限制的情况下,待替换的配体可选自-NH2、-NH-、-Cl、-PH3、-SR、-OR、-NR2、-NHR、-NR-,其中R表示能够形成纳米微脂囊的短链有机基团。
换言之,用于获得特定激发和发射波长的簇类型可由上表决定。因此,例如为了获得激发波长为300nm、发射波长为600nm并且斯托克斯位移为300nm的系统,应选择以下簇尺寸:
-激发簇(“供体”,Mn):M3/M5,
-发射簇(“受体”,M’n’):M’12/M’20。
在本发明的范围内,术语“过渡金属的组合”指具有至少两种不同过渡金属原子的AQC,也指单过渡金属AQC的存在,在不同于第一过渡金属AQC的另一过渡金属AQC存在的情况下使得至少两个不同尺寸的AQC可以是具有相同过渡金属的AQC、具有不同过渡金属的AQC或具有相同或不同双金属组合的AQC。
术语“检测”及其变化形式涵盖定量测量以及定性测量。
本文中使用的“荧光原位杂交”或“FISH”指用于通过使用标记的核酸探针来检测或定位染色体上的特定DNA序列的方法,所述标记的核酸探针与染色体上的特定DNA序列杂交。
“固定化”指与例如装置的表面直接或间接结合,包括通过共价结合或非共价结合(例如,氢键、离子相互作用、范德华力或疏水相互作用)的连接。“翻译后修饰”指在蛋白质翻译后对其的化学修饰。这包括但不局限于添加官能团(例如,磷酸化、糖基化、乙酰化、烷基化、甲基化、甲酰化、氧化或生物素化)、添加蛋白质或肽(例如,泛素化)、改变氨基酸的化学性质(例如,脱氨基或脱甲基化)和结构改变(例如二硫桥或蛋白水解切割)。
本文中使用的术语“免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)”也称为“免疫细胞化学(immunocytochemistry,ICC)”在应用于细胞时指诊断病理学的工具,其中单克隆抗体的组可用于差别诊断未分化的赘生物(例如,用于区分淋巴瘤、癌和肉瘤)以揭示对某些肿瘤类型和其他疾病具有特异性的标志物、诊断和分型恶性淋巴瘤以及证明病毒抗原、肿瘤蛋白、激素受体和增殖相关核蛋白的存在。
本文中使用的术语“试剂盒”指包含用于实施本发明之方法所必需的不同试剂的产品,这些试剂是经包装的以允许其运输和储存。适用于包装试剂盒组分的材料包括晶体、塑料(例如聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯)、瓶子、小瓶、纸或封套。
字母“n”和“n’”指每个AQC中的过渡金属原子的数目。如上文所述,n小于n’(n<n’)。优选地,n与n’之间的最小差异是5个金属原子。在一个优选实施方案中,n与n’之间的差异是5至50个原子,在一个具体实施方案中,n与n’之间的差异为5至25个原子,并且在另一个实施方案中,n与n’之间的差异是5至15。
可与电荷转移复合物连接的“有机配体”是至少两种不同类型的有机配体,并且优选地所述至少两种不同类型的有机配体选自ω-羟基酸(HO-(CH2)m-COOH)配体和ω-巯基酸(HS-(CH2)p-COOH)配体,其中m和p的值是2至30,优选地m和p的值是10至20。在一个具体实施方案中,m和p的值是15。在另一个具体实施方案中,m和p的值是11。
m和p的值可以是不同的或相同的。在m和p不同的情况下,它们之间的差异小于6个碳,优选地,m和p的差值是1至4。在一个优选实施方案中,m和p是相同的。其中所述至少两种不同类型的有机配体选自ω-羟基酸(HO-(CH2)m-COOH)配体和ω-巯基酸(HS-(CH2)p-COOH)配体,酸基团-COOH(或COO-,如果使用相应酸的盐的话)定向于纳米化合物的外表面,而-OH和-SH基团定向于内部,即朝向电离的AQC(Mn +和M’n’-),与电离的AQC相结合、连接或配位。
在另一个实施方案中,可与电荷转移复合物连接的“有机配体”具有除羟基-OH或巯基-SH基团之外的其他官能团,例如-NH2、-NH-、-Cl、-PH3、-SR、-OR、-NR2、-NHR、-NR-,其中R表示能够与AQC或电离的AQC(Mn +和M’n’-)结合、连接或配位的短烃链有机基团(C1-C4)。还可将ω-羟基酸(HO-(CH2)m-COOH)配体和ω-巯基酸(HS-(CH2)p-COOH)配体的羟基-OH或巯基-SH基团替换成上文提及的也与AQC的金属相互作用的这些其他基团。
本文中使用的“核酸探针”指识别染色体上的特定DNA序列并与其杂交的核酸(例如DNA、RNA、PNA等)序列。
术语“间隔基团”或“间隔基”指将两个或更多个亚结构连接的化学结构的一部分。这些间隔基团将会在本申请的下文中列举。间隔基团的原子和间隔基团内的链的原子自身通过化学键连接。其中,优选的间隔基团是直链或支链的、饱和或不饱和的碳链。这些碳链还可在链内或者在链的末端包含一个或更多个杂原子。“杂原子”指除不同于碳的原子,其选自氧、氮和硫。间隔基团还可包含环状基团或芳香基团作为链的一部分或者作为链中一个原子的取代基。
本文中使用的术语“多核苷酸”可与脱氧核糖核酸互换使用,指如本领域中所理解的以其多种不同形式的脱氧核糖核酸,例如基因组DNA、cDNA、分离的核酸分子、载体DNA和染色体DNA。“核酸”指任何形式的DNA或RNA。分离的核酸分子的实例包括,但不局限于,包含在载体中的重组DNA分子、维持在异源宿主细胞中的重组DNA分子、部分或基本纯化的核酸分子和合成DNA分子。一般而言,“分离的”核酸不含在该核酸所来源于之生物体的基因组DNA中天然位于该核酸侧翼的序列(即,位于该核酸5’端和3’端的序列)。此外,“分离的”核酸分子(例如cDNA分子)当由重组技术产生时一般基本不含其他细胞物质或培养基或者当化学合成时一般基本不含化学前体或其他化学物质。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用,指任意长度的氨基酸聚合物。所述聚合物可以是线性的、环状的或分支的。所述聚合物可包含经修饰的氨基酸,并且其可被非氨基酸间断(interrupted)。该术语还涵盖已经修饰的氨基酸聚合物,例如经由磺化、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化、碘化、甲基化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、转运RNA介导的蛋白质氨基酸加成例如精氨酰化、泛素化或任何其他操作,例如与标记组分缀合。本文中使用的术语“氨基酸”指天然的和/或非天然的或者合成的氨基酸,包括甘氨酸和D或L两种光学异构体,以及氨基酸类似物和肽模拟物(peptidomimetic)。
本文中使用的术语“保护基团”指当与分子屏蔽物中的反应基团连接时降低或阻止反应性的原子组。
本文中使用的术语“反应基团”指能够与另一化学基团反应以形成共价键的基团,即在合适的反应条件下共价反应的基团,并且一般表示针对另一物质的连接点。反应基团一般包括亲核基团、亲电子基团和光激活基团。示例性的反应基团包括,但不局限于,烯烃、乙炔、醇、酚、醚、氧化物、卤化物、醛、酮、羧酸、酯、酰胺、氰酸盐/酯、异氰酸盐/酯、硫氰酸盐/酯、异硫氰酸盐/酯、胺、肼、腙、酰肼、重氮、重盐、硝石(nitre)、腈、硫醇、硫化物、二硫化物、亚砜、砜、磺酸、硫酸、缩醛、缩酮、酐、硫酸盐/酯、次磺酸异腈、脒、二酰亚胺、亚氨酸盐/酯、硝酮、羟胺、肟、异羟肟酸、硫代异羟肟酸、丙二烯、原酸酯、亚硫酸盐/酯、烯胺、炔胺、脲、假脲、氨基脲、碳二亚胺、氨基甲酸盐/酯、亚胺、叠氮化物、偶氮化合物、氧化偶氮化合物和亚硝基化合物。反应性官能团还包括用于制备生物缀合物的那些,例如N-羟基琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺等。制备这些官能团中的每一种的方法在本领域中是公知的并且其出于特定目的的应用或改变在本领域技术人员的能力范围之内(参见,例如,Sandier和Karo,编辑,OrganicFunctionalGroupPreparations.AcademicPress,SanDiego,1989)。
本文中使用的术语“样品”以其最广泛的含义使用并且指包含待检测的生物分子的样品。在一些实施方案中,样品是环境样品,例如土壤、水或空气;或者来自工业来源,例如取自污水流、水源、供应线或生产批次。在另一个实施方案中,样品是生物样品。
本发明中使用的表达“特异性结合”指第一分子与第二分子能够通过两个分子的三维结构之间存在的互补性以相对于非特异性结合显著更高的亲和力特异性结合,使得所述第一和第二分子之间的结合优先发生在任意所述分子与反应混合物中存在的其他分子结合之前。应当理解,当由所述结合产生的复合物具有以下解离常数(KD)时,两个分子的结合中存在高亲和力:小于10-6M、小于10-7M、小于10-8M、小于10-9M、小于10-10M、小于10-11M、小于10-12M、小于10-13M、小于10-14M或小于10-15M。
本文中使用的术语“链霉亲和素”对应于来自阿维丁链霉菌(Streptomycesavidinii)的蛋白质(在GenBank中的登录号CAA00084.1),以及以与亲和素相同之方式定义的链霉亲和素的直向同源物(orthologue)、同源物和片段。
