JP2016503158A - 発光を用いる生体分子の検出のための方法および試薬 - Google Patents
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Abstract
本発明は、少なくとも2つの異なるサイズの金属原子量子クラスター(AQC)の電荷移動複合体とビオチン結合性分子、好ましくは、ストレプトアビジンとを含んでなる発光複合体、およびビオチン化化合物の検出のためのその使用に関する。本発明はまた、AQCの電荷移動複合体と生体分子とを含んでなるコンジュゲートの使用、およびAQCナノシステムの発光特性に基づくサンプルに基づく生体分子の結合相手の検出のためのその使用に関する。
Description
本発明は、金属原子量子クラスター(AQC)の電荷移動複合体に結合された目的の生体分子に対する結合相手を用いて生体分子を検出するための方法および試薬に関する。本発明はまた、金属原子量子クラスターの電荷移動複合体とビオチン化分子とを用いる競合的結合アッセイに関する。
ポリヌクレオチド、タンパク質、脂質などの生体分子と蛍光色素のコンジュゲーションは、生体分子の検出、単離、および/または同定に有用であり得る。このコンジュゲートは一般に、色素と所与の標的または結合相手に結合し得る薬剤を連結することから得られる。タンパク質または核酸の検出用マーカーとしての使用が意図される色素に望ましいと思われる様々な特性が存在する。これらとしては、それが取り囲むマトリックスに影響を及ぼさずに励起される能力、容易な検出、高い量子収率、媒体への適合性、安定性、長い平均寿命、非毒性、経時的発光パラメーターの再現性、およびヌクレオチドまたは他の望ましい標的への色素の結合を可能とする反応性基の存在を含み得る。
今日、200nmを超える極めて大きなストークスシフト1マイクロ秒を超える遅い減衰時間を有することが知られる唯一の蛍光系は、希土類元素イオンに基づく。しかしながら、マトリックスへのそれらの組み込みが困難であるためにそれらが蛍光特性を失わないこと、各希土類元素に対応する固定された特定の励起、発光およびストークスシフト特性が存在するので変化を受けにくいこと、および高価で希少な材料であることといった複数の欠点を示す。これらの系の例は、Sardar, D.K. et al., Biophotonics, January 2008; Resch-Genger, U., Advanced Fluorescence Reporters in Chemistry and Biology II Springer Series on Fluorescence, 2010, Volume 9, Part 1, 3-40; Harma H. et al., Analytical Chemistry, 2005, 77, 2643-2648;US7465747B2;US2010/0224831A1およびUS4283382に記載されている。
したがって、発光プローブとして使用することができ、かつ、希土類元素に基づく色素を含有するコンジュゲートのこれらの欠点を克服する、生体分子への蛍光色素のコンジュゲートが必要とされる。
本発明者らは、驚くことに、AQCの電荷移動複合体がストレプトアビジンと相互作用してそれらの蛍光発光の強度の増強をもたらすこと、および、この効果をビオチンまたはビオチン結合性分子の存在下で逆転させ得ることを見出した。いずれの理論にも縛られることを望むものではないが、AQCの電荷移動複合体とストレプトアビジンとの相互作用はAQCの立体構造変化をもたらし、その結果、強度の増加が起こると考えられるとともに、AQCの電荷移動複合体はビオチン結合性ポケットを介してストレプトアビジンと相互作用し、その結果、ストレプトアビジンに対するビオチンの親和性がより高いために、ビオチンまたはビオチン結合性分子の存在下で相互作用が逆転されると考えられる。
AQCは金属遷移元素を含んでなるので、これらは、AuまたはAgなどの、極めて低濃度で存在する場合には毒性のないものから選択することができる。さらに、これらの元素は天然に非常に豊富にあるため、これは完全に持続可能な方法となる。加えて、AQCおよびAQCを含有する複合体は、下記の利点を示す:
・自然光および室温下で、少なくとも1年の保存期間、それらの特性を失うことなく安定であること、
・3〜10のpH範囲で安定であること、
・乾燥形態であってもそれらの蛍光特性を失うことなく濃縮乾固可能であること、
・一度乾燥させたものを、それらの蛍光特性を失うことなく再溶解可能であること、および
・希土類元素に基づく発光系で使用される濃度よりも低い濃度で使用されること。
・自然光および室温下で、少なくとも1年の保存期間、それらの特性を失うことなく安定であること、
・3〜10のpH範囲で安定であること、
・乾燥形態であってもそれらの蛍光特性を失うことなく濃縮乾固可能であること、
・一度乾燥させたものを、それらの蛍光特性を失うことなく再溶解可能であること、および
・希土類元素に基づく発光系で使用される濃度よりも低い濃度で使用されること。
この知見は、ビオチンまたはビオチン化分子の検出を目的とした、AQCの電荷移動複合体の、ストレプトアビジンまたはビオチン結合性分子の存在下での使用を可能とする。
よって、第1の態様において、本発明は、ビオチン結合性分子と、一般式(I)の少なくとも2つの異なるサイズの金属原子量子クラスター(AQC)としてのMnおよびM’n’の電荷移動複合体:
Mn +M’n´ − (I)
[式中、
金属AQCの金属MおよびM’は、同じまたは異なる金属であり、
Mnは、その酸化形態Mn +で存在するより小さいAQCであり、
M’n’は、その還元形態M’n’ −で存在するより大きいAQCであり、
Mn +とM’n’ −とは静電相互作用により結合され、
nおよびn’はそれぞれ、MおよびM’の金属原子数であり、かつ、
nはn’より小さい]
とを含有する複合体であって、前記ビオチン結合性分子と前記電荷移動複合体とが共有結合されていない複合体に関する。
Mn +M’n´ − (I)
[式中、
金属AQCの金属MおよびM’は、同じまたは異なる金属であり、
Mnは、その酸化形態Mn +で存在するより小さいAQCであり、
M’n’は、その還元形態M’n’ −で存在するより大きいAQCであり、
Mn +とM’n’ −とは静電相互作用により結合され、
nおよびn’はそれぞれ、MおよびM’の金属原子数であり、かつ、
nはn’より小さい]
とを含有する複合体であって、前記ビオチン結合性分子と前記電荷移動複合体とが共有結合されていない複合体に関する。
別の態様において、本発明は、
(i)少なくとも2つの異なるサイズの金属原子量子クラスター(AQC)としてのMnおよびM’n’の電荷移動複合体であって、請求項1に定義される式Iを有し、かつ、前記金属AQCのMおよびM’は同じまたは異なる金属であり、Mnはその酸化形態Mn +で存在するより小さいAQCであり、M’n’はその還元形態M’n’ −で存在するより大きいAQCであり、Mn +とM’n’ −は静電相互作用により結合され、nおよびn’はそれぞれ金属原子数である、電荷移動複合体と、
(ii)ビオチン結合性分子と
を一緒にまたは別個に含有するパーツキットに関する。
(i)少なくとも2つの異なるサイズの金属原子量子クラスター(AQC)としてのMnおよびM’n’の電荷移動複合体であって、請求項1に定義される式Iを有し、かつ、前記金属AQCのMおよびM’は同じまたは異なる金属であり、Mnはその酸化形態Mn +で存在するより小さいAQCであり、M’n’はその還元形態M’n’ −で存在するより大きいAQCであり、Mn +とM’n’ −は静電相互作用により結合され、nおよびn’はそれぞれ金属原子数である、電荷移動複合体と、
(ii)ビオチン結合性分子と
を一緒にまたは別個に含有するパーツキットに関する。
別の態様において、本発明は、サンプル中のビオチン化分子の検出のための方法であって、
(i)前記サンプルと本発明の複合体とを、前記ビオチン化分子が前記複合体中のビオチン結合性分子に結合するのに十分な条件下で接触させる工程、および
(ii)工程(i)の接触後に、CTCの励起波長での前記サンプルの励起に応答したCTCによる蛍光発光の強度の変化を検出する工程
を含んでなり、接触工程後のCTCにより発せられる蛍光強度の低下が、前記サンプル中にビオチン化分子が存在することを示す方法に関する。
(i)前記サンプルと本発明の複合体とを、前記ビオチン化分子が前記複合体中のビオチン結合性分子に結合するのに十分な条件下で接触させる工程、および
(ii)工程(i)の接触後に、CTCの励起波長での前記サンプルの励起に応答したCTCによる蛍光発光の強度の変化を検出する工程
を含んでなり、接触工程後のCTCにより発せられる蛍光強度の低下が、前記サンプル中にビオチン化分子が存在することを示す方法に関する。
別の態様において、本発明は、生体分子と、一般式(I)の少なくとも2つの異なるサイズの金属AQCとしてのMnおよびM’n’の電荷移動複合体:
Mn +M’n’ − (I)
[式中、
金属AQCの金属MおよびM’は、同じまたは異なる金属であり、
Mnは、その酸化形態Mn +で存在するより小さいAQCであり、
M’n’は、その還元形態M’n’ −で存在するより大きいAQCであり、
Mn +とM’n’ −とは静電相互作用により結合され、
nおよびn’はそれぞれ、MおよびM’の金属原子数であり、かつ、
nはn’より小さい]
とを含んでなるコンジュゲートであって、
前記原子量子クラスターMnおよびM’n’に結合されたω−ヒドロキシ酸配位子およびω−メルカプト酸配位子をさらに含んでなり、かつ、前記生体分子がω−ヒドロキシ酸配位子および/またはω−メルカプト酸配位子に結合されているコンジュゲートに関する。
Mn +M’n’ − (I)
[式中、
金属AQCの金属MおよびM’は、同じまたは異なる金属であり、
Mnは、その酸化形態Mn +で存在するより小さいAQCであり、
M’n’は、その還元形態M’n’ −で存在するより大きいAQCであり、
Mn +とM’n’ −とは静電相互作用により結合され、
nおよびn’はそれぞれ、MおよびM’の金属原子数であり、かつ、
nはn’より小さい]
とを含んでなるコンジュゲートであって、
前記原子量子クラスターMnおよびM’n’に結合されたω−ヒドロキシ酸配位子およびω−メルカプト酸配位子をさらに含んでなり、かつ、前記生体分子がω−ヒドロキシ酸配位子および/またはω−メルカプト酸配位子に結合されているコンジュゲートに関する。
さらなる態様において、本発明は、サンプル中の生体分子を検出するため、または細胞内成分を検出するための本発明のコンジュゲートに関する。
用語「抗体」は、本明細書で使用する場合、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫活性部分、すなわち、抗原と特異的に結合する(「免疫反応する」)抗原結合部位を含有する分子を意味する。非限定的な例としては、抗体、抗体フラグメント、組換え抗体、非ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体が挙げられる。構造的には、最も単純な天然の抗体(例えば、IgG)は、4本のポリペプチド鎖、すなわち、ジスルフィド結合により内部連結された2本の重(H)鎖と2本の軽(L)鎖を含んでなる。免疫グロブリンは、IgD、IgG、IgA、IgMおよびIgEなどのいくつかのタイプの分子を含む分子の大きなファミリーである。用語「免疫グロブリン分子」には、例えば、ハイブリッド抗体、または変異型抗体、およびそれらのフラグメントが含まれる。抗体の抗原結合機能は天然抗体のフラグメントによって遂行され得ることが示されている。これらのフラグメントは、「抗原結合単位」と総称される。抗原結合単位は、それらの分子構造に基づいて「一本鎖」(「Sc」)型および「非一本鎖」(「Nsc」)型に大別される。また、「抗体」という用語には、無脊椎動物および脊椎動物を含む様々な種に起源する免疫グロブリン分子も包含される。抗体または抗原結合単位に適用される場合の「ヒト」という用語は、ヒト遺伝子またはそのフラグメントにより発現された免疫グロブリン分子を意味する。非ヒト(例えば、齧歯類または霊長類)抗体に適用される場合の「ヒト化」という用語は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むハイブリッド免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメントである。ほとんどの部分については、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域(CDR)に由来する残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは霊長類などの非ヒト種(ドナー抗体)のCDRに由来する残基で置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FR)残基が対応する非ヒト残基で置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも移入されたCDRまたはフレームワーク配列にも見られない残基を含んでなってもよい。これらの改変は、抗体性能をさらに精密化し、ヒトの体内に導入された際の免疫原性を最小化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、実質的に総ての、少なくとも1つの、一般には2つの可変ドメインを含んでなり、この場合、総てまたは実質的に総てのCDR領域が非ヒト免疫グロブリンのCDR領域に相当し、総てまたは実質的に総てのFR領域がヒト免疫グロブリン配列のFR領域である。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域(Fc)、一般にヒト免疫グロブリンのそれの、少なくとも一部も含んでなり得る。
本明細書で使用する場合、用語「およそ」は、明示された値からの若干の変動、好ましくは、明示された値の10パーセント以内を意味する。しかしながら、用語「およそ」は、例えば、使用する実験技術によってより大きな変動の許容を意味する場合もある。当業者ならば、明示された値の前記変動を理解し、それらは本発明の範囲内である。さらに、より正確な記載を提供するために、本発明に示す量的表現のいくつかは「およそ」という用語を付けて記載しない。用語「およそ」は明示的に使用されるか、またはそうでなければ、本明細書に示される各量は実際に示される量を表すことを試み、それはまた、実験条件による、および/またはこのような所与の値に関する測定からの当量および近似を含め、当技術分野で一般的な知識に基づいて合理的に推測されるような所与の値を表すことを試みるものである。
AQCと略される用語「原子量子クラスター」は、本明細書では、金属原子量子クラスターとして理解される。金属原子量子クラスターは、本発明において、好ましくは309以下の金属原子を有するゼロ酸化状態の金属原子によりもっぱら形成される(Mn、n<309)。AQCは時間が経っても安定である。好ましくは、本発明のAQCは、およそ0.3〜2.2nm、好ましくはおよそ0.3〜2nm、より好ましくはおよそ0.3〜1.8nmのサイズを有する。これらの金属AQCはもはや「金属」様の挙動をせず、それらの挙動は分子様となる。したがって、これらのクラスターには、ナノ粒子、微粒子または金属材料には概して見られない新たな特性が見られる。よって、AQCの物理化学的特性は、ナノ/微粒子の特性から単純に推定することはできない。
本明細書で使用する場合、用語「アビジン」は、鳥類、爬虫類および両生類の卵白および組織に見られ、ビオチンと高い親和性で結合する能力を有する糖タンパク質、ならびにストレプトアビジン、ニュートラアビジンなどのアビジンビオチン結合性分子の任意の発現形態または人工形態(engineered form)を意味する。この用語には、ニワトリ(Gallus gallus)の卵に天然に見られるアビジン(NCBI受託番号NM_205320.1/GL45384353en)ならびに他の種における前記タンパク質のオーソログが含まれる。