本文中定义的“严格条件”或“高严格性条件”通常为:(1)采用低离子强度和高温进行洗涤,例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1%十二烷基硫酸钠,50℃;(2)在杂交期间采用变性剂,例如甲酰胺,例如50%(v/v)甲酰胺与0.1%牛血清白蛋白/0.1%Ficoll/0.1%聚乙烯吡咯烷酮/50mMpH6.5磷酸钠缓冲液以及750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠,42℃;或(3)采用50%甲酰胺、5×SSC(0.75MNaCl,0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH6.8)、0.1%焦磷酸钠、5×Denhardt溶液、超声波处理过的鲑精DNA(50μg/ml)、0.1%SDS和10%硫酸葡聚糖,42℃;在0.2×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)和50%甲酰胺中在42℃下洗涤,之后在55℃下用由含有EDTA的0.1×SSC组成的高严格性洗涤剂洗涤。中等严格条件可按照Sambrook等,MolecularCloning:ALaboratoryManual,NewYork:ColdSpringHarborPress,1989所述进行鉴定并且可包括使用严格性低于上文所述的那些的洗涤溶液和杂交条件(例如,温度、离子强度和%SDS)。中等严格条件的一个实例是在包含以下的溶液中在37℃下孵育过夜:20%甲酰胺、5×SSC(150mMNaCl,15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt溶液、10%硫酸葡聚糖和20mg/ml变性的剪切鲑精DNA,之后在1×SSC中在约37℃至50℃下洗涤滤液。技术人员将知道如何根据需要调节温度、离子强度等以适应诸如探针长度等因素。在一些实施方案中,用作用于检测生物分子的结合伴侣的核苷酸可为任意长度,例如长度为至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少12个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少120个、至少150个、至少200个等的核苷酸。核酸可包括脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、肽核酸(PNA)、任意前述的衍生物以及任意前述的组合。不管寡核苷酸的组成,将寡核苷酸中等同于DNA或RNA碱基的每个单位称为“核苷酸”。
本文中使用的术语“标签”涉及特异性结合分子可用于其的任何氨基酸序列,由此允许检测/纯化携带所述标签的任何多肽。
本文中使用的术语“ω-羟基酸”指具有通式HO-(CH2)m-COOH的化合物,其中m的值是2至30。
本文中使用的术语“ω-巯基酸”指具有通式HS-(CH2)p-COOH的化合物,其中m的值为2至30。
发明详述
AQC-CTC与生物素结合分子的非共价复合物
本发明的作者已观察到链霉亲和素与AQC-CTC相互作用导致其荧光强度增加并且这种结合可在生物素或生物素化分子的存在下逆转,从而导致包含AQC-CTC和链霉亲和素的复合物的荧光强度下降。
因此,在第一方面,本发明涉及一种复合物,其包含生物素结合分子和通式(I)的至少两个不同尺寸的金属原子量子簇(AQC)Mn和M’n’的电荷转移复合物:
Mn +M’n’ -(I),
其中
金属AQC的金属M和M’是相同金属或不同金属,
Mn是以其氧化形式Mn +存在的较小AQC,
M’n’是以其还原形式M’n’ -存在的较大AQC,
Mn +和M’n’ -通过静电相互作用结合,
n和n’分别为M和M’的金属原子数目,并且
n小于n’
其中生物素结合分子和电荷转移复合物不共价结合。
至少两个不同尺寸的金属原子量子簇(AQC)的电荷转移复合物,特别是另外包含有机配体的电荷转移复合物,其中所述有机配体是与原子量子簇(Mn和M’n’)连接的两亲分子,例如ω-羟基酸和ω-巯基酸,包括以下步骤:
a)通过在水性介质中碱存在下混合ω-羟基酸和ω-巯基酸来制备纳米微脂囊,
b)向步骤a)中制备的混合物添加至少一种金属盐,
c)还原步骤b)中获得的混合物,以及
d)破坏步骤c)中获得的混合物中存在的纳米微脂囊。
术语“纳米微脂囊”在本发明的范围内涉及人工制备的纳米尺寸的囊泡。因此,术语“纳米微脂囊”指通过一层具有两个亲水基团的两亲分子(例如脂质)形成的球形纳米超分子结构,所述两个亲水基团分别结合在脂肪族-(CH2)n-链的每端或者结合在脂肪族CH3-(CH2)n-链的倒数第三χ、倒数第二ψ的位置。
在本发明的纳米微脂囊中形成所述单层的两亲分子包含:
-亲水基团,例如羧基(COOH)、羧酸根(COO-)或磷酸根(PO4 -)基团,例如,这些基团在囊泡的外表面上、在脂肪链的一端并且
-在其倒数第三χ、倒数第二ψ位置被以下基团取代的脂肪族CH3-(CH2)n-链或者在其最后ω的位置被以下基团取代的脂肪族-(CH2)n-链,例如-OH、-SH、-NH2、-NH-、-Cl、-PH3、-SR、-OR、-NR2、-NHR或-NR-,其中R表示能够形成纳米微脂囊的短烃链(C1-C4)有机基团,这些基团位于朝向囊泡的内部、相对于亲水基团在所述脂肪链的最后位置或者在脂肪链的另一端,所述基团形成内径小于或等于10nm,优选小于或等于约5nm,更优选0.8nm至4nm的纳米腔。在一个具体实施方案中,纳米腔的内径是约1.5nm至1.8nm。
在一个优选实施方案中,术语“纳米微脂囊”指通过ω-羟基酸和ω-巯基酸形成的球形纳米超分子结构。在这一具体实施方案中,纳米微脂囊包含如上文所定义的ω-羟基酸(HO-(CH2)m-COOH)和ω-巯基酸(HS-(CH2)p-COOH)。纳米微脂囊中存在的ω-羟基酸和ω-巯基酸形成球形单层,酸基团-COOH(或-COO-,如果使用相应酸的盐的话)朝向纳米系统(即纳米微脂囊)外表面而定向于内部的-OH和-SH基团形成纳米微脂囊中的内腔,从而形成两个大致同心的球,或者是如在文献中所提及的脂肪酸“流星锤”的形式。这种球形单层的厚度可以是约2nm至10nm,优选约5nm。
纳米微脂囊的内腔是封闭的。所述内腔的内径小于或等于10nm,优选小于或等于约5nm,并且更优选地所述内腔的内径是约0.8nm至4nm。在一个具体实施方案中,该纳米内腔的直径是约1.5nm至1.8nm。在纳米微脂囊的这一具体实施方案中,所述纳米腔通过羟基-OH和巯基-SH基团形成,然而可将这些官能团替换成也与金属相互作用的其他基团,例如-NH2、-NH-、-Cl、-PH3、-SR、-OR、-NR2、-NHR、-NR-,其中R表示能够形成纳米微脂囊的短烃链有机基团(C1-C4)是可能的。
可使用以下作为通过混合ω-羟基酸和ω-巯基酸制备纳米微脂囊的步骤a)中的碱:四丁基氢氧化铵、四辛基氢氧化铵、三乙基苄基氢氧化铵、三正辛基甲基氢氧化铵、三甲基癸基氢氧化铵、四甲基氢氧化铵、四乙基氢氧化铵或具有庞大基团(例如抗衡离子)的任何其他氢氧化物,优选四丁基氢氧化铵。
在步骤b)中,可使用过渡金属的金属盐或其组合。金属盐的非限制性实例是过渡金属的硝酸盐、硫酸盐、亚硫酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、磷酸盐、氢氧化物、氰酸盐、羧酸盐、硫代苹果酸盐、硫代葡萄糖酸盐。作为单金属盐使用或与其他金属盐组合使用的这些金属盐的实例是AgNO3、CH3COOAg、Ag3AsO4、AgBrO3、AgBr、Ag2CO3、AgClO3、AgCl、AgCrO4、AgOCN、AgIO3、AgI、Ag2O、AgClO4、Ag3PO4、Ag2SO4、Ag2S、Ag2SO3、CuSO4、CuCl2、CuBr2、CuI2、Cu2S、CuSCN、CuCN、CuCO3、Cu2O、Cu(OH)2、Cu(NO3)2、Cu(ClO4)2、Cu(HCO2)2或Cu(CO2CH3)2。组合使用的金金属盐的非限制性实例是HAuCl4、AuCl、AuCl3、HAuCl4、HAuCl4·水溶液、KAuCl4、LiAuCl4、(CH3)2SAuCl、C3H9AuClP、C6H15AuClP、C18H15AuClP、C8H11AuClP、C5H5AuCl3N、(C4H9)3PAuCl、C27H36AuClN2、C21H12AuClF9P、C20H27AuClP、C33H49AuClP、C42H63AuClO3P、C21H24AuClN2、C35H49AuF6NO4PS2或(C20H15AuF6NO4PS2)·2C7H8。
在用于使步骤c)中获得的混合物还原的步骤c)中使用的还原体系或还原剂的非限制实例可以是NaBH4、DIBAH、LiAlH4、N2H4或SnCl2以及较温和的还原剂例如次磷酸钠、胺、糖、有机酸、聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)、UV-VIS辐射、超声波和光还原。
在本发明方法的步骤b)和c)之后,形成“包含AQC的纳米微脂囊”。这些“包含AQC的纳米微脂囊”包含在其内腔内部的(即包囊化的)至少两个不同尺寸的AQC(即,Mn和M’n’)。
这些“包含AQC的纳米微脂囊”的一个具体实例在Gaillard,C.,JournalofColloidandInterfaceScience,337卷,2,610-613中进行了描述,其描述了这些纳米系统内部的金颗粒合成。
分解纳米微脂囊的步骤是此前合成的纳米微脂囊的去稳定过程。该步骤可通过不同的机制来实现。在一个优选实施方案中,破坏纳米微脂囊或使其去稳定的步骤通过超速离心来实现,但是本领域中已知的用于破坏纳米微脂囊的任何其他方式也是可用的,例如热处理或pH变化。电荷转移机制发生在纳米微脂囊的分解步骤过程中。因此,纳米微囊体被去稳定并形成通式(I)的电荷转移复合物。
在一个实施方案中,金属AQC中的金属M和M’选自过渡金属或其组合,优选地过渡金属选自Au、Ag、Co、Cu、Pt、Fe、Cr、Pd、Ni、Rh及其组合,更优选地它们选自Au、Ag、Cu及其组合,并且更优选地过渡金属选自Au、Ag及其组合。
由于荧光的激发波长和发射波长取决于AQC的尺寸,因此可通过指导形成具有所需尺寸的AQC来选择激发波长和发射波长。
在一个优选实施方案中,只有一个电子在至少两个AQC(Mn和M’n’)之间转移,从而产生离子形式Mn +(即Mn的氧化形式)和M’n’ -(M’n’的还原形式),其中“+”是正电荷而“-”是负电荷。
在一些实施方案中,n和n’是2至309、2至102、2至55或2至25个金属原子。在一些实施方案中,n与n’之间的差异是5至50个原子。
在另一个实施方案中,n与n’之间的差异是5至50或5至25个原子。
在一些实施方案中,CTC还包含与原子量子簇(Mn和M’n’)连接的ω-羟基酸配体和ω-巯基酸配体。
在一些实施方案中,生物素结合分子是亲和素、链霉亲和素或其任意变体,其基本保留生物素结合能力并且以导致AQC-CTC荧光发射的至少一个参数改变的方式与AQC-CTC相互作用。用于检测亲和素类似物或变体或者链霉亲和素类似物或变体是否保留了其生物素结合能力的方法在本领域中是广泛已知的并且包括例如WO2012058635中所述的基于生物层干涉测量法(BioLayerInterferometry,BLI)的方法,其中与光纤尖端结合的分子层可在从分子层反射的白光中产生干涉图案。改变与光纤尖端结合的分子数目导致该干扰图案发生可测量的位移。波长位移是分子层厚度的直接量度。此外,由于位移可实时测量,因此可测定缔合和解离速率而无需进一步进行其他操作。
适用于确定给定亲和素或链霉亲和素的变体是否以导致AQC-CTC荧光发射的至少一个参数改变的方式与AQC-CTC相互作用的方法也是技术人员可获得的,并且包括例如本申请的实施例1中所述的方法,其中使AQC-CTC与链霉亲和素变体接触,并测定荧光强度的变化(增加)。
在一些实施方案中,生物素结合分子是保留基本生物素结合活性的链霉亲和素片段或亲和素片段,例如可使用分别保留天然链霉亲和素或亲和素的至少50%或更多结合亲和力的链霉亲和素片段或亲和素片段。优选地,亲和素变体对生物素的亲和力是至少1015M-1、1014M-1、1013M-1、1012M-1、1010M-1或109M-1。
为方便起见,在本说明书中,本文中使用的术语“亲和素”和“链霉亲和素”旨在涵盖生物素结合片段、突变体和这些结合对成员的核心形式,其中基本保留生物素结合能力和对AQC-CTC荧光发射的影响。亲和素和链霉亲和素可从商业供应商获得。此外,编码链霉亲和素与亲和素的核酸序列以及链霉亲和素与亲和素氨基酸序列可见于例如GenBank登录号X65082;X03591;NM--205320;X05343;Z21611;和Z21554中。
在一些实施方案中,适用于本发明中的亲和素和链霉亲和素变体包括,但不局限于
-“核心链霉亲和素”,其是全长链霉亲和素多肽的截短形式,其可包括链霉亲和素的第13-138位、第14-138位、第13-139位和第14-139位残基。参见,例如,Pahler等,(JBiolChem1987:262:13933-37)。
-保留强生物素结合的链霉亲和素截短形式与亲和素截短形式(参见,例如Sano等,(JBiolChem1995;270:28204-09)(描述核心链霉亲和素变体16-133和14-138)(美国专利No.6,022,951)。
-保留基本生物素结合活性或生物素结合活性增加的链霉亲和素突变体和链霉亲和素核心形式。参见Chilcoti等,ProcNatlAcadSciUSA1995;92(5):1754-8;Reznik等,NatBiotechnol1996;14(8):1007-1011。
-免疫原性降低的突变体,例如经位点定向诱变改造以除去潜在的T细胞表位或淋巴细胞表位的突变体。参见Meyer等,ProteinSci2001;10:491-503。
-还可使用保留基本生物素结合活性或生物素结合活性增加的亲和素突变体和亲和素核心形式。参见Hiller等,JBiochem1991;278:573-85;Livnah等,ProcNatlAcadSciUSA1993;90:5076-80。
-通过对亲和素进行化学修饰产生的变体,例如通过完全或部分磷酸化修饰产生的变体及其片段以及称为中性亲和素的完全去糖基化的亲和素变体。
-如WO05047317A1中所述的亲和素变体
-如WO06045891中所述的亲和素样蛋白,
-如WO0198349中所述的重组亲和素,
-如WO0027814中所述的亲和素变体,
-如WO06084388中所述的单体链霉亲和素,
-经修饰的链霉亲和素二聚体,例如WO06058226中所述的那些,
-如WO04018509中所述的具有生物素结合能力的蛋白质,
-如WO9840396中所述的具有较高生物素亲和力的链霉亲和素,
-如WO9640761中所述的经修饰的链霉亲和素分子与亲和素分子,
-如WO9711183中所述的链霉亲和素突变体,
-如WO9624606中所述的具有改进的亲和力的链霉亲和素。
不同的亲和素变体是市售可得的,例如Extravidin(Sigma-Aldrich)、NeutrAvidin(ThermoScientific)、NeutrAvidin(Invitrogen)和NeutraLite(Belovo)。
在一些实施方案中,生物素结合分子是链霉亲和素的功能等效变体。本文中使用的链霉亲和素的“功能等效变体”被理解为基本上保留链霉亲和素之生物素结合能力的多肽。链霉亲和素V的功能等效变体在其全长上表现出与链霉亲和素至少60%、65%、70%、72%、74%、76%、78%、80%、90%、95%、97%、99%的相似性或同一性。
本文中使用的术语“非共价结合”用于指生物素结合分子和电荷转移复合物通过分子间力相互作用,其不涉及CTC-AQC的原子与生物素结合分子的原子之间的共价键。在一些实施方案中,CTC-AQC和生物素结合分子通过氢键、通过疏水相互作用、通过离子键或其组合连接。
在一些实施方案中,CTC还包含与其连接的有机配体。可与CTC连接的“有机配体”是至少两种不同类型的有机配体,并且优选地所述至少两种不同类型的有机配体选自ω-羟基酸(HO-(CH2)m-COOH)配体和ω-巯基酸(HS-(CH2)p-COOH)配体,其中m和p的值为2至30,优选地m和p的值为10至20。在一个具体实施方案中,m和p的值为15。在另一个具体实施方案中,m和p的值为11。m和p的值可以是不同的或相同的。在m和p不同的情况下,它们之间的差异小于6个碳,优选地,m和p的差值为1至4。在一个优选实施方案中,m和p是相同的。其中所述至少两种不同类型的有机配体选自ω-羟基酸(HO-(CH2)m-COOH)配体和ω-巯基酸(HS-(CH2)p-COOH)配体,酸基团-COOH(或COO-,如果使用相应酸的盐的话)朝向纳米化合物的外表面,而-OH和-SH基团朝向内部,即朝向电离的AQC(Mn +和M’n’ -),与它们相结合、连接或配位。
在另一个实施方案中,可与电荷转移复合物连接的“有机配体”具有除羟基-OH或巯基-SH基团之外的其他官能团,例如-NH2、-NH-、-Cl、-PH3、-SR、-OR、-NR2、-NHR、-NR-,其中R表示能够与AQC或电离的AQC(Mn +和M’n’ -)结合、连接或配位的短烃链(C1-C4)有机基团。还可将ω-羟基酸(HO-(CH2)m-COOH)配体和ω-巯基酸(HS-(CH2)p-COOH)配体的羟基-OH或巯基-SH基团替换成上文提及之也与AQC的金属相互作用的这些另外的基团。
在一些实施方案中,当生物素结合分子是链霉亲和素时,根据本发明的复合物是包含4个链霉亲和素单体并具有可变数目的CTC-AQC的同源四聚体。在一些实施方案中,所述复合物由链霉亲和素的同源四聚体和每复合物至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少8个、至少12个、至少16个、至少20或更多个CTC-AQC形成。
包含AQC-CTC和生物素结合分子的成套试剂盒
在另一个实施方案中,本发明涉及一种成套试剂盒,其包含一起的或分开的:
(i)至少两个不同尺寸的金属原子量子簇(AQC)Mn和M’n’的电荷转移复合物,其中所述电荷转移复合物具有上文所限定的式I,并且其中所述金属AQC的M和M’是相同金属或不同金属,Mn是以其氧化形式Mn +存在的较小AQC,M’n’是以其还原形式M’n’ -存在的较大AQC,Mn +和M’n’ -通过静电相互作用结合,n和n’分别为金属原子的数目,以及
(ii)生物素结合分子。
在一些实施方案中,生物素结合分子是链霉亲和素或在本发明复合物的背景下所提及的任何生物素结合分子。
在一些实施方案中,金属原子量子簇中的金属M和M’独立地选自过渡金属或其组合。在一些实施方案中,金属原子量子簇中的金属M和M’独立地选自过渡金属Au、Ag、Cu及其组合,并且更优选Au、Ag及其组合。在一些实施方案中,n和n’取值自2至309个金属原子、2至102个金属原子、2至55个金属原子或2至25个金属原子。在一些实施方案中,n与n’之间的差异是5至50个原子。在一些实施方案中,电荷转移复合物还包含与原子量子簇(Mn和M’n’)连接的ω-羟基酸配体和ω-巯基酸配体,其具有其中m的值为2至30的通式HO-(CH2)m-COOH或其中m的值为2至3的通式HS-(CH2)p-COOH,其中涉及m和p的值的不同实施方案以及所述值之间的差异如在本发明复合物的背景下所描述的。
在一些实施方案中,试剂盒的组分可存在于分开的容器中。
适用于包装试剂盒组分的材料包括晶体、塑料(例如聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯等)、瓶子、小瓶、纸、封套等。另外,本发明的试剂盒可包含用于同时、先后或分开使用试剂盒中的不同组分的说明书。所述说明书可以是印刷材料的形式或者是能够储存说明书使得对象可阅读它们的电子支持物的形式,例如电子储存介质(磁盘、磁带等)、光学介质(CD-ROM、DVD)等。另外地或者作为替代地,所述介质可包含提供所述说明书的互联网地址。
用于使用AQC-CTC检测生物素化分子的竞争性测定
本发明的作者已观察到在链霉亲和素的存在下AQC-CTC的荧光强度增加并且荧光的这种增加可在生物素或生物素化分子的存在下逆转,从而允许通过测量AQC-CTC的荧光强度变化来检测样品中的生物素或生物素化分子。不期望受任何理论的限制,认为AQC-CTC能够以导致AQC-CTC发射的荧光强度增强的方式与生物素结合分子相互作用。这种结合在生物素或生物素类似物的存在下逆转,从而导致AQC-CTC释放,并导致其荧光降低。
在一个方面,本发明涉及用于检测样品中的生物素化分子的方法,其包括以下步骤:
(i)使所述样品与根据权利要求1至4中任一项所述的复合物在足以使所述生物素化分子与所述复合物中的生物素结合分子结合的条件下接触,以及
(ii)检测在步骤(i)的所述接触之后在所述AQC的激发波长下响应于所述样品之激发的所述AQC的荧光发射强度的变化,
其中在接触步骤之后,AQC发射的荧光强度降低指示样品中存在生物素化分子。
在第一步中,使怀疑包含生物素化分子的样品与包含生物素结合分子和CTC-AQC的组合物接触。
在一些实施方案中,金属原子量子簇中的金属M和M’独立地选自过渡金属或其组合。在一些实施方案中,M和M’独立地选自过渡金属Au、Ag、Cu及其组合,并且更优选Au、Ag及其组合。
在一些实施方案中,n和n’为2至309、2至102、2至55或2至25个金属原子。在一些实施方案中,n与n’之间的差异是5至50个原子。
在一些实施方案中,AQC-CTC还包含与原子量子簇(Mn和M’n’)连接的ω-羟基酸配体和ω-巯基酸配体。在一些实施方案中,与原子量子簇(Mn和M’n’)连接的ω-羟基酸配体和ω-巯基酸配体具有其中m的值为2至30的通式HO-(CH2)m-COOH或其中m的值为2至3的通式HS-(CH2)p-COOH,其中涉及m和p的值以及所述值之间差异的不同实施方案如在本发明复合物的背景下所描述的。