「結合相手」は、本明細書で使用する場合、それが結合する結合相手または標的分子に対して結合選択性を示す分子を意味する。結合物質は、抗体またはタンパク質などのポリペプチド、ポリペプチドに基づく毒素、アミノ酸、ヌクレオチド、DNAおよびRNAを含むポリヌクレオチド、脂質、および炭水化物、またはそれらの組合せといった生体分子であり得る。結合物質はまた、ハプテン、薬物、金属キレーターなどのイオン錯化剤、微粒子、合成または天然ポリマー、細胞、ウイルス、または本発明の色素分子を含むその他の蛍光分子であってもよい。
用語「生体サンプル」は、本明細書で使用する場合、限定されるものではないが、培養細胞、骨髄;血液;血液細胞(例えば、白血球細胞、赤血球など);腹水;組織または細針生検サンプル;細胞含有体液;浮遊核酸;痰;尿;脳脊髄液、腹腔液;胸膜液;乳管洗浄液または気管支肺胞洗浄液などの洗液または洗浄液;穿刺液;掻爬物;骨髄検体;組織生検;外科検体;他の体液、分泌物、および/または排泄物;および/またはそれらからの細胞を含む生体起源の任意のサンプルを意味する。いくつかの実施形態では、サンプルは、患者から得られた細胞を含んでなる。これらの細胞は、例えば、血液、骨髄から、および/または固体器官に由来する組織からのもの、例えば、脳、脾臓、骨、心臓、血管、肺、腎臓、肝臓、下垂体、内分泌腺、リンパ節、初代細胞分散物、腫瘍細胞などであり得る。生体サンプルは、限定されるものではないが、組織学的目的で採取された凍結切片または固定切片を含む、組織切片を含み得る。いくつかの実施形態では、サンプルは、限定されるものではないが、血液、リンパ液、腹水、婦人科体液および尿を含む体液であり得る。サンプルは、限定されるものではないが、生検(例えば、微細穿刺吸引または組織生検)、手術、および体液採取物(例えば、血液、リンパ液など)を含む、当技術分野で公知の多様な方法のいずれによって被験体から得てもよい。生体サンプルはまた、上記のサンプルのいずれかを処理することにより誘導されるいずれの材料も含む。誘導サンプルは、例えば、生体サンプルから抽出された、あるいはサンプルにmRNAの増幅もしくは逆転写、または特定の成分の単離および/もしくは精製といった技術を施すことによって得られる核酸もしくはタンパク質を含む。
用語「生体分子」は、当業者に知られている通りに本明細書で使用され、例えば、タンパク質、多糖、炭水化物、脂質、核酸およびオリゴヌクレオチドなどの大型のポリマー分子、ならびに一次代謝産物、二次代謝産物、および天然物などの小分子を含む、生物により産生される任意の有機分子またはこのような化合物の人工的に産生される任意の誘導体を意味する。
用語「ビオチン結合性分子」は、本明細書で使用する場合、ビオチンまたは任意のビオチン化合物と強く、しかしながら非共有的に結合し得るいずれの化合物も包含することが意図される。
用語「ビオチン化分子」は、修飾ビオチンまたはビオチン類似体と、生体分子、例えば、核酸分子(一本鎖または二本鎖DNA、RNA、DNA/RNAキメラ分子、核酸類似体、およびヌクレオチド配列、例えば、ペプチド核酸(PNA)またはそれらの任意の改変物を含有するまたは組み込んだ任意の分子を含む)、タンパク質(糖タンパク質、酵素、ペプチドライブラリーまたはディスプレー生成物および抗体またはそれらの誘導体を含む)、ペプチド、炭水化物または多糖、脂質などといった別の部分とのコンジュゲートと理解されるべきであり、ここで、これらの他の部分は修飾ビオチンまたはビオチン類似体に共有結合されている。多くのビオチン化配位子は市販されているかまたは標準的な方法によって製造することができる。生体分子、例えば、核酸分子またはタンパク質分子をビオチンとカップリングさせるための方法は当技術分野で周知である(Bayer and Wilchek, Methods in Molec. Biology 10, 143. 1992)。
用語「電荷移動複合体」は、CT複合体、または電子供与体−受容体複合体とも呼ばれ、本明細書では、少なくとも2つのAQCの会合体であって、電荷の一部、すなわち、電子がこれらのAQC間で受け渡され、その結果、一方のAQCの酸化形態が形成され、他方のAQCの還元形態が形成される場合と理解される。得られる静電相互作用、すなわち、静電引力は、その分子複合体に安定化力を供する。電荷が移動されるAQC源は電子供与体と呼ばれ、受容側のAQCは電子受容体と呼ばれる。本発明では、
・Mnは、その複合体内でより小さいAQCである電子供与体であり、
・M’n’は、その複合体内でより大きいAQCである電子受容体である。
・Mnは、その複合体内でより小さいAQCである電子供与体であり、
・M’n’は、その複合体内でより大きいAQCである電子受容体である。
CTCは、ナノソームを崩壊させることによって形成される。ナノソームを崩壊させる工程は、従前に合成されたナノソームの不安定化プロセスである。この工程は、種々の機構によって達成できる。好ましい実施形態では、ナノソームを崩壊させる、またはナノソームを不安定化させる工程は超遠心分離の手段によりなされるが、熱処理またはpH変化など、当技術分野で公知の他の任意の手段もナノソームの崩壊に有用であり得る。電荷移動機構は、ナノソームを崩壊させる工程中に生じる。したがって、ナノソームが不安定化され、一般式(I)の電荷移動複合体が形成される。
本発明において使用するためのCTCを得るには、様々な方法が存在する。
1つの方法は、AQCとしてのMnおよびM’n’の水溶液を作製する工程を含んでなる。好ましくは、両溶液はおよそ同濃度のAQCを含み、すなわち、両溶液は等モルまたはおよそ等モルである。さらなる工程において、両溶液を混合し、一緒に撹拌して電子移動機構を生じさせる。好ましい実施形態では、反応温度は20℃〜80℃である。別の実施形態では、反応時間は5分〜3時間である。
本発明において使用するための電荷移動複合体、特に、有機配位子をさらに含んでなる電荷移動複合体(ここで、前記有機配位子は、原子量子クラスターMnおよびM’n’に結合されたω−ヒドロキシ酸およびω−メルカプト酸などの両親媒性分子である)を得るための別法は、下記の工程:
a)ω−ヒドロキシ酸とω−メルカプト酸とを水性媒体中、塩基の存在下で混合することによりナノソームを作製する工程、
b)工程a)で作製された混合物に少なくとも1つの金属塩を添加する工程、
c)工程b)で得られた混合物を還元する工程、および
d)工程c)で得られた混合物中に存在するナノソームを崩壊させる工程
を含んでなる。
a)ω−ヒドロキシ酸とω−メルカプト酸とを水性媒体中、塩基の存在下で混合することによりナノソームを作製する工程、
b)工程a)で作製された混合物に少なくとも1つの金属塩を添加する工程、
c)工程b)で得られた混合物を還元する工程、および
d)工程c)で得られた混合物中に存在するナノソームを崩壊させる工程
を含んでなる。
用語「ナノソーム」は、本明細書において、人工的に調製されたナノメートルサイズの小胞を意味する。したがって、用語「ナノソーム」は、脂肪族−(CH2)n−鎖の各末端において、または脂肪族CH3−(CH2)n−鎖の後ろから3番目のχ、後ろから2番目のψの位置において1つずつ結合した2つの親水基を有する1層の両親媒性分子(例えば、脂質)により形成される、球状ナノ超分子構造を意味する。
本発明のナノソームの前記単層を形成する両親媒性分子は、
・脂肪鎖の一末端における、小胞の外面にある例えばカルボキシル基(COOH)、カルボン酸基(COO−)またはリン酸基(PO4 −)などの親水基および
・脂肪族CH3−(CH2)n−鎖の後ろから3番目のχ、後ろから2番目のψの位置における、または脂肪族−(CH2)n−鎖の最後のωの位置における、例えば、−OH、−SH、−NH2、−NH−、−Cl、−PH3、−SR、−OR、−NR2、−NHR、または−NR−などの基での置換(ここで、Rは、脂肪鎖の他の末端においてまたは前記脂肪鎖の親水基に対する最終的な位置において、小胞の内部に向かって配置されるナノソームを形成し得る、短い炭化水素鎖C1−C4の有機基を表し、前記基は、10nm以下、好ましくはおよそ5nm以下、より好ましくは0.8〜4nmの内径を有するナノキャビティーを形成する。特定の実施形態では、ナノキャビティーの内径は、およそ1.5〜1.8nmである)
を含んでなる。
・脂肪鎖の一末端における、小胞の外面にある例えばカルボキシル基(COOH)、カルボン酸基(COO−)またはリン酸基(PO4 −)などの親水基および
・脂肪族CH3−(CH2)n−鎖の後ろから3番目のχ、後ろから2番目のψの位置における、または脂肪族−(CH2)n−鎖の最後のωの位置における、例えば、−OH、−SH、−NH2、−NH−、−Cl、−PH3、−SR、−OR、−NR2、−NHR、または−NR−などの基での置換(ここで、Rは、脂肪鎖の他の末端においてまたは前記脂肪鎖の親水基に対する最終的な位置において、小胞の内部に向かって配置されるナノソームを形成し得る、短い炭化水素鎖C1−C4の有機基を表し、前記基は、10nm以下、好ましくはおよそ5nm以下、より好ましくは0.8〜4nmの内径を有するナノキャビティーを形成する。特定の実施形態では、ナノキャビティーの内径は、およそ1.5〜1.8nmである)
を含んでなる。
好ましい実施形態では、用語「ナノソーム」は、ω−ヒドロキシ酸およびω−メルカプト酸により形成される球状ナノ超分子構造を意味する。この特定の実施形態では、ナノソームは、上記で定義されるω−ヒドロキシ酸(HO−(CH2)m−COOH)およびω−メルカプト酸(HS−(CH2)p−COOH)を含んでなる。ナノソーム中に存在するω−ヒドロキシ酸およびω−メルカプト酸は、酸基−COOH(または対応する酸の塩が使用される場合には−COO−)をナノシステム、すなわち、ナノソームの外面に向け、かつ、−OHおよび−SH基をナノソームの内腔を形成している内部に向けた、球状単層を形成しており、その結果、2つのおよその同心球が形成され、または文献で呼称されているように脂肪酸「bola」の形態となる。この球状単層は、およそ2〜10nm、好ましくはおよそ5nmの厚さを有し得る。
ナノソームの内腔は閉じられている。前記内腔の内径は10nm以下、好ましくはおよそ5nm以下であり、より好ましくは、前記内腔の内径はおよそ0.8〜4nmである。特定の実施形態では、この内部ナノキャビティーの直径は、およそ1.5〜1.8nmである。ナノソームのこの特定の実施形態では、前記ナノキャビティーは、ヒドロキシル−OH、およびメルカプト−SH基により形成されるが、これらの官能基を、金属とも相互作用する−NH2、−NH−、−Cl、−PH3、−SR、−OR、−NR2、−NHR、−NR−(ここで、Rは、ナノソームを形成し得る短い炭化水素鎖C1−C4の有機基を表す)などの他のものに交換することも可能である。
ω−ヒドロキシ酸とω−メルカプト酸を混合することによりナノソームを調製する工程a)における塩基として、水酸化テトラブチルアンモニウム、水酸化テトラオクチルアンモニウム、水酸化トリエチルベンジルアンモニウム、水酸化トリ−n−オクチルメチルアンモニウム、水酸化トリメチルデシルアンモニウム、水酸化テトラメチルアンモニウム、水酸化テトラエチルアンモニウムまたは対イオンなどの嵩のある基を有する他の任意の水酸化物、好ましくは、水酸化テトラブチルアンモニウムを使用することができる。
工程b)では、遷移金属の金属塩またはそれらの組合せが使用可能である。金属塩の非限定的な例は、遷移金属の硝酸塩、硫酸塩、亜硫酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、リン酸塩、水酸化塩、シアン酸塩、カルボン酸塩、チオリンゴ酸塩、チオグルコサート(thioglucosates)である。単独の金属塩としてまたは他の金属塩と組み合わせて使用されるこれらの金属塩の例は、AgNO3、CH3COOAg、Ag3AsO4、AgBrO3、AgBr、Ag2CO3、AgClO3、AgCl、AgCrO4、AgOCN、AgIO3、AgI、Ag2O、AgClO4、Ag3PO4、Ag2SO4、Ag2S、Ag2SO3、CuSO4、CuCl2、CuBr2、CuI2、Cu2S、CuSCN、CuCN、CuCO3、Cu2O、Cu(OH)2、Cu(NO3)2、Cu(ClO4)2、Cu(HCO2)2またはCu(CO2CH3)2である。組み合わせて使用される金の金属塩の非限定的な例は、HAuCl4、AuCl、AuCl3、HAuCl4、HAuCl4・aq、KAuCl4、LiAuCl4,(CH3)2SAuCl、C3H9AuClP、C6H15AuClP、C18H15AuClP、C8H11AuClP、C5H5AuCl3N、(C4H9)3PAuCl、C27H36AuClN2、C21H12AuClF9P、C20H27AuClP、C33H49AuClP、C42H63AuClO3P、C21H24AuClN2、C35H49AuF6NO4PS2または(C20H15AuF6NO4PS2)・2C7H8である。
工程c)で得られる混合物を還元するために工程c)で使用される還元系または還元剤の非限定的な例は、NaBH4、DIBAH、LiAlH4、N2H4またはSnCl2およびまた、次亜リン酸ナトリウム、アミン、糖、有機酸、ポリビニルピロリドンなどのポリマー、UV−VIS照射、超音波および光還元などのより温和な還元剤であり得る。
本方法の工程b)およびc)の後、「AQCを含んでなるナノソーム」が形成される。これらの「AQCを含んでなるナノソーム」は、それらの内腔に、少なくとも2つの異なるサイズのAQC、すなわち、MnおよびM’n’を含んでなる、すなわち、封入されている。
これらの「AQCを含んでなるナノソーム」の特定の例は、これらのナノシステム内部の金粒子合成を記載しているGaillard, C., Journal of Colloid and Interface Science, 2209, 337, 2, 610-613に記載されている。
ナノソームを崩壊させる工程は、従前に合成されたナノソームの不安定化プロセスである。この工程は、種々の機構によって達成できる。好ましい実施形態では、ナノソームを崩壊させる、またはナノソームを不安定化させる工程は超遠心分離の手段によりなされるが、熱処理またはpH変化など、当技術分野で公知の他の任意の手段もナノソームの崩壊に有用であり得る。電荷移動機構は、ナノソームを崩壊させる工程中に生じる。したがって、ナノソームが不安定化され、一般式(I)の電荷移動複合体が形成される。
それらの内腔に、少なくとも2つの異なる大きさのAQC、すなわち、MnおよびM’n’を含んでなるナノソーム以外の他のナノシステムを崩壊させることにより、本発明で使用される電荷移動複合体を得ることも可能である。
用語「ナノシステム」は、1層または2層の両親媒性分子により形成される球状ナノ超分子構造を意味し、ここで、前記両親媒性分子は、ナノシステムの内部にナノキャビティーを形成する。特に、ナノシステム(nansosytem)は、およそ20nm以下、好ましくは18nm以下、より好ましくは15nm以下の外径を有する。ナノシステムの内部は10nm以下、好ましくはおよそ5nm以下、より好ましくは0.8〜4nmの内径を有する少なくとも1つのナノキャビティーを含んでなる。特定の実施形態では、ナノキャビティーの内径はおよそ1.5〜1.8nmである。ナノシステムの非限定的な例はナノソームであるが、ミセル、逆ミセル、ナノエマルションまたはマイクロエマルションでもある。好ましい実施形態では、ナノシステムはナノソームである。
「球状」とは、それが球に形が似た幾何学的立体図形を有することを意味する。
ナノシステムを形成する両親媒性分子は、同じであっても異なっていてもよく、好ましくは、2つの異なるタイプの分子であり、各分子は親水性と親油性の両特性を有する。