在一些实施方案中,生物素结合分子是亲和素、链霉亲和素或其任意变体,其基本保留生物素结合能力并且以导致AQC-CTC之荧光发射的至少一个参数改变的方式与AQC-CTC相互作用。用于检测亲和素类似物或链霉亲和素类似物是否保留其生物素结合能力的方法在本领域中是广泛已知的并且包括例如WO2012058635中所述的基于生物层干涉测量法(BLI)的方法,其中与光纤顶端结合的分子层可在从分子层反射的白光中产生干涉图案。改变与光纤顶端结合的分子数目导致该干扰图案发生可测量的位移。波长位移是分子层厚度的直接量度。此外,由于位移可实时测量,因此可测定缔合和解离速率。
适用于确定给定亲和素变体或链霉亲和素变体是否以导致AQC-CTC荧光发射的至少一个参数改变的方式与AQC-CTC相互作用的方法也是本领域技术人员可获得的,并且包括例如本申请的实施例1中所述的方法,其中使AQC-CTC与链霉亲和素变体接触,并测定荧光强度的变化(增加)。
在一些实施方案中,生物素结合分子是保留基本生物素结合活性的链霉亲和素片段或亲和素片段,例如可使用分别保留天然链霉亲和素或亲和素的至少50%或更多结合亲和力的链霉亲和素片段或亲和素片段。优选地,亲和素变体对生物素的亲和力是至少1015M-1、1014M-1、1013M-1、1012M-1、1010M-1或109M-1。
在一些实施方案中,“生物素结合分子”如在AQC-CTC与生物素结合分子的非共价复合物的背景下所定义的。在一些实施方案中,适用于本发明中的亲和素变体和链霉亲和素变体包括,但不局限于:核心链霉亲和素;链霉亲和素的截短形式与亲和素的截短形式(参见,例如Sano等,(JBiolChem1995;270:28204-09)(描述了核心链霉亲和素变体16-133和14-138)(美国专利No.6,022,951);保留基本生物素结合活性或生物素结合活性增加的链霉亲和素突变体和链霉亲和素核心形式(参见Chilcoti等,ProcNatlAcadSciUSA1995;92(5):1754-8;Reznik等,NatBiotechnol1996;14(8):1007-1011);免疫原性降低的链霉亲和素突变体和链霉亲和素核心形式,例如经位点定向诱变改造以除去潜在的T细胞表位或淋巴细胞表位的突变体(参见Meyer等,ProteinSci2001;10:491-503);还可使用保留基本生物素结合活性或生物素结合活性增加的亲和素突变体和亲和素核心形式(参见Hiller等,JBiochem1991;278:573-85;Livnah等ProcNatlAcadSciUSA1993;90:5076-80);通过对亲和素进行化学修饰产生的变体,例如通过完全或部分磷酸化修饰产生的变体及其片段以及称为中性亲和素的完全去糖基化的亲和素变体;如WO05047317A1中所述的亲和素变体;如WO06045891中所述的亲和素样蛋白质;如WO0198349中所述的重组亲和素;如WO0027814中所述的亲和素变体;如WO06084388中所述的单体链霉亲和素;经修饰的链霉亲和素二聚体,例如WO06058226中所述的那些;如WO04018509中所述的生物素结合蛋白;如WO9840396中所述的具有较高生物素亲和力的链霉亲和素;如WO9640761中所述的经修饰的链霉亲和素与亲和素分子;如WO9711183中所述的链霉亲和素突变体;如WO9624606中所述的具有改进的亲和力的链霉亲和素;并且不同的亲和素变体是市售可得的,例如Extravidin(Sigma-Aldrich)、NeutrAvidin(ThermoScientific)、NeutrAvidin(Invitrogen)和NeutraLite(Belovo)。
在一些实施方案中,生物素化分子是氨基酸、肽、蛋白质、酪胺、多糖、离子络合部分、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、半抗原、补骨脂素、药物、激素、脂质、脂质组装体(lipidassembly)、聚合物、聚合物微米颗粒、生物细胞或病毒。更一般地,底物是肽、蛋白质、核苷酸、寡核苷酸或核酸。
在一个实施方案中,生物素化分子是氨基酸(包括被膦酸酯、碳水化合物或C1至C25羧酸保护或替代的那些),或者是氨基酸的聚合物例如肽或蛋白质。优选的肽缀合物包含至少5个氨基酸,更优选5至36个氨基酸。优选的肽包括,但不局限于,神经肽、细胞因子、毒素、蛋白酶底物和蛋白激酶底物。优选的蛋白质缀合物包括酶、抗体、凝集素、糖蛋白、组蛋白、白蛋白、脂蛋白、亲和素、链霉亲和素、蛋白A、蛋白G、藻胆蛋白以及其他荧光蛋白、激素、毒素、趋化因子和生长因子。在一个优选方面,缀合的蛋白质是藻胆蛋白,例如别藻蓝蛋白、藻青蛋白、藻红蛋白、别藻蓝蛋白B、B藻红蛋白和藻红蓝蛋白(phycoerythrocyanin)(例如,参见Roederer(1998)的美国专利No.5,714,386)。
在一个实施方案中,所述生物分子是抗体(包括完整抗体、抗体片段和抗体血清等)、氨基酸、制管张素或内皮抑制素、亲和素或链霉亲和素、生物素(例如,酰胺生物素(amidobiotin)、生物胞素、脱硫生物素等)、血液成分蛋白质(例如,白蛋白、纤维蛋白原、纤溶酶原等)、葡聚糖、酶、酶抑制剂、IgG结合蛋白(例如,蛋白A、蛋白G、蛋白A/G等)、荧光蛋白(例如,藻胆蛋白、水母发光蛋白、绿色荧光蛋白等)、生长因子、激素、凝集素(例如,麦胚凝集素、伴刀豆球蛋白A(conconavalinA)等)、脂多糖、金属结合蛋白(例如,钙调蛋白等)、微生物或其部分(例如,细菌、病毒、酵母等)、神经肽以及其他生物活性因子(例如,皮啡肽、deltropin、内啡素、内啡肽、肿瘤坏死因子等)、非生物微米颗粒(例如,铁磁液体、金、聚苯乙烯的微粒等)、核苷酸、寡核苷酸、肽毒素(例如,蜂毒明肽、银环蛇毒素、鬼笔环肽等)、磷脂结合蛋白(例如,膜联蛋白等)、小分子药物(例如,甲氨蝶呤等)、结构蛋白(例如,肌动蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、微管相关蛋白、微管蛋白等)或酪酰胺(tyramide)。
在另一个实施方案中,所述生物分子是核酸碱基、核苷、核苷酸、或核酸聚合物。优选的核酸聚合物是单链或多链的、天然或合成的DNA或RNA、DNA或RNA寡核苷酸,或DNA/RNA杂交体(hybrid),或者引入独特的接头例如吗啉衍生的磷酸盐/酯或肽核酸例如N-(2-氨基乙基)甘氨酸单元。当核酸是合成的寡核苷酸时,其一般包含少于50个核苷酸,更一般地少于25个核苷酸。
在另一个实施方案中,所述生物分子是碳水化合物,所述碳水化合物一般是多糖,例如葡聚糖、肝素、糖原、支链淀粉、甘露聚糖、菊粉、淀粉、琼脂糖和纤维素。或者,碳水化合物是为脂多糖的多糖。优选的多糖缀合物是葡聚糖或脂多糖聚合物。
在一些实施方案中,生物素结合分子以具有生物素类似物的复合物的形式提供,所述生物素类似物对生物素结合分子表现出的亲和力低于生物素。这些生物素类似物能够在不存在生物素的情况下与生物素结合分子结合。如果样品包含生物素化分子,生物素由于其对生物素结合位点具有更高的亲和力而从生物素结合分子置换类似物,从而导致最大发射强度降低,这归因于寡核苷酸-生物素(oligo-biotin)和链霉亲和素之间的相互作用。
合适的生物素类似物包括以大于1x10-13M的KD与生物素结合分子结合的化合物。在一些实施方案中,生物素类似物以如下KD与生物素结合分子结合:1×10-13M至1×10-8M、1×10-12M至1×10-9M,或1×10-11M至1×10-9M、10-13M至10-4M、10-12M至10-4、10-11M至10-4M、10-10M至10-4M、10-9M至10-4M、10-8M至10-4M、10-7M至10-4M,或10-6M至10-4M。适用于本发明的生物素类似物包括,但不局限于,HABA(4-羟基偶氮苯-2-羧酸)、2-叠氮基生物素、2-叠氮基生物素基腺苷酸、2-炔丙基(2-丙炔基)生物素、链霉素标签II肽序列(Trp-Ser-His-Pro-Glu-Phe-Glu-Lys)(SEQIDNO:1)(SchmidtTGM和SkerraA,NatureProt.2007,2,1528-1535)、2-亚氨基生物素、生物胞素(-生物素酰基-L-赖氨酸)、生物素乙二胺、生物素尸胺、生物素X尸胺、DSB-X脱硫生物包素(-脱硫生物素酰基-L-赖氨酸)以及DSB-X生物素乙二胺和氯代乙酰化生物素衍生物(CABI)或WO2012058635中所述的生物素类似物。
在一些实施方案中,生物素结合分子被结合至固体支持物。非限制性的示例性固体支持物包括聚合物(例如琼脂糖、琼脂糖凝胶、纤维素、硝化纤维素、海藻酸盐、Teflon、乳胶、丙烯酰胺、尼龙、塑料、聚苯乙烯、硅酮等)、玻璃、二氧化硅、陶瓷和金属。这样的固体支持物可采用任何形式,例如颗粒(包括微米颗粒)、片、蘸棒(dip-stick)、凝胶、过滤器、膜、微纤维带、管、孔、板(例如微孔板,包括6孔板、24孔板、96孔板、384孔板等)、纤维、毛细管、排管(comb)、移液器吸头、微阵列芯片等。在一些实施方案中,生物素结合部分与固体支持物的表面缔合。在一些实施方案中,固体支持物的表面包括不规则表面,例如多孔表面、颗粒表面、纤维状表面、网状表面或烧结的表面。
在一些实施方案中,固体支持物选自微孔板、微阵列芯片和微米颗粒。在一些实施方案中,固体支持物至少部分由聚合物构成。在一些实施方案中,微米颗粒固体支持物包含单分散或多分散的球形珠。单分散微米颗粒具有基本均匀的尺寸(即,它们的直径标准差小于5%),而多分散微米颗粒的尺寸不同。在一些实施方案中,微米颗粒始终由相同的聚合物构成,或者是芯-壳聚合物,其中微米颗粒的芯由一种聚合物构成,而外层(或“壳”)由另一种聚合物构成。在一些实施方案中,微米颗粒是磁性的。
在一些实施方案中,生物素结合部分通过生物素结合部分的氨基或巯基连接至固体支持物。在一些这样的实施方案中,固体支持物的表面包含能够与游离氨基或巯基反应的基团。非限制性的示例性的这样的基团包括羧基、活性卤素、活化的2-取代的乙基磺酰基、活化的2-取代的乙基羰基、活性酯、乙烯基磺酰基、乙烯基羰基、醛、环氧等。一些这样的基团可能需要使用另外的反应物来使该基团能够与游离氨基或巯基反应。非限制性的示例性的另外反应物包括溴化氰、羰基二咪唑、戊二醛、羟基琥珀酰亚胺、甲苯磺酰氯等。