親油性の特性は、一般に炭化水素部分、例えば、CH3−(CH2)n−または−(CH2)n−(30>n>2、好ましくは20>n>10)の形態の脂肪鎖である基によって与えられる。
親水性の特性は、親水基によって与えられる。親水基は、荷電基であっても極性非荷電基であってもよい。荷電基は陰イオン基から選択され、好ましくは、カルボン酸塩、硫酸塩、スルホン酸塩およびリン酸塩からなる群から選択される。極性非電荷基は、−OH、−SH、−NH2、−NH−、−Cl、−PH3、−SR、−OR、−NR2、−NHRおよび−NR−(ここで、Rは、短い炭化水素鎖C1−C4の有機アルキル基、好ましくは、メチル、エチルまたはプロピル基を表す)からなる群から選択される。
両親媒性分子は、1つの脂肪族CH3−(CH2)n−鎖とそれに結合された1つの親水基、または脂肪族−(CH2)n−鎖の各末端に1つずつ結合された2つの親水基を有し得る。
用語「ミセル」は、両親媒性分子凝集体意味する。水性媒体中で、この分子凝集体の親油性ドメインはミセルの内部に向かって配向し、親水性ドメインは媒体と接している。「逆ミセル」では、分子は、親油性領域が外部に、親水性領域が内部に曝されるように構成される。当技術分野の現状では、用語「マイクロエマルション」はまた、「逆ミセル」を意味しても使用され、すなわち、「マイクロエマルション」は、「逆ミセル」の特定の実施形態である。用語「マイクロエマルション」は、ナノメートルサイズの液滴により形成される熱力学的に安定な、少なくとも3つの成分(水、油性および両親媒性化合物として一般に知られる有機溶媒)の単相の系を意味する。限定されるものではないが、本発明に関しては、水滴が有機媒体中に分散されている油中水型マイクロエマルションの使用が、特に注目される。これらの油中水型マイクロエマルションとしては、水滴内に、例えば、ラジカル光開始剤などの何らかの開始剤を導入する手段によって重合されるアクリルモノマー、例えば、アクリルアミドまたは1,6−ヘキサンジオールジアクリレートを含有するマイクロエマルションに関する重合マイクロエマルションの使用も、その安定性のために注目される。したがって、マイクロエマルションの液滴がより耐性となり得る。
用語「ナノエマルション」は、熱力学的に不安定であるが化学的または物理的プロセスによって一時的に安定化され、ナノメートル液滴により形成される、少なくとも3成分(水、有機溶媒および安定化化合物)の2相系を意味する。ナノメートル液滴の形成は、当技術分野の現状で知られているエマルションからナノエマルションを区別するというだけであり、したがって、用語「ナノエマルション」は一般に、液滴がナノメートルサイズであるエマルションを意味する。
特定の実施形態では、ナノシステムは、ナノソーム、ミセルおよび逆ミセルからなる群から選択され、好ましくは、ナノシステムはナノソームである。
ナノシステムが逆ミセルである特定の実施形態では、逆ミセルは、少なくとも2つの異なる界面活性剤を含んでなり、少なくとも1つは、その極性基としてチオール基またはチオエーテル基を含んでなる。より詳しい実施形態では、少なくとも2つの界面活性剤は、アルコールエトキシレートおよびω−メルカプト酸である。
ナノシステムの内腔は閉じられている。前述のように、前記内腔の内径は、10nm以下、好ましくはおよそ5nm以下であり、より好ましくは、前記内腔の内径はおよそ0.8〜4nmである。特定の実施形態では、この内部ナノキャビティーの直径は、およそ1.5〜1.8nmである。
クラスターの励起および発光波長の概算見積りは、Jelliumモデル(例えば、J. Calvo et al., Encyclopedia of Nanotechnology, B. Bhushan, Springer Verlag編, 2011参照)の手段による概算によって決定することができる。このモデルは、どちらかといえば概算の様式で、クラスターの禁制エネルギーバンドギャップ、したがって、その発光バンドギャップの位置を予測する。クラスターの励起バンドギャップは、次に、発光バンドギャップから、特定の大きさのクラスターにおけるストークスシフトがおよそ50〜100nmであることを考慮して予測することができる。下表の表1は、この様式に従うAuまたはAgのAQCに関する理論データを示し、すなわち、およその励起波長λexc.および発光波長λem.は、前記Jelliumモデル:Eem=EF/N1/3(ここで、Eem=発光エネルギー;N=AQCの原子の数;およびEF=金および銀では同じおよそ5.5eVであるFermiレベル)の手段によってAuまたはAgのAQCにおいて±50nmの誤差を用いて算出したものである。
これらの値はまた、実際に、ナノシステムがナノシステムの内腔においてOHおよびSH基と他の配位子との交換反応を行わせるように作製される場合には変更可能である。限定されるものではないが、交換される配位子は、−NH2、−NH−、−Cl、−PH3、−SR、−OR、−NR2、−NHR、−NR−から選択することができ、ここで、Rは、ナノソームを形成し得る短鎖有機基を表す。
言い換えれば、特定の励起波長および発光波長を得るために使用されるクラスターのタイプは、上記の表から決定することができる。よって、例えば、励起波長300nm、発光波長600nmおよびストークスシフト300nmの系を得るためには、下記のクラスターサイズが選択されるべきである:
・励起クラスター(「供与体」、Mn):M3/M5、
・発光クラスター(「受容体」、M’n’):M’12/M’20。
・励起クラスター(「供与体」、Mn):M3/M5、
・発光クラスター(「受容体」、M’n’):M’12/M’20。
本発明の範囲内で、用語「遷移金属の組合せ」は、少なくとも2つの異なる遷移金属の原子を有するAQC、ならびにある単一の遷移金属のAQCが、異なる大きさの少なくとも2つのAQCが、同じ遷移金属を有するAQC、異なる遷移金属を有するAQC、または同じもしくは異なる二金属の組合せを有するAQCとなり得るように、第1のものとは異なる別の遷移金属のAQCの存在下に存在する場合を意味する。
用語「検出する(detect)」、「検出(detecting)」などは、定量的ならびに定性的測定を包含する。
本明細書において使用する場合、「蛍光in situハイブリダイゼーション」または「FISH」は、染色体上の特定のDNA配列とハイブリダイズする標識核酸プローブの使用を介して、染色体上の特定のDNA配列を検出または位置決定するための方法を意味する。
「固定化」とは、例えば、あるデバイスの表面に直接または間接的に結合されることを意味し、共有結合または非共有的結合(例えば、水素結合、イオン相互作用、ファンデルワールス力、または疎水性相互作用)による結合を含む。「翻訳後修飾」とは、その翻訳後のタンパク質の化学的修飾を意味する。これには、限定されるものではないが、官能基の付加(例えば、リン酸化、グリコシル化、アセチル化、アルキル化、メチル化、ホルミル化、酸化、またはビオチン化)、タンパク質またはペプチドの付加(例えば、ユビキチン化)、アミノ酸の化学的性質の変更(例えば、脱アミノ化または脱メチル化)、および構造変化(例えば、ジスルフィド架橋またはタンパク質分解性切断)が含まれる。
本明細書において使用する場合、「免疫細胞化学(ICC)」としても知られる用語「免疫組織化学(IHC)」は、細胞に対して適用される場合、病理診断におけるツールを意味し、ここで、モノクローナル抗体のパネルが、未分化新生物の示差診断において(例えば、リンパ腫、癌腫および肉腫を診断するため)、ある腫瘍種および他の疾患に特異的なマーカーを明らかにするため、悪性リンパ腫を診断および表現型決定のため、ならびにウイルス抗原、癌タンパク質、ホルモン受容体、および増殖関連核タンパク質の存在を証明するために使用可能である。
用語「キット」は、本明細書で使用する場合、輸送および保存を可能とするように包装された、本発明の方法を実施するために必要な種々の試薬を含有する製品を意味する。キットの成分を包装するのに好適な材料としては、結晶、プラスチック(例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート)、ボトル、バイアル、紙、または外被が含まれる。
文字「n」および「n’」は、各AQCの遷移金属原子数を意味する。上記で述べたように、nはn’(n<n’)より小さい。好ましくは、nとn’との最小の差は、金属原子5個である。好ましい実施形態では、nとn’との差は5〜50原子であり、特定の実施形態では、nとn’との差は5〜25原子であり、別の実施形態では、nとn’との差は5〜15である。
電荷移動複合体に結合され得る「有機配位子」は、少なくとも2つの異なるタイプの有機配位子であり、好ましくは、少なくとも2つの異なるタイプの有機配位子は、ω−ヒドロキシ酸(HO−(CH2)m−COOH)およびω−メルカプト酸(HS−(CH2)p−COOH)配位子から選択され、ここで、mおよびpは2〜30の値を有し、好ましくは、mおよびpは10〜20の値を有する。特定の実施形態では、mおよびpは、15の値を有する。別の特定の実施形態では、mおよびpは11の値を有する。
mとpの値は、異なっていても同じであってもよい。mとpが異なっている場合、それらの間の差は、炭素6個未満、好ましくは、mとpとの値の差は1〜4である。好ましい実施形態では、mとpは同じである。少なくとも2つの異なるタイプの有機配位子がω−ヒドロキシ酸(HO−(CH2)m−COOH)およびω−メルカプト酸(HS−(CH2)p−COOH)配位子から選択される場合、酸基−COOH(または対応する酸の塩が使用される場合には−COO−)はナノ化合物の外面に向けられ、−OH基および−SH基は内部、すなわち、それらに結合、付加または配位されているイオン化AQCとしてのMn+およびM’n’−に向けられる。
別の実施形態では、電荷移動複合体に結合され得る「有機配位子」は、ヒドロキシル−OH基、またはメルカプト−SH基以外の官能基、例えば、−NH2、−NH−、−Cl、−PH3、−SR、−OR、−NR2、−NHR、−NR−を有し、ここで、Rは、AQCまたはイオン化AQCとしてのMn +およびM’n’−を結合、付加または配位可能な短い炭化水素鎖C1−C4の有機基を表す。ω−ヒドロキシ酸(HO−(CH2)m−COOH)およびω−メルカプト酸(HS−(CH2)p−COOH)配位子のヒドロキシル−OHまたはメルカプト−SH基をそれらもまたAQCの金属と相互作用する上述のこれらの他の基に交換することも可能である。
本明細書において使用する場合、「核酸プローブ」は、染色体上の特定のDNA配列を認識してそれとハイブリダイズする核酸(例えば、DNA、RNA、PNAなど)配列を意味する。
用語「スペーシング基」または「スペーサー」は、2つ以上の部分構造を接続する化学構造を意味する。これらのスペーサーは、本出願の下記で列挙する。スペーシング基の原子およびスペーシング基内の鎖の原子はそれら自体、化学結合によって接続される。好ましいスペーサーとしては、直鎖または分岐型、飽和または不飽和型の炭素鎖である。これらの炭素鎖はまた、鎖内または鎖の末端に1以上のヘテロ原子も含んでよい。「ヘテロ原子」とは、酸素、窒素および硫黄からなる群から選択される。スペーシング基はまた、鎖の一部または鎖の原子の1つにある置換として環式基または芳香族基を含んでもよい。
用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書で使用する場合、当技術分野で理解されているようなその種々の形態のデオキシリボ核酸、例えば、ゲノムDNA、cDNA、単離された核酸分子、ベクターDNA、および染色体DNAを意味して互換的に使用される。「核酸」は、任意の形態のDNAまたはRNAを意味する。単離された核酸分子の例としては、限定されるものではないが、ベクターに含まれる組換えDNA分子、異種宿主細胞内で維持される組換えDNA分子、部分的または実質的に精製された核酸分子、および合成DNA分子が含まれる。一般に、「単離された」核酸は、核酸が由来する生物のゲノムDNAにおいてその核酸に自然状態で隣接している配列(すなわち、その核酸の5’および3’末端に位置する配列)を含まない。さらに、「単離された」DNA分子などの核酸分子は一般に、組換え技術により作出された場合には他の細胞材料もしくは培養培地を実質的に含まず、または化学前駆体もしくは化学的に合成された場合には他の化学物質を含まない。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書では、任意の長さのアミノ酸のポリマーを意味して互換的に使用される。ポリマーは、直鎖、環式、または分岐であり得る。ポリマーは修飾アミノ酸を含んでいてもよいし、非アミノ酸が挿入されていてもよい。用語は、例えば、スルホン化、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、ヨウ素化、メチル化、酸化、タンパク質分解性プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、トランスファーRNAにより媒介されるタンパク質へのアミノ酸付加、例えば、アルギニン化、ユビキチン化、または標識成分のコンジュゲーションなどの他の任意の操作を介して修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。本明細書において使用する場合、用語「アミノ酸」は、グリシンおよびD型またはL型両方の光学異性体、およびアミノ酸類似体およびペプチド模倣物を含む天然および/または非天然または合成アミノ酸を意味する。
用語「保護基」は、本明細書で使用する場合、分子内の反応性基に結合された場合にその反応性をマスク、低減または抑制する原子の群を意味する。
用語「反応性基」は、本明細書で使用する場合、別の化学基と反応して共有結合を形成し得る、すなわち、好適な反応条件下で共有結合的反応性がある、一般に、別の物質に結合点を供する基を意味する。反応性基は一般に、求核試薬、求電子物質および光活性化基が含まれる。反応性基の例としては、限定されるものではないが、オレフィン、アセチレン、アルコール、フェノール、エーテル、オキシド、ハライド、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、アミド、シアネート、イソシアネート、チオシアネート、イソチオシアネート、アミン、ヒドラジン、ヒドラゾン、ヒドラジド、ジアゾ、ジアゾニウム、硝石(nitre)、ニトリル、メルカプタン、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、スルホン酸、硫酸、アセタール、ケタール、アンハイドライド、サルフェート、スルフェン酸、イソニトリル、アミジン、イミド、イミデート、ニトロン、ヒドロキシルアミン、オキシム、ヒドロキサム酸、チオヒドロキサム酸、アレン、オルトエステル、スルファイト、エナミン、イナミン、尿素、シュードウレア、セミカルバジド、カルボジイミド、カルバメート、イミン、アジド、アゾ化合物、アゾキシ化合物、およびニトロソ化合物が含まれる。反応性官能基にはまた、バイオコンジュゲート、例えば、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、マレイミドなどを作製するために使用されるものも含まれる。これらの官能基のそれぞれを調製する方法は当技術分野で周知であり、それらの特定の目的への適用または特定の目的に向けた改変は当業者の能力の範囲内である(例えば、Sandler and Karo, eds., Organic Functional Group Preparations. Academic Press, San Diego, 1989参照)。
用語「サンプル」、本明細書で使用する場合、その最も広い意味で使用され、検出される生体分子を含有するサンプルを意味する。いくつかの実施形態では、サンプルは、土壌、水、もしくは空気などの環境サンプルであるか、または廃水流、水源、供給ライン、または製造ロットから採取されたものなどの工業源からのサンプルである。別の実施形態では、サンプルは、生物サンプルである。
本発明で使用する場合、「特異的結合」という表現は、第1の分子が第2の分子に、その2分子間の三次元構造の相補性の存在によって、非特異的結合よりも実質的に高い親和性で特異的に結合する能力を意味し、その結果、前記第1の分子と第2の分子との間の結合は好ましくは、反応混合物中に存在する他の分子に対する前記分子のいずれの結合にも先だって起こる。前記結合から生じた複合体が10−6M未満、10−7M未満、10−8M未満、10−9M未満、10−10M未満、10−11M未満、10−12M未満、10−13M未満、10−14M未満または10−15M未満の解離定数(KD)を有する場合に、2分子の結合に高い親和性が存在すると理解される。
用語「ストレプトアビジン」は、本明細書で使用する場合、ストレプトミセス・アビディニイ(Streptomyces avidinii)(GenBank受託番号CAA00084.1)由来のタンパク質、ならびにアビジンと同様に定義されるストレプトアビジンのオーソログ、ホモログおよびフラグメントに相当する。
本明細書で定義される「ストリンジェント条件」または「高ストリンジェンシー条件」とは、一般に、(1)低いイオン強度および高い洗浄温度、例えば、0.015M塩化ナトリウム/0.0015Mクエン酸ナトリウム/0.1%ドデシル硫酸ナトリウム、50℃を使用するか;(2)ハイブリダイゼーションの際に、ホルムアミド、例えば、0.1%ウシ血清アルブミン/0.1%フィコール/0.1%ポリビニルピロリドン/50mMリン酸ナトリウムバッファー、pH6.5を含む50%(v/v)ホルムアミドなどの変性剤を、42℃で750mM塩化ナトリウム、75mMクエン酸ナトリウムとともに使用するか;または(3)42℃で、50%ホルムアミド、5×SSC(0.75MNaCl、0.075Mクエン酸ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH6.8)、0.1%ピロリン酸ナトリウム、5×デンハート液、音波処理済みサケ精子DNA(50μg/ml)、0.1%SDS、および10%デキストラン硫酸を、42℃、0.2×SSC(塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム)および50%ホルムアミド中での洗浄と、その後の55℃℃でのEDTAを含有する0.1×SSCからなる高ストリンジェンシー洗浄とともに使用する。中等度のストリンジェント条件は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989に記載されているように同定することができ、上記のものよりも低いストリンジェントの洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件(例えば、温度、イオン強度および%SDS)の使用を含む。中等度のストリンジェント条件の例は、37℃、一晩の、20%ホルムアミド、5×SSC(150mM NaCl、15mMクエン酸三ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5×デンハート液、10%デキストラン硫酸、および20mg/ml変性剪断サケ精子DNAを含んでなる溶液中でのインキュベーションと、その後のフィルターの約37〜50℃、1×SSC中での洗浄である。当業者ならば、必要に応じ、プローブ長などの因子に適合させるために温度、イオン強度などをどのように調節すればよいかが分かるであろう。いくつかの実施形態では、生体分子の検出のために結合相手として使用されるヌクレオチドは、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも120、少なくとも150、少なくとも200などのヌクレオチド長であり得る。核酸は、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)、ペプチド核酸(PNA)、そのいずれかの誘導体、およびそのいずれかの組合せを含んでなり得る。オリゴヌクレオチドの組成によらず、DNAまたはRNA塩基と等価なオリゴヌクレオチドの各単位が「ヌクレオチド」と呼ばれる。
用語「タグ」、本明細書で使用する場合、特異的結合性分子が入手可能であり、したがって、前記タグを有するポリペプチドの検出/精製を可能とするいずれのアミノ酸配列にも関する。
用語「ω−ヒドロキシ酸」、本明細書で使用する場合、一般式HO−(CH2)m−COOH(式中、mは2〜30の値を有する)を有する化合物を意味する。
用語「ω−メルカプト酸」は、本明細書で使用する場合、一般式HS−(CH2)p−COOH(式中、mは2〜30の値を有する)を有する化合物を意味する。
発明の詳細な説明
AQC−CTCとビオチン結合性分子の非共有結合複合体
本発明者らは、ストレプトアビジンがAQC−CTCと相互作用してそれらの蛍光強度の増強をもたらすこと、およびこの結合はビオチンまたはビオチン化分子の存在下で逆転させて、それにより、AQC−CTCおよびストレプトアビジンを含んでなる複合体の蛍光強度の低下をもたらし得ることを見出した。
AQC−CTCとビオチン結合性分子の非共有結合複合体
本発明者らは、ストレプトアビジンがAQC−CTCと相互作用してそれらの蛍光強度の増強をもたらすこと、およびこの結合はビオチンまたはビオチン化分子の存在下で逆転させて、それにより、AQC−CTCおよびストレプトアビジンを含んでなる複合体の蛍光強度の低下をもたらし得ることを見出した。
よって、第1の態様において、本発明は、ビオチン結合性分子と、一般式(I)の少なくとも2つの異なるサイズの金属原子量子クラスター(AQC)としてのMnおよびM’n’の電荷移動複合体:
Mn +M’n´ − (I)
[式中、
金属AQCの金属MおよびM’は、同じまたは異なる金属であり、
Mnは、その酸化形態Mn +で存在するより小さいAQCであり、
M’n’は、その還元形態M’n’ −で存在するより大きいAQCであり、
Mn +とM’n’ −とは静電相互作用により結合され、
nおよびn’はそれぞれ、MおよびM’の金属原子数であり、かつ、
nはn’より小さい]
とを含有し、前記ビオチン結合性分子と前記電荷移動複合体とが共有結合されていない複合体に関する。
Mn +M’n´ − (I)
[式中、
金属AQCの金属MおよびM’は、同じまたは異なる金属であり、
Mnは、その酸化形態Mn +で存在するより小さいAQCであり、
M’n’は、その還元形態M’n’ −で存在するより大きいAQCであり、
Mn +とM’n’ −とは静電相互作用により結合され、
nおよびn’はそれぞれ、MおよびM’の金属原子数であり、かつ、
nはn’より小さい]
とを含有し、前記ビオチン結合性分子と前記電荷移動複合体とが共有結合されていない複合体に関する。
少なくとも2つの異なるサイズの金属原子量子クラスター(AQC)の電荷移動複合体、特に、有機配位子をさらに含んでなる電荷移動複合体(ここで、前記有機配位子は、原子量子クラスターMnおよびM’n’に結合されたω−ヒドロキシ酸およびω−メルカプト酸などの両親媒性分子である)は、下記の工程:
a)ω−ヒドロキシ酸とω−メルカプト酸とを水性媒体中、塩基の存在下で混合することによりナノソームを作製する工程、
b)工程a)で作製された混合物に少なくとも1つの金属塩を添加する工程、
c)工程b)で得られた混合物を還元する工程、および
d)工程c)で得られた混合物中に存在するナノソームを崩壊させる工程
を含んでなる。
a)ω−ヒドロキシ酸とω−メルカプト酸とを水性媒体中、塩基の存在下で混合することによりナノソームを作製する工程、
b)工程a)で作製された混合物に少なくとも1つの金属塩を添加する工程、
c)工程b)で得られた混合物を還元する工程、および
d)工程c)で得られた混合物中に存在するナノソームを崩壊させる工程
を含んでなる。
用語「ナノソーム」は、本発明の範囲内で、人工的に作製されたナノメートルサイズの小胞に関する。したがって、用語「ナノソーム」は、脂肪族−(CH2)n−鎖の各末端の一方に、または脂肪族CH3−(CH2)n−鎖の後ろから3番目のχ、後ろから2番目のψの位置に結合された2つの親水基を有する一層の両親媒性分子(例えば、脂質)により形成された球状のナノメートル超分子構造を意味する。
本発明のナノソームの前記単層を形成する両親媒性分子は、
・脂肪鎖の一末端における、小胞の外面にある例えばカルボキシル基(COOH)、カルボン酸基(COO−)またはリン酸基(PO4 −)などの親水基および
・脂肪族CH3−(CH2)n−鎖の後ろから3番目のχ、後ろから2番目のψの位置における、または脂肪族−(CH2)n−鎖の最後のωの位置における、例えば、−OH、−SH、−NH2、−NH−、−Cl、−PH3、−SR、−OR、−NR2、−NHR、または−NR−などの基での置換(ここで、Rは、脂肪鎖の他の末端においてまたは前記脂肪鎖の親水基に対する最終的な位置において、小胞の内部に向かって配置されるナノソームを形成し得る、短い炭化水素鎖C1−C4の有機基を表し、前記基は、10nm以下、好ましくはおよそ5nm以下、より好ましくは0.8〜4nmの内径を有するナノキャビティーを形成する。特定の実施形態では、ナノキャビティーの内径は、およそ1.5〜1.8nmである)
を含んでなる。
・脂肪鎖の一末端における、小胞の外面にある例えばカルボキシル基(COOH)、カルボン酸基(COO−)またはリン酸基(PO4 −)などの親水基および
・脂肪族CH3−(CH2)n−鎖の後ろから3番目のχ、後ろから2番目のψの位置における、または脂肪族−(CH2)n−鎖の最後のωの位置における、例えば、−OH、−SH、−NH2、−NH−、−Cl、−PH3、−SR、−OR、−NR2、−NHR、または−NR−などの基での置換(ここで、Rは、脂肪鎖の他の末端においてまたは前記脂肪鎖の親水基に対する最終的な位置において、小胞の内部に向かって配置されるナノソームを形成し得る、短い炭化水素鎖C1−C4の有機基を表し、前記基は、10nm以下、好ましくはおよそ5nm以下、より好ましくは0.8〜4nmの内径を有するナノキャビティーを形成する。特定の実施形態では、ナノキャビティーの内径は、およそ1.5〜1.8nmである)
を含んでなる。
好ましい実施形態では、用語「ナノソーム」は、ω−ヒドロキシ酸およびω−メルカプト酸により形成される球状ナノ超分子構造を意味する。この特定の実施形態では、ナノソームは、上記で定義されるω−ヒドロキシ酸(HO−(CH2)m−COOH)およびω−メルカプト酸(HS−(CH2)p−COOH)を含んでなる。ナノソーム中に存在するω−ヒドロキシ酸およびω−メルカプト酸は、酸基−COOH、(または対応する酸の塩が使用される場合には−COO−)をナノシステム、すなわち、ナノソームの外面に向け、かつ、−OHおよび−SH基をナノソームの内腔を形成している内部に向けた、球状単層を形成しており、その結果、2つのおよその同心球が形成され、または文献で呼称されているように脂肪酸「bola」の形態となる。この球状単層は、およそ2〜10nm、好ましくはおよそ5nmの厚さを有し得る。
ナノソームの内腔は閉じられている。前記内腔の内径は10nm以下、好ましくはおよそ5nm以下であり、より好ましくは、前記内腔の内径はおよそ0.8〜4nmである。特定の実施形態では、この内部ナノキャビティーの直径は、およそ1.5〜1.8nmである。ナノソームのこの特定の実施形態では、前記ナノキャビティーは、ヒドロキシル−OH、およびメルカプト−SH基により形成されるが、これらの官能基を、金属とも相互作用する−NH2、−NH−、−Cl、−PH3、−SR、−OR、−NR2、−NHR、−NR−(ここで、Rは、ナノソームを形成し得る短い炭化水素鎖C1−C4の有機基を表す)などの他のものに交換することも可能である。
ω−ヒドロキシ酸とω−メルカプト酸を混合することによりナノソームを調製する工程a)における塩基として、水酸化テトラブチルアンモニウム、水酸化テトラオクチルアンモニウム、水酸化トリエチルベンジルアンモニウム、水酸化トリ−n−オクチルメチルアンモニウム、水酸化トリメチルデシルアンモニウム、水酸化テトラメチルアンモニウム、水酸化テトラエチルアンモニウムまたは対イオンなどの嵩のある基を有する他の任意の水酸化物、好ましくは、水酸化テトラブチルアンモニウムを使用することができる。
工程b)では、遷移金属の金属塩またはそれらの組合せが使用可能である。金属塩の非限定的な例は、遷移金属の硝酸塩、硫酸塩、亜硫酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、リン酸塩、水酸化塩、シアン酸塩、カルボン酸塩、チオリンゴ酸塩、チオグルコサート(thioglucosates)である。単独の金属塩としてまたは他の金属塩と組み合わせて使用されるこれらの金属塩の例は、AgNO3、CH3COOAg、Ag3AsO4、AgBrO3、AgBr、Ag2CO3、AgClO3、AgCl、AgCrO4、AgOCN、AgIO3、AgI、Ag2O、AgClO4、Ag3PO4、Ag2SO4、Ag2S、Ag2SO3、CuSO4、CuCl2、CuBr2、CuI2、Cu2S、CuSCN、CuCN、CuCO3、Cu2O、Cu(OH)2、Cu(NO3)2、Cu(ClO4)2、Cu(HCO2)2またはCu(CO2CH3)2である。組み合わせて使用される金の金属塩の非限定的な例は、HAuCl4、AuCl、AuCl3、HAuCl4、HAuCl4・aq、KAuCl4、LiAuCl4,(CH3)2SAuCl、C3H9AuClP、C6H15AuClP、C18H15AuClP、C8H11AuClP、C5H5AuCl3N、(C4H9)3PAuCl、C27H36AuClN2、C21H12AuClF9P、C20H27AuClP、C33H49AuClP、C42H63AuClO3P、C21H24AuClN2、C35H49AuF6NO4PS2または(C20H15AuF6NO4PS2)・2C7H8である。
工程c)で得られる混合物を還元するために工程c)で使用される還元系または還元剤の非限定的な例は、NaBH4、DIBAH、LiAlH4、N2H4またはSnCl2およびまた、次亜リン酸ナトリウム、アミン、糖、有機酸、ポリビニルピロリドンなどのポリマー、UV−VIS照射、超音波および光還元などのより温和な還元剤であり得る。
本方法の工程b)およびc)の後、「AQCを含んでなるナノソーム」が形成される。これらの「AQCを含んでなるナノソーム」は、それらの内腔に、少なくとも2つの異なるサイズのAQC、すなわち、MnおよびM’n’を含んでなる、すなわち、封入されている。
これらの「AQCを含んでなるナノソーム」の特定の例は、これらのナノシステム内部の金粒子合成を記載しているGaillard, C., Journal of Colloid and Interface Science, 2209, 337, 2, 610-613に記載されている。
ナノソームを崩壊させる工程は、従前に合成されたナノソームの不安定化プロセスである。この工程は、種々の機構によって達成できる。好ましい実施形態では、ナノソームを崩壊させる、またはナノソームを不安定化させる工程は超遠心分離の手段によりなされるが、熱処理またはpH変化など、当技術分野で公知の他の任意の手段もナノソームの崩壊に有用であり得る。電荷移動機構は、ナノソームを崩壊させる工程中に生じる。したがって、ナノソームが不安定化され、一般式(I)の電荷移動複合体が形成される。
一実施形態では、金属性AQCの金属MおよびM’は遷移金属またはそれらの組合せから選択され、好ましくは、遷移金属はAu、Ag、Co、Cu、Pt、Fe、Cr、Pd、Ni、Rhおよびそれらの組合せからなる群から選択され、より好ましくは、それらはAu、Ag、Cuおよびそれらの組合せからなる群から選択され、より好ましくは、遷移金属はAu、Agおよびそれらの組合せからなる群から選択される。