很多固体支持物在本领域中是已知的,并且本领域技术人员可根据预期应用来选择合适的固体支持物。类似地,如果其表面连接有生物素结合部分的固体支持物不能商购得到,则本领域技术人员可选择合适的方法来将生物素结合部分连接至固体表面。示例性的这样的方法在例如美国公开No.US2008/022004Al中进行了描述。
接触步骤(i)在足以使生物素化分子与生物素结合分子结合的条件下进行。
术语“足以使结合的条件”指在此条件下生物素化分子可与生物素结合分子结合的条件,例如温度、盐浓度、pH和蛋白质浓度。精确的结合条件将根据测定性质而变化。应当理解,生物素化分子与生物素结合分子的结合无需100%结合。在一些实施方案中,基本100%是结合的,即至少50%是结合的,至少是结合的,至少75%是结合的,至少80%是结合的,至少85%是结合的或者至少95%是结合的。用于结合的温度可为15℃至37℃不等,但将优选为室温至约30℃。结合反应中的生物素结合分子或包含生物素结合分子和AQC-CTC的复合物的浓度不受特定限制。在一些实施方案中,浓度将不同,但将优选为约10pM至10nM。
在根据本发明之使用竞争性测定确定生物素化分子的方法的第二步中,确定AQC-CTC荧光发射的强度变化作为步骤(i)之接触的结果。本领域的技术人员应当理解所述强度是在存在生物素化分子的情况下唯一被改变的荧光发射参数。因此,在一些实施方案中,步骤(ii)中的确定并不涉及确定发射波长、确定荧光的平均寿命或确定电荷转移复合物的各向异性。
为了进行本发明方法的第二步,将在进行接触步骤(i)之后获得的样品用选定波长的光照射以提供可检测之光学响应,并用用于检测光学响应的工具进行观察。
技术人员应当理解从AQC-CTC获得荧光发射所需的激发波长将取决于所述方法中所使用的CTC的精确性质。激发波长可由技术人员通过常规技术确定。例如,可借助凝胶模型由近似值来确定簇激发波长和发射波长的近似估值(参见例如J.Calvo等,EncyclopediaofNanotechnology,B.Bhushan编辑,SpringerVerlag,2011)。该模型以相当接近的方式预测簇的禁止能带隙,并由此预测其发射带隙的位置。考虑到特定尺寸的簇中的斯托克斯位移是约50nm至100nm,继而可由发射带隙预测簇的激发带隙。下表(表1)示出了根据该模式之针对Au之AQC或Ag之AQC的理论数据,即已借助所述凝胶模型计算出Au之AQC或Ag之AQC的近似激发波长λexc.和发射波长λem.,其中误差为±50nm:Eem=EF/N1/3;其中Eem=发射能量;N=AQC中原子的数目;并且EF=费密能级,金和银的费密能级同为约5.5eV。
表1
簇 | λexc.(nm) | λem.(nm) |
A2 | 200-250 | 300 |
A3 | 240-290 | 340 |
A4 | 270-320 | 370 |
A5 | 300-350 | 400 |
A6 | 325-375 | 425 |
A7 | 350-400 | 450 |
A10 | 400-450 | 500 |
A12 | 440-490 | 540 |
A15 | 475-525 | 575 |
A20 | 535-585 | 635 |
A25 | 580-630 | 680 |
A30 | 630-680 | 730 |
A40 | 700-750 | 800 |
可用于照射本发明的染料化合物的仪器包括,但不局限于,手提式紫外线灯、汞弧灯、氙气灯、激光器和激光二极管。任选地,这些照射源(illuminationsource)被整合到激光扫描仪、荧光微孔板阅读器、标准或小型荧光计,或色谱探测器中。
相对于在空白样品(即缺乏任何生物素或生物素化分子的样品)存在下的CTC荧光或相对于在与样品接触之前的荧光,样品中生物素或生物素化分子的存在导致CTC发射的荧光强度降低。
本文中使用的术语“荧光降低”指荧光强度的降低。在一些实施方案中,在存在生物素化生物分子或生物素的情况下,样品的荧光降低至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少100%,即相对于在不存在生物素化分子的情况下的荧光(即相对于不包含任何生物素或生物素化分子的样品的荧光)或相对于在加入样品之前的荧光发射,该荧光是不可检测的。
任选地,通过肉眼检查或通过使用下列任意装置来检测光学响应:CCD照相机、摄影机、感光胶片、激光扫描装置、荧光计、光电二极管、量子计数器、落射荧光显微镜、扫描显微镜、流式细胞仪、荧光微孔板阅读器或通过放大信号的工具例如光电倍增管。当使用流式细胞术检测样品时,任选地所述样品的检测包括根据其荧光响应分选部分样品。
包含AQC-CTC和生物分子的缀合物
上述CTC-AQC可通过具有通式HO-(CH2)m-COOH的ω-羟基酸配体和具有通式HS-(CH2)p-COOH)的ω-巯基酸的存在进行进一步修饰。有机配体中的羟基和巯基与AQC中的金属原子相互作用。由于有机配体的两亲性,羧基暴露在复合物的外部,因此可用于与蛋白质、核酸以及其他生物分子缀合。这些缀合物特别适合作为荧光探针、生物标志物或造影剂。这些纳米系统可用于体外和体内两种生物学系统中。
在另一个实施方案中,本发明涉及一种缀合物,其包含生物分子和通式(I)的至少两个不同尺寸的金属AQC(Mn和M’n’)的电荷转移复合物:
Mn +M’n’ -(I),
其中
所述金属AQC的金属M和M’是相同金属或不同金属,
Mn是以其氧化形式Mn +存在的较小AQC,
M’n’是以其还原形式M’n’ -存在的较大AQC,
Mn +和M’n’ -通过静电相互作用结合,
n和n’分别为M和M’的金属原子数目,并且
n小于n’,
其中所述缀合物还包含与所述原子量子簇(M和M’)连接的ω-羟基酸配体和ω-巯基酸配体,并且其中所述生物分子与所述ω-羟基酸配体和/或所述ω-巯基酸配体连接。
在一些实施方案中,金属AQC中的金属M和M’选自过渡金属或其组合,优选地过渡金属选自Au、Ag、Co、Cu、Pt、Fe、Cr、Pd、Ni、Rh及其组合,更优选地它们选自Au、Ag、Cu及其组合,并且更优选地过渡金属选自Au、Ag及其组合。
由于荧光的激发和发射波长取决于AQC的尺寸,因此可通过指导形成所需尺寸的AQC来选择激发和发射波长。
在一个优选实施方案中,只有一个电子在至少两个AQC(Mn和M’n’)之间转移,从而产生离子形式Mn +(即Mn的氧化形式)和M’n’ -(M’n’的还原形式),其中“+”是正电荷而“-”是负电荷。
在一些实施方案中,n和n’是2至309、2至102、2至55或2至25个金属原子。在一些实施方案中,n与n’之间的差异是5至50个原子。
在另一个实施方案中,n与n’之间的差异是5至50个原子或5至25个原子。
在一些实施方案中,ω-羟基酸具有通式HO-(CH2)m-COOH,其中m的值是2至30。
在一些实施方案中,ω-巯基酸具有通式HS-(CH2)p-COOH,其中p的值是2至30。
在一些实施方案中,m和p的值是10至20。在一个具体实施方案中,m和p的值是15。在另一个具体实施方案中,m和p的值是11。m和p的值可以是不同的或相同的。在m和p不同的情况下,它们之间的差异小于6个碳,优选地,m和p的差值是1至4。在一个优选实施方案中,m和p是相同的。其中所述至少两种不同类型的有机配体选自ω-羟基酸(HO-(CH2)m-COOH)配体和ω-巯基酸(HS-(CH2)p-COOH)配体,酸基团-COOH(或-COO-,如果使用相应酸的盐的话)朝向纳米化合物的外表面,而-OH和-SH基团朝向内部,即朝向电离的AQC(Mn+和M’n’ -),与电离的AQC相结合、连接或配位。
在另一个实施方案中,可与电荷转移复合物连接的“有机配体”具有除羟基-OH或巯基-SH基团之外的其他官能团,例如-NH2、-NH-、-Cl、-PH3、-SR、-OR、-NR2、-NHR、-NR-,其中R表示能够与AQC或电离的AQC(Mn+和M’n’ -)结合、连接或配位的短烃链(C1-C4)有机基团。还可将ω-羟基酸(HO-(CH2)m-COOH)配体和ω-巯基酸(HS-(CH2)p-COOH)配体的羟基-OH或巯基-SH基团替换成上文提及之也与AQC中的金属相互作用的这些其他基团。
可掺入到根据本发明之缀合物中的合适生物分子包括以上在使用AQC-CTC检测生物素化分子的竞争性测定的背景下提及的任何生物分子。在一个优选实施方案中,所述生物分子选自核酸、多糖和多肽。优选地,所述生物分子是抗体。
使用经CTC-AQC可检测标记的结合伴侣检测生物分子的方法
使用包含生物分子和CTC-AQC的缀合物通过根据该生物分子与结合伴侣间形成之复合物中的CTC-AQC荧光发射来检测该生物分子的任何结合伴侣。因此,在另一方面,本发明涉及用于检测样品中的靶分子的方法,其包括以下步骤:
(i)使所述样品与根据本发明的缀合物接触,其中在足以使该生物分子与所述结合伴侣结合的条件下,该缀合物的生物分子与所述靶分子特异性结合,以及
(ii)检测在所述生物分子与所述靶分子之间形成的复合物。
在第一步中,所述方法包括使怀疑包含靶分子的样品与包含AQC之电荷转移复合物和作为所述靶分子之结合伴侣的生物分子的缀合物接触,其中该接触步骤在足以使生物分子与所述生物分子特异性结合之部分结合的条件下进行。
在一些实施方案中,金属AQC中的金属M和M’选自过渡金属或其组合,优选地过渡金属选自Au、Ag、Co、Cu、Pt、Fe、Cr、Pd、Ni、Rh及其组合,更优选地它们选自Au、Ag、Cu及其组合,并且更优选地过渡金属选自Au、Ag及其组合。
由于荧光的激发和发射波长取决于AQC的尺寸,因此可通过指导形成所需尺寸的AQC来选择激发和发射波长。
在一个优选实施方案中,只有一个电子在至少两个AQC(Mn和M’n’)之间转移,从而产生离子形式Mn +(即Mn的氧化形式)和M’n’ -(M’n’的还原形式),其中“+”是正电荷而“-”是负电荷。
在一些实施方案中,n和n’是2至309、2至102、2至55或2至25个金属原子。在一些实施方案中,n与n’之间的差异是5至50个原子。
在另一个实施方案中,n与n’之间的差异是5至50个原子或5至25个原子。
在一些实施方案中,ω-羟基酸具有通式HO-(CH2)m-COOH,其中m的值是2至30。
在一些实施方案中,ω-巯基酸具有通式HS-(CH2)p-COOH,其中p的值是2至30。
在一些实施方案中,m和p的值是10至20。在一个具体实施方案中,m和p的值是15。在另一个具体实施方案中,m和p的值是11。m和p的值可以是不同的或相同的。在m和p不同的情况下,它们之间的差异小于6个碳,优选地,m和p的差值是1至4。在一个优选实施方案中,m和p是相同的。其中所述至少两种不同类型的有机配体选自ω-羟基酸(HO-(CH2)m-COOH)配体和ω-巯基酸(HS-(CH2)p-COOH)配体,酸基团-COOH(或-COO-,如果使用相应酸的盐的话)朝向纳米化合物的外表面,而-OH和-SH基团定向于内部,即朝向电离的AQC(Mn+和M’n’ -),与电离的AQC相结合、连接或配位。
在另一个实施方案中,可与电荷转移复合物连接的“有机配体”具有除羟基-OH或巯基-SH基团之外的其他官能团,例如-NH2、-NH-、-Cl、-PH3、-SR、-OR、-NR2、-NHR、-NR-,其中R表示能够与AQC或电离的AQC(Mn +和M’n’ -)结合、连接或配位的短烃链(C1-C4)有机基团。还可将ω-羟基酸(HO-(CH2)m-COOH)配体和ω-巯基酸(HS-(CH2)p-COOH)配体的羟基-OH或巯基-SH基团替换成上文提及的也与AQC中的金属相互作用的这些其他基团。
合适的生物分子和靶分子对如表2中所示。
表2:本发明方法中所采用的代表性结合对。IgG是一种免疫球蛋白;cDNA和cRNA是用于杂交的反义(互补)链。
应当认识到,如果待检测的靶分子是左手列中所提及的任何分子,那么用CTC-AQC可检测地标记的生物分子如右手列中所限定的。反之,如果待检测的靶分子是右手列中所提及的任何分子,那么用AQC之电荷转移复合物可检测地标记的生物分子如左手列中所限定的。
在一些实施方案中,生物分子与靶分子共价结合。在一些实施方案中,生物分子与靶分子非共价结合。
在一些实施方案中,待检测的靶分子是抗原或半抗原,在此情况下用AQC之电荷转移复合物可检测地标记的生物分子是特异性结合所述抗原的抗体。在另一些实施方案中,待检测的靶分子是抗体,在此情况下用AQC之电荷转移复合物可检测标记的生物分子是所述抗体识别的抗原。
在一些实施方案中,待检测靶分子是核酸,在此情况下用AQC之电荷转移复合物可检测地标记的生物分子是与所述核酸特异性杂交的核酸。本文中使用的术语“特异性杂交”指允许两个多核苷酸在高严格条件或中等严格条件下杂交的情况。杂交反应的“严格性”可容易地由本领域的普通技术人员确定并且一般是基于探针长度、洗涤温度和盐浓度的经验计算值。一般情况下,较长的探针需要较高的温度来进行适当退火,而较短的探针需要较低的温度。当互补链存在于比其解链温度低的环境中时,杂交一般依赖于变性DNA再退火的能力。探针与可杂交序列之间的预期同源性程度越高,可使用的相对温度越高。因此,由此可见较高的相对温度往往使反应条件更严格,而较低的温度则使反应条件较不严格。有关杂交反应严格性的更多细节和解释,参见Ausubel等,CurrentProtocolsinMolecularBiology,WileyIntersciencePublishers,(1995)。
适合促进生物分子与样品中之结合伴侣结合的条件可由本领域技术人员基于本文中的教导和下文提供的实施例确定。例如,抗体-抗原结合通常依赖于疏水相互作用(所谓的疏水键);因此,可使用高盐浓度(例如摩尔范围的高盐浓度)来降低非特异性结合并增加特异性的抗原-抗体结合。
对于生物学应用,样品与针对靶生物分子之结合伴侣的接触步骤在根据本领域中公知的方法制备的水性溶液、主要水性溶液或水混溶性溶液中进行。可检测的标记的结合伴侣的精确浓度取决于实验条件和期望结果,但是其范围一般是约1纳摩尔至1毫摩尔或更高。通过系统变化来确定最佳浓度直至达到具有最小背景荧光的满意结果。
在第二步中,使用根据本发明之缀合物检测靶分子的方法包括检测经AQC之电荷转移复合物可检测地标记的生物分子和靶分子之间的复合物形成。
复合物形成的检测可通过检测AQC之电荷转移复合物在以合适波长激发时发射的荧光来进行。
通常,在使复合物与样品中仍存在的任何未结合的可检测的经标记生物分子分离之后进行复合物的检测。技术人员可使用不同的方法来使复合物与样品中仍存在的任何未结合的可检测的经标记生物分子分离。
在一些实施方案中,靶分子被固定在支持物中,这样允许通过使支持物与样品分离来回收与可检测的经标记生物分子形成的复合物。可用于固定结合伴侣的合适支持物包括,但不局限于,以上在根据本发明之竞争性测定的背景下所定义的任何那些支持物。
在一些实施方案中,使用针对靶分子的第二结合伴侣来进行复合物与任何未结合之可检测的经标记结合伴侣的分离,所述第二结合伴侣不同于用CTC-AQC可检测地标记的生物分子。这样能够回收包含可检测的经标记的生物分子、靶分子和第二结合伴侣的三元复合物。例如,如果待检测的靶分子是多肽并且可检测的经标记的生物分子是抗体,则可使用对靶分子具有特异性的第二抗体来分离多肽与可检测标记生物分子之间的复合物,并且所述第二抗体识别靶分子不同区域从而避免第二抗体与靶分子的结合被空间位阻阻止。在一些实施方案中,靶分子包含标签。可用于本发明中的合适标签包括,但不局限于,基于肽的标签。一般将标签置于多肽的氨基端或羧基端。多种标签多肽及其各自的抗体在本领域中是公知的。实例包括聚-组氨酸(poly-his)或聚-组氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)标签;流感HA标签多肽及其抗体12CA5(Field等,MolCellBiol,1988;8:2159-2165);c-myc标签以及针对其的8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗体(Evan等,MolecularandCellularBiology1985;5:3610-3616);单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签及其抗体(Paborsky等,ProteinEngineering1990;3:547-553)。其他的标签多肽包括Flag-肽(Hopp等,BioTechnology1988;6:1204-1210);KT3表位肽[Martin等,Science1993;255:192-194];微管蛋白表位肽(Skinner等,JBiolChem1991;266:15163-15166);和T7基因10蛋白肽标签(Lutz-Freyermuth等,ProcNatlAcadSciUSA1990,;87:6393-6397)。在一个优选实施方案中,纯化标签是多聚组氨酸标签。在一个更优选的实施方案中,纯化标签是六聚组氨酸标签。
在一些实施方案中,在使复合物与任何未结合的可检测的经标记生物分子分离之后,将复合物至少洗涤一次以除去过量的经标记生物分子。洗涤步骤可根据生物分子和结合伴侣以任何合适的方式进行。可将样品用任何合适的介质(例如,缓冲液例如PBS)洗涤。所述介质可包含洗涤剂,例如Tween20。可将样品洗涤任何合适的时间,例如每次洗涤1至30分钟或3至10分钟。洗涤可包括缓慢振荡或摇动所述细胞的载体。洗涤温度使得细胞可存活下来并且不破坏结合。例如,洗涤温度可以是20℃至45℃或30℃至40℃。通常,洗涤温度是约37℃或室温。适用于洗涤生物分子与结合伴侣的复合物的方案在本领域中是公知的。
检测可检测的经标记生物分子与靶分子间的复合物涉及检测与靶分子有关的AQC-CTC荧光发射。如果检测到荧光发射,这意味着步骤(ii)中已回收到可检测量的生物分子以及靶分子,并由此意味着样品包含靶分子。
在一些实施方案中,可通过Western印迹来进行靶分子的检测,在此情况下将靶分子通过凝胶电泳分离、转移至印迹膜并与可检测的经标记生物分子接触。或者,在一些实施方案中,使靶分子与生物分子接触并随后在其中维持生物分子与靶分子的相互作用的条件下分离。然后,可通过测量用于分离复合物的支持物内的荧光来检测复合物。分离可通过任何合适的方式进行,例如电泳或色谱。在一些实施方案中,复合物的分离通过凝胶电泳来进行,在此情况下通过凝胶内荧光检测来进行检测。
适用于激发AQC之电荷转移复合物的方式和条件以及用于检测AQC之电荷转移复合物的荧光发射的方式和条件已在根据本发明之竞争方法的背景中进行了描述,并且同样适用于本发明的方法。
用于制备包含生物分子和AQC之电荷转移复合物的复合物的方法
在另一方面,本发明涉及用于制备包含生物分子和AQC之电荷转移复合物的缀合物的方法。AQC之电荷转移复合物通过ω-羟基酸配体和ω-巯基酸配体稳定,其中AQC与有机配体中的ω-羟基和ω-巯基基团结合,使羧基暴露,其随后可用于与目的分子偶联。
因此,在另一方面,本发明涉及用于制备根据本发明之电荷转移复合物与生物分子的缀合物的方法,所述方法包括使已用第一反应基团在其表面上官能化的AQC之电荷转移复合物与包含可与第一反应基团反应之第二反应基团的生物分子反应。
AQC之电荷转移复合物包含含有羧基的有机酸,所述羧基暴露于AQC的外部。因此,在一些实施方案中,可直接活化羧基以引入可与生物分子中的对应反应基团反应的反应基团。AQC之电荷转移复合物的有机酸中可引入的代表性反应基团包括,但不局限于,羧酸基团、羧酸活性酯(例如,N-羟基琥珀酰亚胺酯)、马来酰亚胺基团、反应性氨基甲酸酯和硫代氨基甲酸酯基团,以及α-卤代乙酰胺基团(-NH-C(-O)-CH2-X)。其他合适的官能团包括能够偶联环加成的基团(例如,提供4+2环加成产物的双烯和亲双烯体,以及乙炔和叠氮化物(点击化学))。在一个实施方案中,反应基团是羧酸基团(-CO2H)或其活性酯(N-羟基琥珀酰亚胺酯)。
羧酸基团和羧酸活性酯对氨基具有反应性,所述氨基包括蛋白质和肽中之赖氨酸残基的氨基和寡核苷酸探针中引入的伯氨基(-C(-O)-NH-键)。马来酰亚胺基团对蛋白质、肽和寡核苷酸天然的或其中引入的巯基具有反应性(-N[C(-O)CH2CHC(-O)]-S-键)。反应性氨基甲酸酯和硫代氨基甲酸酯基团与氨基反应以提供脲键(-NH--C(-O)-NH-)和硫脲键(-NH-C(-S)-NH-)。α-卤代乙酰胺基团与硫醇基反应以提供-NH-C(-O)-CH2-S-键。能够通过环加成作用缀合的官能团包括反应以形成4+2环加成键的双烯(例如,呋喃)和亲双烯体(例如,烯烃和炔烃)。可将接头臂修饰成包含分别对互补反应物质(例如,生物分子)天然的或其中引入的亲双烯体和双烯具有反应性的双烯或亲双烯体。还可利用点击化学来进行缀合。可将接头臂修饰成包含分别对互补反应物质(例如,生物分子)天然的或其中引入的叠氮化物或乙炔具有反应性的合适乙炔(例如H-C=C-R)或叠氮化物(例如,R’-N-N+-N-)。