蛍光の励起波長および発光波長はAQCのサイズに依存するので、必要なサイズのAQCの形成を指定することにより、励起波長および発光波長を選択することができる。
好ましい実施形態では、少なくとも2つのAQCとしてのMnとM’n’との間で1個の電子だけが移動し、したがって、イオン形態Mn +、すなわち、Mnの酸化形態、およびM’n’ −、すなわち、M’n’の還元形態が生じ、ここで、「+」は正電荷であり、「−」は負電荷である。
いくつかの実施形態では、nおよびn’は、2〜309、2〜102、2〜55、または2〜25の金属原子数である。いくつかの実施形態では、nとn’との差は5〜50原子である。
さらなる実施形態では、nとn’との差は5〜50原子、または5〜25原子である。
いくつかの実施形態では、CTCは、原子量子クラスターMnおよびM’n’に結合されたω−ヒドロキシ酸配位子およびω−メルカプト酸配位子をさらに含んでなる。
いくつかの実施形態では、ビオチン結合性分子は、アビジン、ストレプトアビジン、または実質的にビオチン結合能を保有し、AQC−CTCの蛍光発光パラメーターの少なくとも1つに変化をもたらす様式でAQC−CTCと相互作用するその任意の変異体である。アビジンまたはストレプトアビジン類似体または変異体がそれらのビオチン結合能を保有しているかどうかを検出するための方法は当技術分野で広く知られており、例えば、光ファイバーのチップに結合された一層の分子がその分子層から反射された白色光に干渉縞を作り出すという、BioLayer Interferometry(BLI)に基づくWO2012058635に記載の方法が含まれる。光ファイバーのチップに結合された分子の数の変化は、干渉縞に測定可能なシフトを生じる。この波長のシフトは、分子層の厚さの直接的尺度である。さらに、このシフトは実時間で測定できることから、詳細は述べないが、会合速度および解離速度を決定することができる。
あるアビジンまたはストレプトアビジン変異体がAQC−の蛍光発光のパラメーターの少なくとも1つに変化をもたらす様式でAQC−CTCと相互作用するかどうかを決定するために好適な方法も当業者に利用可能であり、例えば、AQC−CTCをストレプトアビジン変異体と接触させ、蛍光強度の変化(増強)を判定する、本出願の実施例1に記載の方法が含まれる。
いくつかの実施形態では、ビオチン結合性分子はストレプトアビジンであり、またはそれぞれ天然ストレプトアビジンまたはアビジンの結合親和性の少なくとも50パーセント以上といったビオチンに対する実質的結合活性を保持するアビジンフラグメントも使用可能である。好ましくは、ビオチンに対するアビジン変異体の親和性は、少なくとも1015M−1、1014M−1、1013M−1、1012M-1、1010M−1または109M−1である。
便宜上、本明細書において、用語「アビジン」および「ストレプトアビジン」は、本明細書で使用する場合、ビオチン結合能およびAQC−CTCによる蛍光発光に対する効果が実質的に保存されている、これらの結合対メンバーのビオチン結合フラグメント、突然変異体、およびコアフォームを包含するものとする。アビジンおよびストレプトアビジンは、商業的供給者から入手可能である。さらに、ストレプトアビジンおよびアビジンをコードする核酸配列、ならびにストレプトアビジンおよびアビジンアミノ酸配列は、例えば、GenBank受託番号X65082;X03591;NM−−205320;X05343;Z21611;およびZ21554に見出すことができる。
いくつかの実施形態では、本発明における使用に好適なアビジンおよびストレプトアビジン変異体としては、限定されるものではないが、
・「コアストレプトアビジン」、すなわち、ストレプトアビジン残基13〜138、14〜138、13〜139および14〜139を含み得る全長ストレプトアビジンポリペプチドの末端切断型。例えば、Pahler et al., (J Biol Chem 1987:262:13933-37)参照、
・ビオチンとの強い結合を保持するストレプトアビジンおよびアビジンの末端切断型(例えば、Sano et al., (J Biol Chem 1995;270:28204-09)(コアストレプトアビジン変異体16〜133および14〜138を記載)、米国特許第6,022,951号参照)、
・実質的なビオチン結合活性または増強されたビオチン結合活性を保持するストレプトアビジンの突然変異体およびストレプトアビジンのコアフォーム。Chilcoti et al., Proc Natl Acad Sci USA 1995;92(5):1754-8; Reznik et al., Nat Biotechnol 1996;14(8):1007-1011参照、
・潜在的T細胞エピトープまたはリンパ球エピトープを除去するように部位特異的突然変異誘発により改変された突然変異体などの免疫原性が低減された突然変異体。Meyer et al., Protein Sci 2001;10:491-503参照、
・実質的なビオチン結合活性または増強されたビオチン結合活性を保持するアビジンの突然変異体およびアビジンのコアフォームを使用可能である。Hiller et al., J Biochem 1991;278:573-85; Livnah et al. Proc Natl Acad Sci USA 1993;90:5076-80参照、
・グリコシル化の完全または部分的修飾から生じるものなどのアビジンの化学修飾から生じる変異体およびそれらのフラグメント、ならびにニュートラアビジンとして知られる完全に脱グリコシル化されたアビジン変異体、
・WO05047317A1に記載されているようなアビジン突然変異体、
・WO06045891に記載されているようなアビジン様タンパク質、
・WO0198349に記載されているような組換えアビジン、
・WO0027814に記載されているようなアビジン変異体、
・WO06084388に記載されているようなモノマーストレプトアビジン、
・WO06058226に記載されているような修飾ストレプトアビジンダイマー、
・WO04018509に記載されているようなビオチン結合能を有するタンパク質、
・WO9840396に記載されているようなビオチンに対してより高い親和性を有するストレプトアビジン、
・WO9640761に記載されているような修飾ストレプトアビジンおよびアビジン 分子、
・WO9711183に記載されているようなストレプトアビジン突然変異体、
・WO9624606に記載されているような親和性が改変されたストレプトアビジン
が含まれる。
・「コアストレプトアビジン」、すなわち、ストレプトアビジン残基13〜138、14〜138、13〜139および14〜139を含み得る全長ストレプトアビジンポリペプチドの末端切断型。例えば、Pahler et al., (J Biol Chem 1987:262:13933-37)参照、
・ビオチンとの強い結合を保持するストレプトアビジンおよびアビジンの末端切断型(例えば、Sano et al., (J Biol Chem 1995;270:28204-09)(コアストレプトアビジン変異体16〜133および14〜138を記載)、米国特許第6,022,951号参照)、
・実質的なビオチン結合活性または増強されたビオチン結合活性を保持するストレプトアビジンの突然変異体およびストレプトアビジンのコアフォーム。Chilcoti et al., Proc Natl Acad Sci USA 1995;92(5):1754-8; Reznik et al., Nat Biotechnol 1996;14(8):1007-1011参照、
・潜在的T細胞エピトープまたはリンパ球エピトープを除去するように部位特異的突然変異誘発により改変された突然変異体などの免疫原性が低減された突然変異体。Meyer et al., Protein Sci 2001;10:491-503参照、
・実質的なビオチン結合活性または増強されたビオチン結合活性を保持するアビジンの突然変異体およびアビジンのコアフォームを使用可能である。Hiller et al., J Biochem 1991;278:573-85; Livnah et al. Proc Natl Acad Sci USA 1993;90:5076-80参照、
・グリコシル化の完全または部分的修飾から生じるものなどのアビジンの化学修飾から生じる変異体およびそれらのフラグメント、ならびにニュートラアビジンとして知られる完全に脱グリコシル化されたアビジン変異体、
・WO05047317A1に記載されているようなアビジン突然変異体、
・WO06045891に記載されているようなアビジン様タンパク質、
・WO0198349に記載されているような組換えアビジン、
・WO0027814に記載されているようなアビジン変異体、
・WO06084388に記載されているようなモノマーストレプトアビジン、
・WO06058226に記載されているような修飾ストレプトアビジンダイマー、
・WO04018509に記載されているようなビオチン結合能を有するタンパク質、
・WO9840396に記載されているようなビオチンに対してより高い親和性を有するストレプトアビジン、
・WO9640761に記載されているような修飾ストレプトアビジンおよびアビジン 分子、
・WO9711183に記載されているようなストレプトアビジン突然変異体、
・WO9624606に記載されているような親和性が改変されたストレプトアビジン
が含まれる。
エクストラアビジン(Extravidin)(Sigma−Aldrich)、ニュートラアビジン(NeutrAvidin)(Thermo Scientific)、ニュートラアビジン(NeutrAvidin)(Invitrogen)およびニュートラライト(NeutraLite)(Belovo)などの種々のアビジン変異体が市販されている。
いくつかの実施形態では、ビオチン結合性分子は、ストレプトアビジンの機能的に等価な変異体である。本明細書で使用される場合、ストレプトアビジンの「機能的に等価な変異体」は、ストレプトアビジンのビオチン結合能を実質的に保有するポリペプチドと理解される。ストレプトアビジンVの機能的に等価な変異体には、ストレプトアビジン(strpetavidin)とそれらの全長にわたって少なくとも60%、65%、70%、72%、74%、76%、78%、80%、90%、95%、97%、99%の類似性または同一性を示すポリペプチドが含まれる。
用語「非共有結合的に結合される」とは、本明細書で使用する場合、ビオチン結合性分子および電荷移動複合体が、CTC−AQCの原子とビオチン結合性分子の原子との間に共有結合を含まない分子間力により相互作用することを示すために使用される。いくつかの実施形態では、CTC−AQCおよびビオチン結合性分子は、水素結合、疎水性相互作用、イオン結合またはそれらの組合せにより連結される。
いくつかの実施形態では、CTCは、それに結合された有機配位子をさらに含んでなる。CTCに結合され得る「有機配位子」は少なくとも2つの異なるタイプの有機配位子であり、好ましくは、前記少なくとも2つの異なるタイプの有機配位子は、ω−ヒドロキシ酸(HO−(CH2)m−COOH)配位子およびω−メルカプト酸(HS−(CH2)p−COOH)配位子から選択され、ここで、mおよびpは2〜30の値を有し、好ましくは、mおよびpは10〜20の値を有する。特定の実施形態では、mおよびpは15の値を有する。別の特定の実施形態では、mおよびpは11の値を有する。mとpの値は、異なっていても同じであってもよい。mとpが異なる場合、それらの間の差は炭素6個未満であり、好ましくは、mとpとの値の差は1〜4である。好ましい実施形態では、mとpは同じである。少なくとも2つの異なるタイプの有機配位子がω−ヒドロキシ酸(HO−(CH2)m−COOH)配位子およびω−メルカプト酸(HS−(CH2)p−COOH)配位子から選択される場合、酸基−COOH(または対応する酸の塩が使用される場合には−COO−)はナノ化合物の外面に向けられ、−OH基および−SH基は内部、すなわち、それらに結合、付加または配位されているイオン化AQCとしてのMn+およびM’n’−に向けられる。
別の実施形態では、電荷移動複合体に結合され得る「有機配位子」は、ヒドロキシル−OH基、またはメルカプト−SH基以外の官能基、例えば、−NH2、−NH−、−Cl、−PH3、−SR、−OR、−NR2、−NHR、−NR−を有し、ここで、Rは、AQCまたはイオン化AQCとしてのMn +およびM’n’−を結合、付加または配位可能な短い炭化水素鎖C1−C4の有機基を表す。ω−ヒドロキシ酸(HO−(CH2)m−COOH)およびω−メルカプト酸(HS−(CH2)p−COOH)配位子のヒドロキシル−OHまたはメルカプト−SH基をそれらもまたAQCの金属と相互作用する上述のこれらの他の基に交換することも可能である。
いくつかの実施形態では、ビオチン結合性分子がストレプトアビジンである場合、本発明による複合体は、4つのストレプトアビジンモノマーを含有し、可変数のCTC−AQCを有するホモテトラマーである。いくつかの実施形態では、前記複合体は、ストレプトアビジンのホモテトラマーおよび複合体当たり少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも8、少なくとも12、少なくとも16、少なくとも20またはそれを超えるCTC−AQCにより形成される。
AQC−CTCおよびビオチン結合性分子を含んでなるパーツキット
別の実施形態では、本発明は、
(i)少なくとも2つの異なるサイズの金属原子量子クラスター(AQC)としてのMnおよびM’nの電荷移動複合体であって、上記で定義される式Iを有し、かつ、前記金属AQCのMおよびM’は同じまたは異なる金属であり、Mnはその酸化形態Mn +で存在するより小さいAQCであり、M’n’はその還元形態M’n’ −で存在するより大きいAQCであり、Mn +とM’n’ −は静電相互作用により結合され、nおよびn’はそれぞれ金属原子数である、電荷移動複合体と、
(ii)ビオチン結合性分子と
を一緒にまたは別個に含んでなるパーツキットに関する。
別の実施形態では、本発明は、
(i)少なくとも2つの異なるサイズの金属原子量子クラスター(AQC)としてのMnおよびM’nの電荷移動複合体であって、上記で定義される式Iを有し、かつ、前記金属AQCのMおよびM’は同じまたは異なる金属であり、Mnはその酸化形態Mn +で存在するより小さいAQCであり、M’n’はその還元形態M’n’ −で存在するより大きいAQCであり、Mn +とM’n’ −は静電相互作用により結合され、nおよびn’はそれぞれ金属原子数である、電荷移動複合体と、
(ii)ビオチン結合性分子と
を一緒にまたは別個に含んでなるパーツキットに関する。
いくつかの実施形態では、ビオチン結合性分子は、ストレプトアビジンまたは本発明の複合体に関して言及されるビオチン結合性分子のいずれかである。
いくつかの実施形態では、金属原子量子クラスターの金属MおよびMは’、遷移金属またはそれらの組合せから独立に選択される。いくつかの実施形態では、金属原子量子クラスターの金属MおよびM’は、遷移金属Au、Ag、Cuおよびそれらの組合せ、より好ましくは、Au、Agおよびそれらの組合せから独立に選択される。いくつかの実施形態では、nおよびn’は、2〜309、2〜102、2〜55、または2〜25の値の金属原子数をとる。いくつかの実施形態では、nとn’との差は、5〜50原子である。いくつかの実施形態では、電荷移動複合体は、一般式HO−(CH2)m−COOH(式中、mは2〜30の値を有する)またはHS−(CH2)p−COOH(式中、mは2〜3の値を有する)を有する原子量子クラスターMnおよびM’n’に結合されたω−ヒドロキシ酸配位子およびω−メルカプト酸配位子をさらに含んでなり、ここで、mとpの値およびそれらの値の間の差に関する種々の実施形態は、本発明の複合体に関して記載されている通りである。
いくつかの実施形態では、キットの成分は個別の容器内に見られる。
キットの成分を包装するのに好適な材料としては、結晶、プラスチック(例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート)、ボトル、バイアル、紙、または外被などが含まれる。さらに、本発明のキットは、キット内にある種々の成分の同時使用、逐次使用または個別使用に関する説明書を含み得る。前記説明書は、印刷物の形態、または電子保存媒体(磁気ディスク、テープなど)、光媒体(CD−ROM、DVD)などの、対象者が読むことができるように説明書を保存することができる電子支援の形態であり得る。それに加えてまたはその代わりに、媒体は前記説明書を提供するインターネットアドレスを含み得る。
AQC−CTCを用いたビオチン化分子の検出のための競合アッセイ
本発明者らは、AQC−CTCの蛍光強度がストレプトアビジンの存在下で増強されること、およびこの蛍光の増強がビオチンまたはビオチン化分子の存在下で逆転され、それにより、AQC−CTCの蛍光強度の変化を測定することによってサンプル中のビオチンまたはビオチン化分子の検出を可能とすることを見出した。いずれの理論にも縛られることを望むものではないが、AQC−CTCはビオチン結合性分子と、AQC−CTCにより発せられる蛍光強度の増強をもたらすように相互作用することができると考えられる。この結合はビオチンまたはビオチン類似体の存在下では逆転し、AQC−CTCの発光およびそれらの蛍光の低下をもたらす。
本発明者らは、AQC−CTCの蛍光強度がストレプトアビジンの存在下で増強されること、およびこの蛍光の増強がビオチンまたはビオチン化分子の存在下で逆転され、それにより、AQC−CTCの蛍光強度の変化を測定することによってサンプル中のビオチンまたはビオチン化分子の検出を可能とすることを見出した。いずれの理論にも縛られることを望むものではないが、AQC−CTCはビオチン結合性分子と、AQC−CTCにより発せられる蛍光強度の増強をもたらすように相互作用することができると考えられる。この結合はビオチンまたはビオチン類似体の存在下では逆転し、AQC−CTCの発光およびそれらの蛍光の低下をもたらす。
一態様において、本発明は、サンプル中のビオチン化分子の検出のための方法であって、
(i)前記サンプルと請求項1〜4のいずれか一項に記載の複合体を、前記ビオチン化分子が前記複合体中のビオチン結合性分子に結合するのに十分な条件下で接触させる工程、および
(ii)工程(i)の接触後に、AQCの励起波長での前記サンプルの励起に応答したAQCによる蛍光発光の強度の変化を検出する工程
を含んでなり、接触工程後のAQCにより発せられる蛍光強度の低下が、前記サンプル中にビオチン化分子が存在することを示す方法に関する。
(i)前記サンプルと請求項1〜4のいずれか一項に記載の複合体を、前記ビオチン化分子が前記複合体中のビオチン結合性分子に結合するのに十分な条件下で接触させる工程、および
(ii)工程(i)の接触後に、AQCの励起波長での前記サンプルの励起に応答したAQCによる蛍光発光の強度の変化を検出する工程
を含んでなり、接触工程後のAQCにより発せられる蛍光強度の低下が、前記サンプル中にビオチン化分子が存在することを示す方法に関する。
第1の工程において、ビオチン化分子を含有する可能性のあるサンプルを、ビオチン結合性分子とCTC−AQCを含んでなる組成物と接触させる。
いくつかの実施形態では、金属原子量子クラスターの金属MおよびM’は、遷移金属またはそれらの組合せから独立に選択される。いくつかの実施形態では、MおよびM’は、遷移金属Au、Ag、Cuおよびそれらの組合せ、より好ましくは、Au、Agおよびそれらの組合せから独立に選択される。
いくつかの実施形態では、nおよびn’は、2〜309、2〜102、2〜55、または2〜25の金属原子数である。いくつかの実施形態では、nとn’との差は5〜50原子である。
いくつかの実施形態では、AQC−CTCは、原子量子クラスターMnおよびM’n’に結合されたω−ヒドロキシ酸配位子およびω−メルカプト酸配位子をさらに含んでなる。いくつかの実施形態では、原子量子クラスターMnおよびM’nに結合されたω−ヒドロキシ酸配位子およびω−メルカプト酸配位子は、一般式HO−(CH2)m−COOH(式中、mは2〜30の値を有する)またはHS−(CH2)p−COOH(式中、mは2〜3の値を有する)を有し、ここで、mとpの値およびそれらの値の間の差に関する種々の実施形態は、本発明の複合体に関して記載されている通りである。
いくつかの実施形態では、ビオチン結合性分子は、アビジン、ストレプトアビジン、または実質的にビオチン結合能を保有し、AQC−CTCの蛍光発光パラメーターの少なくとも1つに変化をもたらす様式でAQC−CTCと相互作用するその任意の変異体である。アビジンまたはストレプトアビジン類似体または変異体がそれらのビオチン結合能を保有しているかどうかを検出するための方法は当技術分野で広く知られており、例えば、光ファイバーのチップに結合された一層の分子がその分子層から反射された白色光に干渉縞を作り出すという、BioLayer Interferometry(BLI)に基づくWO2012058635に記載の方法が含まれる。光ファイバーのチップに結合された分子の数の変化は、干渉縞に測定可能なシフトを生じる。この波長のシフトは、分子層の厚さの直接的尺度である。さらに、このシフトは実時間で測定できることから、会合速度および解離速度を決定することができる。
あるアビジンまたはストレプトアビジン変異体がAQC−の蛍光発光のパラメーターの少なくとも1つに変化をもたらす様式でAQC−CTCと相互作用するかどうかを決定するために好適な方法も当業者に利用可能であり、例えば、AQC−CTCをストレプトアビジン変異体と接触させ、蛍光強度の変化(増強)を判定する、本出願の実施例1に記載の方法が含まれる。
いくつかの実施形態では、ビオチン結合性分子はストレプトアビジンであり、またはそれぞれ天然ストレプトアビジンまたはアビジンの結合親和性の少なくとも50パーセント以上といったビオチンに対する実質的結合活性を保持するアビジンフラグメントも使用可能である。好ましくは、ビオチンに対するアビジン変異体の親和性は、少なくとも1015M−1、1014M−1、1013M−1、1012M-1、1010M−1または109M−1である。
いくつかの実施形態では、「ビオチン結合性分子」は、AQC−CTCとビオチン結合性分子の非共有結合複合体に関して定義される。いくつかの実施形態では、本発明における使用に好適なアビジンおよびストレプトアビジン変異体としては、限定されるものではないが、コアストレプトアビジン、ストレプトアビジンおよびアビジンの末端切断型(例えば、Sano et al., (J Biol Chem 1995;270:28204-09)(コアストレプトアビジン変異体16〜133および14〜138を記載)(米国特許第6,022,951号);実質的なビオチン結合活性または増強されたビオチン結合活性を保持するストレプトアビジンの突然変異体およびストレプトアビジンのコアフォーム(Chilcoti et al., Proc Natl Acad Sci USA 1995;92(5):1754-8; Reznik et al., Nat Biotechnol 1996;14(8):1007-1011参照);免疫原性が低減されたストレプトアビジンの突然変異体およびストレプトアビジンのコアフォーム、例えば、潜在的T細胞エピトープまたはリンパ球エピトープを除去するように部位特異的突然変異誘発により改変された突然変異体(Meyer et al., Protein Sci 2001;10:491-503参照);実質的なビオチン結合活性または増強されたビオチン結合活性を保持するアビジンの突然変異体およびアビジンのコアフォーム(Hiller et al.. J Biochem 1991;278:573-85; Livnah et al. Proc Natl Acad Sci USA 1993;90:5076-80参照);グリコシル化の完全または部分的修飾から生じるものなどのアビジンの化学修飾から生じる変異体およびそれらのフラグメント、ならびにニュートラアビジンとして知られる完全に脱グリコシル化されたアビジン変異体;WO05047317A1に記載されているようなアビジン突然変異体;WO06045891に記載されているようなアビジン様タンパク質;WO200198349に記載されているような組換えアビジン;WO0027814に記載されているようなアビジン変異体;WO06084388に記載されているようなモノマーストレプトアビジン;WO06058226に記載されているような修飾ストレプトアビジンダイマー、WO04018509に記載されているようなビオチン結合タンパク質、WO9840396に記載されているようなビオチンに対してより高い親和性を有するストレプトアビジン;WO9640761に記載されているような修飾ストレプトアビジンおよびアビジン分子;WO9711183に記載されているようなストレプトアビジン突然変異体;WO9624606に記載されているような親和性が改変されたスストレプトアビジンが含まれ、ならびにエクストラアビジン(Sigma−Aldrich)、ニュートラアビジン(Thermo Scientific)、ニュートラアビジン (Invitrogen)およびニュートラライト(NeutraLite)(Belovo)などの種々のアビジン変異体が市販されている。
いくつかの実施形態では、ビオチン化分子は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、チラミン、多糖、イオン錯化部分、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、ハプテン、ソラレン/プソラレン、薬物、ホルモン、脂質、脂質集合体、ポリマー、ポリマー微粒子、生体細胞またはウイルスである。より一般には、基質はペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、または核酸である。
一実施形態では、ビオチン化分子はアミノ酸(保護されているか、またはホスホネート、炭水化物、もしくはC1〜C25カルボン酸により置換されているものを含む)であるか、またはペプチドもしくはタンパク質などのアミノ酸のポリマーである。ペプチドの好ましいコンジュゲートは、少なくとも5個のアミノ酸、より好ましくは、5〜36個のアミノ酸を含有する。好ましいペプチドとしては、限定されるものではないが、ニューロペプチド、サイトカイン、毒素、プロテアーゼ基質、およびプロテインキナーゼ基質が含まれる。好ましいタンパク質コンジュゲートとしては、酵素、抗体、レクチン、糖タンパク質、ヒストン、アルブミン、リポタンパク質、アビジン、ストレプトアビジン、Aタンパク質、Gタンパク質、フィコビリタンパク質およびその他の蛍光タンパク質、ホルモン、毒素、ケモカインおよび増殖因子が含まれる。ある好ましい態様では、複合タンパク質は、アロフィコシアニン、フィコシアニン、フィコエリトリン、アロフィコシアニンB、B−フィコエリトリン、およびフィコエリトリシアニンなどのフィコビリタンパク質である(例えば、Roederer(1998)に対する米国特許第5,714,386号参照)。
一実施形態では、生体分子は抗体(完全抗体、抗体フラグメント、および抗体血清などを含む)、アミノ酸、アンギオスタチンまたはエンドスタチン、アビジンまたはストレプトアビジン、ビオチン(例えば、アミドビオチン、ビオシチン、デスチオビオチンなど)、血液成分タンパク質(例えば、アルブミン、フィブリノゲン、プラスミノーゲンなど)、デキストラン、酵素、酵素阻害剤、IgG結合タンパク質(例えば、Aタンパク質、Gタンパク質、A/Gタンパク質など)、蛍光タンパク質(例えば、フィコビリタンパク質、エクオリン、緑色蛍光タンパク質など)、増殖因子、ホルモン、レクチン(例えば、コムギ胚芽凝集素、コンカナバリン(conconavalin)Aなど)、リポ多糖、金属結合タンパク質(例えば、カルモジュリンなど)、微生物またはその一部(例えば、細菌、ウイルス、酵母など)、ニューロペプチドおよび他の生物学的に活性な因子(例えば、デルモルフィン、デルトロピン、エンドモルフィン、エンドルフィン、腫瘍壊死因子など)、非生体微粒子(例えば、磁性流体、金、ポリスチレンなどの粒子)、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド毒素(例えば、アパミン、ブンガロトキシン、ファロイジンなど)、リン脂質結合タンパク質(例えば、アネキシンなど)、小分子薬物(例えば、メトトレキサートなど)、構造タンパク質(例えば、アクチン、フィブロネクチン、ラミニン、微小管結合タンパク質、チューブリン(tublin)など)、またはチラミドが含まれる。
別の実施形態では、生体分子は、核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたは核酸ポリマーである。好ましい核酸ポリマーは、一本鎖もしくは多重鎖の天然もしくは合成DNAもしくはRNA、DNAもしくはRNAオリゴヌクレオチド、またはDNA/RNAハイブリッドであるか、あるいはモルホリン誘導体化ホスフェートなどの非通常リンカー、またはN−(2−アミノエチル)グリシン単位などのペプチド核酸が組み込まれている。核酸が合成オリゴヌクレオチドである場合、それは一般に50個未満のヌクレオチド、より一般には25個未満のヌクレオチドを含有する。
別の実施形態では、生体分子は炭水化物であり、一般に、デキストラン、ヘパリン、グリコーゲン、アミロペクチン、マンナン、イヌリン、デンプン、アガロースおよびセルロースなどの多糖類である。あるいは、炭水化物は多糖であり、リポ多糖である。好ましい多糖コンジュゲートは、デキストランコンジュゲート、またはリポ多糖コンジュゲートである。
いくつかの実施形態では、ビオチン結合性分子は、ビオチン結合性分子に対してビオチンよりも低い親和性を示すビオチン類似体との複合体として提供される。これらのビオチン類似体は、ビオチンの不在下でビオチン結合性分子と結合することができる。もしサンプルがビオチン化分子を含有すれば、ビオチンはビオチン結合部位に対するそのより高い親和性のためにビオチン結合性分子から前記類似体を解離させ、その結果、オリゴビオチンとストレプトアビジンとの間の相互作用のために発光最大強度に低下を生じる。
好適なビオチン類似体としては、1×10−13Mより大きいKDでビオチン結合性分子と結合する化合物が含まれる。いくつかの実施形態では、ビオチン類似体は、1×10−13M〜1×10−8M、1×10−12M〜1×10−9M、または1×10−11M〜1×10−9M、10−13M〜10−4M、10−12M〜l0−4、10−11M〜10−4M、10−10M〜10−4M、10−9M〜10−4M、10−8M〜10−4M、10−7M〜10−4M、または10−6M〜10−4MのKDでビオチン結合性分子と結合する。本発明における使用のために好適なビオチン類似体としては、限定されるものではないが、HABA(4−ヒドロキシアゾベンゼン−2−カルボン酸)、2−アジドビオチン、2−アジドビオチニルアデニレート、2−プロパルギル(2−プロピニル)ビオチン、strepタグIIペプチド配列(Trp−Ser−His−Pro−Glu−Phe−Glu−Lys)(配列番号1)(Schmidt TGM and Skerra A, Nature Prot. 2007, 2, 1528-1535)、2−イミノビオチン、ビオシチン(−ビオチノイル−L−リシン)、ビオチンエチレンジアミン、ビオチンカダベリン、ビオチン−Xカダベリン、DSB−Xデスチオビオシチン(−デスチオビオチノイル−L−リシン,)およびDSB−Xビオチンエチレンジアミンおよびクロロアセチル化ビオチン誘導体(CABI)またはWO2012058635に記載のビオチン類似体が含まれる。