在一些实施方案中,缀合通过使有机酸或其活性酯中天然存在的羧酸基团与生物分子中存在的氨基反应来进行。活化酯的实例包括,但不局限于N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯、对-磺基-四氟苯酚酯、五氟苯酯、四氟苯酯、对-硝基苯酯、2,4-二硝基苯酯、4-硝基苯酯、3-羟基-3,4-二氢-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪(HODhbt);使用常见的碳二亚胺活化的羧酸,所述碳二亚胺例如但不局限于二异丙基碳二亚胺(DIPCDI)、N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3’-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC);和用脲盐或盐活化的羧酸,例如但不局限于0-苯并三唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、O-(苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)、2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基铵六氟磷酸盐(HCTU)、(2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-基、1,3,3-四甲基铵四氟硼酸盐(TCTU)、2-(1H-7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)、1-苯并三唑氧三-(二甲基氨基)六氟磷酸盐(BOP)、苯并三唑-1-基-氧三吡咯烷基六氟磷酸盐(PYBOP);或其组合。在一个优选实施方案中,使用碳二亚胺,优选EDC来活化羧酸。
当生物分子是多肽时,反应性氨基天然存在于赖氨酸残基中,从而允许生物分子缀合而无需进行进一步修饰。当生物分子是多核苷酸时,在一个实施方案中,可通过并入氨基来对生物分子进行修饰。这通常在合成多核苷酸期间使用经氨基修饰的寡核苷酸来进行。用于向所选择的多核苷酸中引入氨基的方法已在即WO2011131693;KojimaN.和KomatsuY.,(Curr.Protoc.NucleicAcidChem.2012年3月;第4章:第4.48.1-23.单元doi:10.1002/0471142700.nc0448s48)和VasilyevaSV等(NucleosidesNucleotidesNucleicAcids.2011;30:753-67)中进行了描述。当生物分子是寡糖或多糖时,可通过还原性胺化来插入氨基,如例如US5306492和Porro等,(Mol.Immunol.,1985,22:907-919)中所述。
AQC之电荷转移复合物中的反应基团可与有机酸中的羧基直接偶联,或者作为替代,通过间隔基团(spacergroup)或连接基团(linkergroup)与该基团连接,以避免AQC和生物分子中的反应基团之间的反应被空间位阻阻止。类似地,待与反应基团缀合的生物分子还可在该生物分子的骨架之间包含间隔基团以阻止所述反应。在一些实施方案中,连接至生物分子的反应基团和通过有机酸连接至AQC的对应反应基团两者都包含连接基团。合适的连接部分包括1至约50个选自碳、氮、氧、氢和卤素的原子。代表性基团包括亚烷基(例如-(CH1)n-,其中n是1至12)、亚苯基(例如,邻-、间-、和对-C6H4-)和烯化氧基团(例如,环氧乙烷-(CH2CH2O)m-,其中m是1至5)。其他的合适基团包括-C(=A1)-L1-、-C(=A1)NH-L1-、-C(=A1)NH-L1-NH-,其中A1选自O和S,并且L1是上述任意连接基团。
使用保护基团可以以保护形式提供活化的AQC之电荷转移复合物。保护基团的实例可见于T.W.Greene和P.G.Wuts,PROTECTIVEGROUPSINORGANICCHEMISTRY,(Wiley,第2版1991);Beaucage和Iyer,Tetrahedron48:2223-2311(1992);以及Harrison和Harrison等,COMPENDIUMOFSYNTHETICORGANICMETHODS,第1-8卷(JohnWiley和Sons.1971-1996)中。代表性的氨基保护基团包括甲酰基、乙酰基、三氟乙酰基、苄基、苄氧羰基(CBZ)、叔-丁氧基羰基(Boc)、三甲基甲硅烷基(TMS)、2-三甲基甲硅烷基-乙磺酰基(SES)、三苯甲基和取代的三苯甲基、烯丙氧基羰基、9-芴基甲氧基羰基(FMOC)、硝基-藜芦基氧基羰基(NVOC)等(还参见,Boyle,A.L.(编辑),CURRENTPROTOCOLSINNUCLEICACIDCHEMISTRY,JohnWileyandSons,NewYork,第1卷,2000)。代表性的羟基保护基团包括其中羟基被酰基化或烷基化的那些,例如苄基和三苯甲基醚以及烷基醚、四氢吡喃基醚、三烷基甲硅烷基醚和烯丙基醚。另外,羟基可被光可去除基团例如a-甲基-6-硝基胡椒基氧基羰基保护(McGall,G.H.和Fidanza,J.A.,Photolithographicsynthesisofhigh-densityolignucleotidearrays,在DNAARRAYSMETHODSANDPROTOCOLS中,由RampalJ.B.编辑,METHODSINMOLECULARBIOLOGY,170:71-101(2001),HumanaPress,Inc.,NY;Boyle,AnnL.(编辑),CurrentProtocolsinNucleicAcidChemistry,JohnWiley和Sons,NewYork,第1卷,2000)。
用于标记细胞内组分的方法
在另一个实施方案中,本发明涉及用于体内标记细胞内组分的方法,其包括:使一种或更多种细胞内组分与包含AQC-CTC和特异性结合所述细胞内组分的生物分子的缀合物接触,从而允许通过显微术来检测一种或更多种细胞内组分。
在一个实施方案中,生物分子是特异性结合在一个或更多个细胞内区室表达之多肽的多肽,在此情况下根据本发明之包含AQC-CTC的缀合物可用于免疫组织化学。
在另一个实施方案中,生物分子是与目的核酸序列特异性杂交的核酸,在此情况下根据本发明之包含AQC-CTC的缀合物可用于荧光原位杂交(FISH)。通常,FISH方法包括以下步骤:(a)将所研究的组织或其他生物材料固定至支持物(例如,玻璃载玻片或微量滴定孔的壁),(b)处理所述组织或材料以提高FISH探针对靶核酸的可及性,(c)使包含靶核酸的组织或材料与探针接触以形成特定的杂交复合物,(d)在杂交后洗涤复合物以选择性地除去未与靶标特异性杂交的探针和(e)检测已与靶核酸分子形成杂交复合物的探针。这样的方法描述在很多资源中,包括:Gall和Pardue,(1981)MethodsofEnzymology21:470-480;Henderson,(1982)InternationalReviewofCytology,76:1-46;和Angerer,等,(1985)在GeneticEngineering:PrinciplesandMethods(Setlow和Hollaender,编辑)第7卷,第43-65页,PlenumPress,NewYork中。
在一些实施方案中,所述生物分子选自多肽和核酸。在一个仍更优选的实施方案中,所述多肽是抗体。
可使所述缀合物以有利于染料化合物与目的样品成分接触的任何方式与样品接触。通常,简单地将所述缀合物或包含所述缀合物的溶液添加至样品。本发明的某些结合伴侣往往不能透过生物细胞的膜,因此一旦在活细胞内就通常被良好滞留。可使用使质膜透化的处理(例如电穿孔、休克处理或高细胞外ATP)来将结合伴侣导入细胞中。或者,可将结合伴侣物理插入细胞中,例如通过压力微注射、划痕负载(scrapeloading)、膜片钳方法或吞噬。
可使用来自对象的任何组织样品。可使用的组织样品的实例包括,但不局限于,乳腺、前列腺、卵巢、结肠、肺、子宫内膜、胃、唾腺或胰腺。组织样品可通过多种方法获得,包括但不局限于手术切除、抽吸或活检。组织可以是新鲜的或冷冻的。在一个实施方案中,组织样品被固定和包埋在石蜡等中。组织样品可通过常规方法固定(即保存)[参见例如,“ManualofHistologicalStainingMethodoftheArmedForcesInstituteofPathology,”第3版(1960)LeeG.Luna,HT(ASCP)编辑,TheBlakstonDivisionMcGraw-HillBookCompany,NewYork;TheArmedForcesInstituteofPathologyAdvancedLaboratoryMethodsinHistologyandPathology(1994)UlrekaV.Mikel,编辑,ArmedForcesInstituteofPathology,AmericanRegistryofPathology,Washington,D.C。作为实例,可使用中性缓冲的福尔马林、布安液(Bouin′s)或多聚甲醛来固定组织样品。
与细胞成分相关的CTC-AQC的检测可通过下列任意装置来进行:CCD照相机、摄影机、感光胶片、激光扫描装置、荧光计、光电二极管、量子计数器、落射荧光显微镜、扫描显微镜、流式细胞仪、荧光微孔板阅读器或通过放大信号的工具例如光电倍增管。当使用流式细胞仪来检测样品时,样品检测任选地包括根据其荧光响应分选部分样品。
***
通过以下实施例对本发明进行描述,这些实施例应被理解为仅仅是举例说明的,而非对本发明的范围进行限制。
实施例
试剂
链霉亲和素(来自阿维丁链霉菌,经亲和纯化的,≥13U/mg)和寡核苷酸-生物素(36bp寡核苷酸-生物素,AACACCGCAGCATGTCAAGATCACACATTTTGGGCG[bTNtG])(SEQIDNO:2)购买自Sigma-aldrich并可不经进一步纯化而使用,按照文献和生产商所建议的制备储备液:水中的0.5mg/ml链霉亲和素和TE缓冲液(tris-EDTA缓冲液,pH=8.0,Fluka)中的lnM寡核苷酸-生物素。