いくつかの実施形態では、ビオチン結合性分子は、固相支持体に結合される。固相支持体の非限定的な例としては、ポリマー(例えば、アガロース、セファロース、セルロース、ニトロセルロース、アルギネート、テフロン(登録商標)、ラテックス、アクリルアミド、ナイロン、プラスチック、ポリスチレン、シリコーンなど)、ガラス、シリカ、セラミック、および金属が挙げられる。このような固相支持体は、粒子(微粒子を含む)、シート、ディップスティック、ゲル、フィルター、膜、マイクロファイバーストリップ、チューブ、ウェル、プレート(例えば、6ウェルプレート、24ウェルプレート、96ウェルプレート、384ウェルプレートを含むマイクロプレートなど)、繊維、キャピラリー、コーム、ピペットチップ、マイクロアレイチップなどのいずれの形態を採ってもよい。いくつかの実施形態では、ビオチン結合部分は、固相支持体の表面に結合されている。いくつかの実施形態では、固相支持体の表面は、多孔質、粒子状、繊維状、織物状、または焼結された表面などの不規則な表面を含んでなる。
いくつかの実施形態では、固相支持体は、マイクロプレート、マイクロアレイチップ、および微粒子から選択される。いくつかの実施形態では、固相支持体は、少なくとも部分的にポリマーから構成される。いくつかの実施形態では、微粒子固相支持体は、単分散または多分散球状ビーズを含んでなる。単分散微粒子は実質的にサイズが均一である(すなわち、それらの直径の標準偏差は5パーセント未満である)が、多分散微粒子はサイズが多様である。いくつかの実施形態では、微粒子は、全体が同じポリマーで構成されるか、または微粒子のコアが1つのポリマーから構成され、外層(または「シェル」)が別のポリマーから構成されるコア−シェルポリマーである。いくつかの実施形態では、微粒子は磁性である。
いくつかの実施形態では、ビオチン結合部分は、ビオチン結合部分のアミノ基またはスルフヒドリル基を介して固相支持体に結合されている。このようないくつかの実施形態では、固相支持体の表面は、遊離アミン基またはスルフヒドリル基と反応し得る基を含んでなる。このような基の非限定的な例としては、カルボキシ、活性ハロゲン、活性化2−置換エチルスルホニル、活性化2−置換エチルカルボニル、活性エステル、ビニルスルホニル、ビニルカルボニル、アルデヒド、エポキシなどが挙げられる。このような基には、その基を遊離アミン基またはスルフヒドリル基と反応可能とするために付加的な反応物の使用を必要とするものがある。付加的反応物の非限定的な例としては、臭化シアノゲン、カルボニルジイミダゾール、グルタルアルデヒド、ヒドロキシルスクシンイミド、塩化トシルなどが挙げられる。
多くの固相支持体が当技術分野で公知であり、当業者ならば、意図される適用に応じて好適な固相支持体を選択することができる。同様に、その表面にビオチン結合部分が結合された固相支持体が市販されていない場合には、当業者は固相表面にビオチン結合部分を付着させる好適な方法を選択することができる。このような方法の例は、例えば、米国特許出願第US2008/022004 Al号に記載されている。
接触工程(i)は、ビオチン化分子とビオチン結合性分子の結合に十分な条件下で行われる。
「結合に十分な条件」という用語は、ビオチン化分子がビオチン結合性分子に結合することができる、例えば、温度、塩濃度、pHおよびタンパク質濃度などの条件を意味する。厳密な結合条件は、アッセイの性質によって異なる。ビオチン化分子とビオチン結合性分子の結合は100%の結合は必要としないと理解される。いくつかの実施形態では、本質的に100%が結合され、すなわち、少なくとも50%が結合され、少なくとも75%が結合され、少なくとも80%が結合され、少なくとも85%が結合され、または少なくとも95%が結合される。結合のための温度は15℃から37℃まで可変であるが、好ましくは、室温〜約30℃である。結合反応におけるビオチン結合性分子の濃度またはビオチン結合性分子とAQC−CTSを含有する複合体の濃度は特に限定されない。いくつかの実施形態では、濃度は様々であるが、好ましくは、約10pM〜10nMであろう。
本発明による競合アッセイを用いてビオチン化分子の決定のための方法の第2の工程では、工程(i)の接触の結果としてのAQC−CTCによる蛍光発光の強度の変化が決定される。当業者には、強度が、ビオチン化分子の存在下で変化する蛍光発光の唯一のパラメーターであることが理解されるであろう。よって、いくつかの実施形態では、工程(ii)における決定は、発光波長の決定、蛍光の平均寿命の決定または電荷移動複合体の異方性の決定を含まない。
本発明の方法の第2の工程を行うために、接触工程(i)が行われた後に得られたサンプルに検出可能な光学的応答を得るために選択された波長の光を照射し、光学的応答を検出するための手段で観察する。
当業者は、AQC−CTCから蛍光発光を得るために必要とされる励起波長が本方法で使用されるCTCの厳密な性質に依存することを理解するであろう。励起波長は、慣例の技術により、当業者によって決定可能である。例えば、クラスターの励起および発光波長の概算見積りは、Jelliumモデル(例えば、J. Calvo et al., Encyclopedia of Nanotechnology, B. Bhushan, Springer Verlag編, 2011参照)の手段による概算によって決定することができる。このモデルは、どちらかといえば概算の様式で、クラスターの禁制エネルギーバンドギャップ、したがって、その発光バンドギャップの位置を予測する。クラスターの励起バンドギャップは、次に、発光バンドギャップから、特定の大きさのクラスターにおけるストークスシフトがおよそ50〜100nmであることを考慮して予測することができる。下表の表1は、この様式に従うAuまたはAgのAQCに関する理論データを示し、すなわち、およその励起波長λexc.および発光波長λem.は、前記Jelliumモデル:Eem=EF/N1/3(ここで、Eem=発光エネルギー;N=AQCの原子の数;およびEF=金および銀では同じおよそ5.5eVであるFermiレベル)の手段によってAuまたはAgのAQCにおいて±50nmの誤差を用いて算出したものである。
本発明の色素化合物に照射するのに有用な器具としては、限定されるものではないが、ハンドヘルド紫外線灯、水銀アーク灯、キセノン灯、レーザーおよびレーザーダイオードが含まれる。これらの照射光源は場合により、レーザースキャナー、蛍光マイクロプレートリーダー、スタンダードもしくはミニ蛍光計、またはクロマトグラフィー検出器に内蔵される。
サンプルにビオチンまたはビオチン化分子が存在すると、ブランクサンプル、すなわち、ビオチンまたはビオチン化分子を欠いたサンプルの存在下でのCTCの蛍光に比べて、またはサンプルと接触させる前の蛍光に比べて、CTCにより発光される蛍光の強度の低下がもたらされる。
用語「蛍光の低下」は、本明細書で使用する場合、蛍光の強度の低下を意味する。いくつかの実施形態では、サンプル中の蛍光は、ビオチン化生体分子またはビオチンの存在下、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%または少なくとも100%(すなわち、蛍光は、ビオチン化分子の不在下での蛍光に比べて(すなわち、ビオチンまたはビオチン化分子を含有しないサンプルにおける蛍光に比べて)またはサンプルの添加前の蛍光発光に比べて検出不能である)低下する。
光学的応答は、場合により、目視によるか、または以下のデバイス:CCDカメラ、ビデオカメラ、写真フィルム、レーザー操作デバイス、蛍光計、フォトダイオード、量子カウンター、落射蛍光顕微鏡、走査顕微鏡、フローサイトメーター、蛍光マイクロプレートリーダーのいずれかの使用によるか、または光電子増倍管などのシグナルを増幅するための手段によって検出される。サンプルがフローサイトメーターを用いて検査される場合、サンプルの検査は場合により、サンプルの一部をそれらの蛍光応答に従って選別することを含む。
AQC−CTCと生体分子を含んでなるコンジュゲート
上記のCTC−AQCは、一般式HO−(CH2)m−COOHを有するω−ヒドロキシ酸配位子および一般式HS−(CH2)p−COOH)を有するω−メルカプト酸の存在に(by the presence or)よってさらに修飾されてよい。有機配位子のヒドロキシル基およびメルカプト基はAQCの金属原子と相互作用する。有機配位子の両親媒性のために、カルボキシル基は複合体の外部に露出し、したがって、タンパク質、核酸およびその他の生体分子とのコンジュゲーションに利用可能である。これらのコンジュゲートは、蛍光プローブ、バイオマーカーまたは造影剤として特に適している。これらのナノシステムは、in vitroおよびin vivoの両方で生物システムに使用可能である。
上記のCTC−AQCは、一般式HO−(CH2)m−COOHを有するω−ヒドロキシ酸配位子および一般式HS−(CH2)p−COOH)を有するω−メルカプト酸の存在に(by the presence or)よってさらに修飾されてよい。有機配位子のヒドロキシル基およびメルカプト基はAQCの金属原子と相互作用する。有機配位子の両親媒性のために、カルボキシル基は複合体の外部に露出し、したがって、タンパク質、核酸およびその他の生体分子とのコンジュゲーションに利用可能である。これらのコンジュゲートは、蛍光プローブ、バイオマーカーまたは造影剤として特に適している。これらのナノシステムは、in vitroおよびin vivoの両方で生物システムに使用可能である。
別の態様において、本発明は、生体分子と、一般式(I)の少なくとも2つの異なるサイズの金属AQC、MnおよびM’n’の電荷移動複合体:
Mn +M’n’ − (I)
[式中、
金属AQCの金属MおよびM’は、同じまたは異なる金属であり、
Mnは、その酸化形態Mn +で存在するより小さいAQCであり、
M’n’は、その還元形態M’n’ −で存在するより大きいAQCであり、
Mn +とM’n’ −とは静電相互作用により結合され、
nおよびn’はそれぞれ、MおよびM’の金属原子数であり、かつ、
nはn’より小さい]
とを含んでなるコンジュゲートであって、
前記原子量子クラスターMnおよびM’n’に結合されたω−ヒドロキシ酸配位子およびω−メルカプト酸配位子をさらに含んでなり、かつ、前記生体分子がω−ヒドロキシ酸配位子および/またはω−メルカプト酸配位子に結合されているコンジュゲートに関する。
Mn +M’n’ − (I)
[式中、
金属AQCの金属MおよびM’は、同じまたは異なる金属であり、
Mnは、その酸化形態Mn +で存在するより小さいAQCであり、
M’n’は、その還元形態M’n’ −で存在するより大きいAQCであり、
Mn +とM’n’ −とは静電相互作用により結合され、
nおよびn’はそれぞれ、MおよびM’の金属原子数であり、かつ、
nはn’より小さい]
とを含んでなるコンジュゲートであって、
前記原子量子クラスターMnおよびM’n’に結合されたω−ヒドロキシ酸配位子およびω−メルカプト酸配位子をさらに含んでなり、かつ、前記生体分子がω−ヒドロキシ酸配位子および/またはω−メルカプト酸配位子に結合されているコンジュゲートに関する。
いくつかの実施形態では、金属性AQCの金属MおよびM’は遷移金属またはそれらの組合せから選択され、好ましくは、遷移金属はAu、Ag、Co、Cu、Pt、Fe、Cr、Pd、Ni、Rhおよびそれらの組合せからなる群から選択され、より好ましくは、それらはAu、Ag、Cuおよびそれらの組合せからなる群から選択され、より好ましくは、遷移金属はAu、Agおよびそれらの組合せからなる群から選択される。
蛍光の励起波長および発光波長はAQCのサイズに依存するので、必要なサイズのAQCの形成を指定することにより、励起波長および発光波長を選択することができる。
好ましい実施形態では、少なくとも2つのAQCとしてのMnとM’n’との間で1個の電子だけが移動し、したがって、イオン形態Mn +、すなわち、Mnの酸化形態、およびM’n’ −、すなわち、M’n’の還元形態が生じ、ここで、「+」は正電荷であり、「−」は負電荷である。
いくつかの実施形態では、nおよびn’は、2〜309、2〜102、2〜55、または2〜25の金属原子数である。いくつかの実施形態では、nとn’との差は5〜50原子である。
さらなる実施形態では、nとn’との差は5〜50原子、または5〜25原子である。
いくつかの実施形態では、ω−ヒドロキシ酸は一般式HO−(CH2)m−COOHを有し、式中、mは2〜30の値を有する。
いくつかの実施形態では、ω−メルカプト酸は一般式HS−(CH2)p−COOHを有し、式中、pは2〜30の値を有する。
いくつかの実施形態では、mおよびpは10〜20の値を有する。特定の実施形態では、mおよびpは15の値を有する。別の特定の実施形態では、mおよびpは11の値を有する。mおよびpの値は、異なっていても同じであってもよい。mとpが異なる場合、それらの間の差は炭素6個未満であり、好ましくは、mとpとの値の差は1〜4である。好ましい実施形態では、mとpは同じである。少なくとも2つの異なるタイプの有機配位子がω−ヒドロキシ酸(HO−(CH2)m−COOH)配位子およびω−メルカプト酸(HS−(CH2)p−COOH)配位子から選択される場合、酸基−COOH(または対応する酸の塩が使用される場合には−COO−)はナノ化合物の外面に向けられ、−OH基および−SH基は内部、すなわち、それらに結合、付加または配位されているイオン化AQCとしてのMn+およびM’n’−に向けられる。
別の実施形態では、電荷移動複合体に結合され得る「有機配位子」は、ヒドロキシル−OH基、またはメルカプト−SH基以外の官能基、例えば、−NH2、−NH−、−Cl、−PH3、−SR、−OR、−NR2、−NHR、−NR−を有し、ここで、Rは、AQCまたはイオン化AQCとしてのMn +およびM’n’−を結合、付加または配位可能な短い炭化水素鎖C1−C4の有機基を表す。ω−ヒドロキシ酸(HO−(CH2)m−COOH)およびω−メルカプト酸(HS−(CH2)p−COOH)配位子のヒドロキシル−OHまたはメルカプト−SH基をそれらもまたAQCの金属と相互作用する上述のこれらの他の基に交換することも可能である。
本発明によるコンジュゲートに組み込むことができる好適な生体分子としては、AQC−CTCを用いたビオチン化分子の検出のための競合アッセイに関して上述した生体分子のいずれもが含まれる。好ましい実施形態では、生体分子は、核酸、多糖およびポリペプチドからなる群から選択される。好ましくは、生体分子は抗体である。
CTC−AQCで検出可能に標識された結合相手を用いた生体分子の検出方法
生体分子とCTC−AQCを含んでなるコンジュゲートは、生体分子と結合相手との間で形成された複合体内のCTC−AQCの蛍光発光を追跡することにより、生体分子の結合相手を検出するために使用することができる。よって、別の態様において、本発明は、サンプル中の標的分子を検出するための方法であって、
(i)前記サンプルを本発明によるコンジュゲートと接触させる工程、ここで、前記コンジュゲートの生体分子は、前記生体分子が前記標的分子に結合するのに十分な条件下で、前記標的分子に特異的に結合する、および
(ii)前記生体分子と前記標的分子との間の複合体形成を検出する工程
を含んでなる方法に関する。
生体分子とCTC−AQCを含んでなるコンジュゲートは、生体分子と結合相手との間で形成された複合体内のCTC−AQCの蛍光発光を追跡することにより、生体分子の結合相手を検出するために使用することができる。よって、別の態様において、本発明は、サンプル中の標的分子を検出するための方法であって、
(i)前記サンプルを本発明によるコンジュゲートと接触させる工程、ここで、前記コンジュゲートの生体分子は、前記生体分子が前記標的分子に結合するのに十分な条件下で、前記標的分子に特異的に結合する、および