通过标准方案合成AQC-CTC。在剧烈搅拌下,在5.4ml水和所需体积的四丁基氢氧化铵(水中40%,Fluka)中将16-羟基棕榈酸(98%,Aldrich)的水溶液(2ml,10mg/ml)与16-巯基棕榈酸(90%,Aldrich)的水溶液(0.622ml,10mg/mL)混合,直至成为基本平均。向得到的纳米微脂囊溶液添加400μL体积的HAuCl4.3H2O(氯化Au(III)水合物,99.999%金属碱,Aldrich)(5.8mg/ml)溶液,随后通过加入400μLNaBH4(96%,Aldrich)溶液(0.05M)还原。将该溶液在35℃下搅拌1小时。为了得到AQC-CTC,将该溶液在BeckmanAir-Driven超速离心机中以90,000rpm超速离心1小时,获得作为上清液分离的AQC-CTC。这一超速离心步骤是破坏之前合成的纳米微脂囊的去稳定过程。所述步骤是由不同尺寸的AQC获得AQC-CTC所必需的。
实施例1:用AQC-CTC的链霉亲和素荧光增强进行生物素化寡核苷酸检
测
如表1所示,制备三种不同的溶液,其包含15μlAQC-CTC(150mg/l)、55μL链霉亲和素溶液(在水中0.5mg/ml)和递增量的寡核苷酸-生物素溶液(在TE缓冲液中1nM)。孵育1小时后,测量每个样品的荧光。
表3
图1示出了不同溶液在250nm激发下的发射光谱(用CaryEclipseVarian荧光分光光度计在光通路为3×3mm且体积为45μl的石英比色皿(quartzcell)中测量),所述不同溶液为:(A)AQC-CTC与链霉亲和素;(B)AQC-CTC与链霉亲和素和0.1mmol寡核苷酸-生物素;和(C)AQC-CTC与链霉亲和素和0.5mmol寡核苷酸-生物素。该光谱显示在600nm下具有发射最大值,该发射最大值在添加寡核苷酸-生物素的情况下降低,当寡核苷酸-生物素的量增加时,发射最大值更低。
实施例2:用AQC-CTC的链霉亲和素/HABA荧光增强/猝灭进行生物素
化寡核苷酸检测
如表2所示,如下制备两种溶液:向特定体积的链霉亲和素溶液(0.5mg/ml)添加0.25μlHABA溶液(10mM)和0.5μlAQC-CTC溶液(约150mg/l)。然后,向溶液B添加0.5μl寡核苷酸-生物素溶液(1nM)并将两种样品孵育30分钟。
表4
Vstrept/μl | VHABA/μl | VOligo/μl | VAQC/μl | |
A | 49.26 | 0.25 | 0 | 0.5 |
B | 48.76 | 0.25 | 0.5 | 0.5 |
图2示出了不同溶液在250nm激发下的发射光谱(用CaryEclipseVarian荧光分光光度计在光通路为3×3mm且体积为45μl的石英比色皿中测量),所述不同溶液为:(A)AQC-CTC与HABA和链霉亲和素;以及(B)AQC-CTC与HABA、链霉亲和素和0.5μl寡核苷酸-生物素。如图2中所示,添加寡核苷酸-生物素导致最大发射强度降低,这归因于寡核苷酸-生物素与链霉亲和素之间的相互作用。
实施例3.用于使蛋白质分子与纳米微脂囊偶联的方法
将新鲜制备的N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)水溶液添加至纳米微脂囊在pH9硼酸盐缓冲液中的溶液。在适度搅拌5分钟后,添加pH9硼酸盐缓冲液中的蛋白质溶液。继续搅拌2小时并将最终的蛋白质-纳米微脂囊缀合物通过离心超滤纯化。
Claims (34)
1.复合物,其包含生物素结合分子和通式(I)的至少两个不同尺寸的金属原子量子簇(AQC)Mn和M’n’的电荷转移复合物(CTC):
Mn +M’n′ -(I),
其中
所述金属AQC的金属M和M’是相同金属或不同金属,
Mn是以其氧化形式Mn +存在的较小AQC,
M’n’是以其还原形式M’n’ -存在的较大AQC,
Mn +和M’n’ -通过静电相互作用结合,
n和n′分别为M和M’的金属原子数目,并且
n小于n′,
其中所述生物素结合分子与所述电荷转移复合物不共价结合。
2.根据权利要求1所述的复合物,其中所述生物素结合分子是链霉亲和素或其功能等效变体。
3.根据权利要求1或2所述的复合物,其中所述金属M和M’独立地选自过渡金属或其组合。
4.根据权利要求3所述的复合物,其中所述金属M和M’独立地选自过渡金属Au、Ag、Cu及其组合,更优选Au、Ag及其组合。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的复合物,其中n和n′为2至309、2至102、2至55或2至25个金属原子。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的复合物,其中n和n’的差为5至50个原子。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的复合物,其中所述电荷转移复合物还包含与所述原子量子簇Mn和M’n’连接的ω-羟基酸配体和ω-巯基酸配体。
8.根据权利要求7所述的复合物,其中所述ω-羟基酸具有通式(HO-(CH2)m-COOH),其中m值为2至30,和/或其中所述ω-巯基酸具有通式HS-(CH2)p-COOH配体,其中p值为2至30。
9.成套试剂盒,其包含一起的或分开的:
(i)至少两个不同尺寸的金属原子量子簇(AQC)Mn和M’n’的电荷转移复合物,其中所述电荷转移复合物具有权利要求1中限定的式I,并且其中所述金属AQC的M和M’是相同金属或不同金属,Mn是以其氧化形式Mn +存在的较小AQC,M’n’是以其还原形式M’n’ -存在的较大AQC,Mn +和M’n’ -通过静电相互作用结合,n和n’分别为金属原子的数目,以及
(ii)生物素结合分子。
10.用于检测样品中的生物素化分子的方法,其包括以下步骤:
(i)使所述样品与根据权利要求1至4中任一项所述的复合物在足以使所述生物素化分子与所述复合物中的生物素结合分子结合的条件下接触,以及
(ii)在步骤(i)的所述接触之后检测在AQC的激发波长下响应于所述样品的激发的所述AQC的荧光发射强度的变化,
其中所述接触步骤之后,所述AQC发射的荧光强度的降低指示所述样品中存在生物素化分子。
11.根据权利要求10所述的方法,其中所述生物素化分子是核酸、多肽或多糖。
12.根据权利要求10或11所述的方法,其中所述生物素结合分子以具有生物素类似物的复合物提供,所述生物素类似物示出的对于生物素结合分子的亲和力低于生物素。
13.根据权利要求12所述的方法,其中所述生物素类似物是4-羟基偶氮苯-2-羧酸(HABA)。
14.缀合物,其包含生物分子和通式(I)的至少两个不同尺寸的金属AQCMn和M’n’的电荷转移复合物:
Mn +M’n′ -(I),
其中
所述金属AQC的金属M和M’是相同金属或不同金属,
Mn是以其氧化形式Mn +存在的较小AQC,
M’n’是以其还原形式M’n’ -存在的较大AQC,
Mn +和M’n’ -通过静电相互作用结合,
n和n′分别为M和M’的金属原子数目,并且
n小于n′,
其中所述缀合物还包含与所述原子量子簇M和M’连接的ω-羟基酸配体和ω-巯基酸配体,并且其中所述生物分子与所述ω-羟基酸配体和/或所述ω-巯基酸配体共价连接。
15.根据权利要求14所述的缀合物,其中所述生物分子选自核酸、多糖和多肽。
16.根据权利要求15所述的缀合物,其中所述多肽生物分子是抗体。
17.根据权利要求14至16中任一项所述的缀合物,其中所述金属M和M’独立地选自过渡金属或其组合。
18.根据权利要求17所述的缀合物,其中所述过渡金属选自Au、Ag和Cu。
19.根据权利要求14至18中任一项所述的缀合物,其中n和n’为2至309、2至102、2至55或2至25个金属原子。
20.根据权利要求14至19中任一项所述的缀合物,其中n和n’的差为5至50个原子。
21.根据权利要求14至20中任一项所述的缀合物,其中所述ω-羟基酸具有通式(HO-(CH2)m-COOH),其中m的值为2至30,和/或其中ω-巯基酸具有通式HS-(CH2)p-COOH配体,其中p的值为2至30。
22.用于制备根据权利要求14至21中任一项所述的缀合物的方法,其包括使已在其表面被第一反应基团官能化的AQC的电荷转移复合物与包含可与所述第一反应基团反应之基团的生物分子反应。
23.根据权利要求22所述的方法,其中所述生物分子中的所述基团在所述反应步骤之前已经通过所述生物分子对的预官能化引入。
24.根据权利要求22或23所述的方法,其中所述第一反应基团是活化的羧基基团。
25.制备根据权利要求22至24中任一项所述的方法,其中所述生物分子中的可与所述第一反应性基团反应的基团是活化的羟基基团或者活化的氨基基团。
26.用于检测样品中的靶分子的方法,其包括以下步骤:
(i)使所述样品与根据权利要求14至21中任一项所述的缀合物接触,其中在足以使所述生物分子与所述靶分子结合的条件下,所述缀合物的生物分子与所述靶分子特异性结合,以及
(ii)检测所述生物分子与所述靶分子形成的复合物。
27.根据权利要求27所述的方法,其中如果所述靶分子是第一多肽,则形成所述缀合物的一部分的生物分子选自第二多肽和适配体。
28.根据权利要求28所述的方法,其中所述第二多肽是抗体。
29.根据权利要求27所述的方法,其中如果所述靶分子是第一核酸,则形成所述缀合物的一部分的生物分子是与所述第一核酸特异性杂交的第二核酸。
30.根据权利要求19所述的方法,其中如果所述靶分子是多糖,则形成所述缀合物的一部分的生物分子是凝集素,或者其中如果所述靶分子是凝集素,则结合伴侣是多糖。
31.根据权利要求26至31中任一项所述的方法,其中所述靶分子存在于细胞、细菌、病毒或酵母细胞中,或者被固定在聚合物、聚合物膜或聚合物颗粒上。
32.用于检测细胞内组分的方法,其包括:使一种或更多种细胞内组分与根据权利要求14至21中任一项所述的包含AQC-CTC的缀合物接触,其中所述生物分子是与所述细胞内组分特异性结合从而允许通过显微术检测一种或更多种细胞内组分的结合伴侣。
33.根据权利要求32所述的方法,其中所述结合伴侣选自多肽和核酸。
34.根据权利要求33所述的方法,其中所述多肽是抗体。
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