(ii)前記生体分子と前記標的分子との間の複合体形成を検出する工程
を含んでなる方法に関する。
本方法は、第1の工程において、標的分子を含有することが疑われるサンプルに、AQCと前記標的分子の結合相手である生体分子との電荷移動複合体を含んでなるコンジュゲートを接触させることを含んでなり、その接触工程が前記生体分子と、前記生体分子と特異的に結合する部分との結合に十分な条件下で行われる。
いくつかの実施形態では、金属性AQCの金属MおよびM’は遷移金属またはそれらの組合せから選択され、好ましくは、遷移金属はAu、Ag、Co、Cu、Pt、Fe、Cr、Pd、Ni、Rhおよびそれらの組合せからなる群から選択され、より好ましくは、それらはAu、Ag、Cuおよびそれらの組合せからなる群から選択され、より好ましくは、遷移金属はAu、Agおよびそれらの組合せからなる群から選択される。
蛍光の励起波長および発光波長はAQCのサイズに依存するので、必要なサイズのAQCの形成を指定することにより、励起波長および発光波長を選択することができる。
好ましい実施形態では、少なくとも2つのAQCとしてのMnとM’n’との間で1個の電子だけが移動し、したがって、イオン形態Mn +、すなわち、Mnの酸化形態、およびM’n’ −、すなわち、M’n’の還元形態が生じ、ここで、「+」は正電荷であり、「−」は負電荷である。
いくつかの実施形態では、nおよびn’は、2〜309、2〜102、2〜55、または2〜25の金属原子数である。いくつかの実施形態では、nとn’との差は5〜50原子である。
さらなる実施形態では、nとn’との差は5〜50原子、または5〜25原子である。
いくつかの実施形態では、ω−ヒドロキシ酸は一般式HO−(CH2)m−COOHを有し、式中、mは2〜30の値を有する。
いくつかの実施形態では、ω−メルカプト酸は一般式HS−(CH2)p−COOHを有し、式中、pは2〜30の値を有する。
いくつかの実施形態では、mおよびpは10〜20の値を有する。特定の実施形態では、mおよびpは15の値を有する。別の特定の実施形態では、mおよびpは11の値を有する。mおよびpの値は、異なっていても同じであってもよい。mとpが異なる場合、それらの間の差は炭素6個未満であり、好ましくは、mとpとの値の差は1〜4である。好ましい実施形態では、mとpは同じである。少なくとも2つの異なるタイプの有機配位子がω−ヒドロキシ酸(HO−(CH2)m−COOH)配位子およびω−メルカプト酸(HS−(CH2)p−COOH)配位子から選択される場合、酸基−COOH(または対応する酸の塩が使用される場合には−COO−)はナノ化合物の外面に向けられ、−OH基および−SH基は内部、すなわち、それらに結合、付加または配位されているイオン化AQCとしてのMn+およびM’n’−に向けられる。
別の実施形態では、電荷移動複合体に結合され得る「有機配位子」は、ヒドロキシル−OH基、またはメルカプト−SH基以外の官能基、例えば、−NH2、−NH−、−Cl、−PH3、−SR、−OR、−NR2、−NHR、−NR−を有し、ここで、Rは、AQCまたはイオン化AQCとしてのMn +およびM’n’−を結合、付加または配位可能な短い炭化水素鎖C1−C4の有機基を表す。ω−ヒドロキシ酸(HO−(CH2)m−COOH)およびω−メルカプト酸(HS−(CH2)p−COOH)配位子のヒドロキシル−OHまたはメルカプト−SH基をそれらもまたAQCの金属と相互作用する上述のこれらの他の基に交換することも可能である。
生体分子と標的分子の好適なペアは表2に示される通りである。
検出される標的分子が左の欄に記載されている分子のいずれかである場合、CTC−AQCで検出可能に標識される生体分子は右の欄に定義されると考えられる。逆に、検出される標的分子が右の欄に記載される分子のいずれかである場合、AQCの電荷移動複合体で検出可能に標識される生体分子は左の欄に定義される。
いくつかの実施形態では、生体分子は、標的分子に共有結合する。いくつかの実施形態では、生体分子は標的分子に非共有結合的に結合する。
いくつかの実施形態では、検出される標的分子は抗原またはハプテンであり、この場合、AQCの電荷移動複合体で検出可能に標識される生体分子は、前記抗原と特異的に結合する抗体である。他の実施形態では、検出される標的分子は抗体であり、この場合、AQCの電荷移動複合体で検出可能に標識される生体分子は、前記抗体により認識される抗原である。
いくつかの実施形態では、検出される標的分子は核酸であり、この場合、AQCの電荷移動複合体で検出可能に標識される生体分子は、前記核酸と特異的にハイブリダイズする核酸である。用語「特異的にハイブリダイズする」は、本明細書で使用する場合、高ストリンジェント条件または中等度ストリンジェント条件下で2つのポリヌクレオチドのハイブリダイズを可能とする状態を意味する。ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者により容易に決定可能であり、一般にプローブ長、洗浄温度、および塩濃度に依存した経験的計算である。一般に、長いプローブほど適切なアニーリングに高温を要し、短いプローブほど低温を要する。ハイブリダイゼーションは一般に、相補鎖がそれらの融解温度より低い環境中に存在する場合に変性DNAが再アニーリングする能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間に望まれる相同性の程度が高いほど、使用可能な相対温度は高くなる。結果として、相対温度が高いほど反応条件がよりストリンジェントとなる傾向にあり、温度が低いほどストリンジェントが低いことになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細および解説に関しては、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)参照。
生体分子の、サンプル中の結合相手との結合を促進するのに好適な条件は、当業者により、本明細書の教示および以下に示す実施例に基づいて決定することができる。例えば、抗体抗原結合は多くの場合、疎水性の相互作用(いわゆる疎水結合)に依存し、したがって、非特異的結合を低減し、特異的抗原抗体結合を増強するために、モル範囲の高塩濃度を使用することができる。
生体適用では、サンプルと標的生体分子に対する結合相手との接触工程は、一般に当技術分野で公知の方法に従って調製される水溶液、ほぼ水性の溶液または水性混和溶液中で行われる。検出可能に標識された結合相手の厳密な濃度は試験条件および所望の結果に依存するが、一般に約1ナノモル〜1ミリモルまたはそれを超える範囲である。最適濃度は、最小のバックグラウンド蛍光で満足のいく結果が達成されるまでの系統的変動により決定される。
第2の工程では、本発明によるコンジュゲートを用いた標的分子の検出方法は、AQCの電荷移動複合体で検出可能に標識された生体分子と標的分子との間の複合体形成を検出することを含む。
複合体形成の検出は、好適な波長での励起時にAQCの電荷移動複合体により発光された蛍光を検出することによって行うことができる。
一般に、複合体の検出は、サンプル中になお存在する結合していない、検出可能に標識された生体分子から複合体を分離した後に行われる。サンプル中になお存在する結合していない、検出可能に標識された生体分子から複合体を分離するためには、様々な方法が当業者に利用可能である。
いくつかの実施形態では、標的分子は支持体に固定化され、これにより、サンプルから支持体を分離することにより検出可能に標識された生体分子とともに形成された複合体の回収が可能となる。結合相手の固定化に使用できる好適な支持体は、限定されるものではないが、本発明による競合アッセイに関して上記で定義されたいずれのものも含まれる。
いくつかの実施形態では、結合していない、検出可能に標識された結合相手からの複合体の分離は、CTC−AQCで検出可能に標識された生体分子とは異なる、標的分子に対する第2の結合相手を用いて行われる。これにより、検出可能に標識された生体分子と標的分子と第2の結合相手を含んでなる三元複合体の回収が可能となる。例えば、検出される標的分子がポリペプチドであって、検出可能に標識された生体分子が抗体である場合、前記ポリペプチドと前記検出可能に標識された生体分子との間の複合体は、標的分子に特異的であり、かつ、第2の抗体と標的分子の結合が立体障害により妨げられることがないように、標的分子の異なる領域を認識する第2の抗体を用いて分離することができる。いくつかの実施形態では、標的分子は、タグを含有する。本発明において使用可能な好適なタグとしては、限定されるものではないが、ペプチドに基づくタグが含まれる。このタグは一般にポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端に配置される。様々なタグポリペプチドおよびそれらの対応する抗体が当技術分野で周知である。例としては、ポリ−ヒスチジン(poly−his)またはポリ−ヒスチジン−グリシン(poly−his−gly)タグ;flu HAタグポリペプチドおよびその抗体12CA5(Field et al., Mol Cell Biol, 1988;8:2159-2165);c−mycタグならびにそれに対する8F9、3C7、6E10、G4、B7および9E10抗体(Evan et al., Molecular and Cellular Biology 1985;5:3610-3616);単純ヘルペスウイルス糖タンパク質D(gD)タグおよびその抗体(Paborsky et al., Protein Engineering 1990;3:547-553)が挙げられる。他のタグポリペプチドとしては、Flag−ペプチド(Hopp et al., BioTechnology 1988;6:1204-1210);KT3エピトープペプチド[Martin et al., Science 1993;255:192-194);チューブリンエピトープペプチド(Skinner et al., J Biol Chem 1991;266:15163-15166);およびT7遺伝子10タンパク質ペプチドタグ(Lutz-Freyermuth et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990,;87:6393-6397)が含まれる。好ましい実施形態では、精製タグは、ポリヒスチジンタグである。なおさらに好ましい実施形態では、精製タグはヘキサヒスチジンタグである。
いくつかの実施形態では、複合体が結合されていない、検出可能に標識された生体分子から分離された後に、余分な標識生体分子を除去するためにする複合体を少なくとも1回洗浄する。洗浄工程は、生体分子および結合相手に依存するいずれの適当な方法で行ってもよい。サンプルは任意の好適な媒体、例えばPBSなどのバッファーで洗浄してよい。媒体はTween20などの潜在を含有してもよい。サンプルは任意の各洗浄につき好適な時間、例えば、1〜30分、または3〜10分間洗浄してよい。洗浄は前記細胞の担体の穏やかな振盪または揺動を含み得る。洗浄温度は、細胞が生存可能であり、かつ、結合が破壊されないような温度である。例えば、それは20〜45℃または30〜40℃である。一般に、それは約37℃または室温である。生体分子と結合相手の複合体の洗浄に好適なプロトコールは、当技術分野で周知である。
検出可能に標識された生体分子と標的分子との間の複合体の検出は、標的分子と会合したAQC−CTCの蛍光発光を検出することを含む。蛍光発光が検出されれば、これは工程(ii)において、検出可能な量の生体分子が標的分子とともに回収されたこと、したがって、そのサンプルが標的分子を含有していたことを意味する。
いくつかの実施形態では、標的分子の検出はウエスタンブロットにより行うことができ、この場合、標的分子をゲル電気泳動により分離し、ブロッティングメンブレンに転写し、検出可能に標識された生体分子と接触させる。あるいは、いくつかの実施形態では、標的分子を生体分子(biomoelcule)と接触させた後、その生体分子と標的分子の相互作用が保存される条件下で分離する。次に、前記複合体は、その複合体の分離に使用される支持体内の蛍光を測定することによって検出することができる。分離は、電気泳動またはクロマトグラフィーなどのいずれの好適な手段によって行ってもよい。いくつかの実施形態では、複合体の分離はゲル電気泳動により行われ、この場合、検出はゲル内蛍光検出により行われる。
AQCの電荷移動複合体を励起するための好適な手段および条件、ならびにAQCの電荷移動複合体の蛍光発光を検出するための手段および条件は、本発明による競合的方法に関して記載されており、本発明の方法に等しく適用可能である。
生体分子とAQCの電荷移動複合体とを含んでなるコンジュゲートの作製方法
別の態様において、本発明は、生体分子とAQC電荷移動複合体とを含んでなるコンジュゲートの作製方法に関する。AQCの電荷移動複合体はω−ヒドロキシ酸配位子およびω−メルカプト酸配位子により安定化され、ここで、AQCは有機配位子のω−ヒドロキシ基およびω−メルカプト基に結合され、カルボキシ基は露出したままとなり、その後これが対象分子とカップリングするために利用できる。
別の態様において、本発明は、生体分子とAQC電荷移動複合体とを含んでなるコンジュゲートの作製方法に関する。AQCの電荷移動複合体はω−ヒドロキシ酸配位子およびω−メルカプト酸配位子により安定化され、ここで、AQCは有機配位子のω−ヒドロキシ基およびω−メルカプト基に結合され、カルボキシ基は露出したままとなり、その後これが対象分子とカップリングするために利用できる。
よって、別の態様において、本発明は、本発明による電荷移動複合体と生体分子のコンジュゲートの作成方法に関し、前記方法は、その表面において第1の反応性基で官能基化されたAQCの電荷移動複合体を、第1の反応性基と反応し得る第2の反応性基を含有する生体分子と反応させることを含んでなる。
AQCの電荷移動複合体は、AQCの外部に露出しているカルボキシル基を含有する有機酸を含有する。よって、いくつかの実施形態では、生体分子内の対応する反応性基と反応し得る反応性基を導入するために、カルボキシル基を直接活性化することが可能である。AQCの電荷移動複合体の有機酸に組み込むことができる代表的な反応性基としては、限定されるものではないが、カルボン酸基、カルボン酸活性エステル(例えば、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル)、マレイミド基、反応性カルバミン酸基およびチオカルバミン酸基、およびα−ハロアセトアミド基(−NH−C(−O)−CH2−X)が含まれる。他の好適な官能基としては、環状付加物(例えば、4+2環状付加生成物、ならびにアセチレンおよびアジドを提供するためのジエンおよびジエノフィル(クリックケミストリー))とカップリングさせることができる基が含まれる。一実施形態では、反応性基は、カルボン酸基(−CO2H)またはその活性エステル(例えば、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル)である。
カルボン酸基およびカルボン酸活性エステルは、タンパク質およびペプチド内のリシン残基のアミノ基、ならびにオリゴヌクレオチドプローブ(−C(−O)−NH−結合)に導入された第一級アミノ基を含むアミノ基に対して反応性がある。マレイミド基は、タンパク質、ペプチド、およびオリゴヌクレオチド(−N[C(−O)CH2CHC(−O)]−S−結合)に対して天然の、またはそれに導入されたスルフヒドリル基に対して反応性である。反応性カルバミン酸基およびチオカルバミン酸基はアミノ基に対して反応性であって、尿素(−NH−C(−O)−NH−)およびチオ尿素(−NH−C(−S)−NH−)結合を与える。α−ハロアセトアミド基はチオール基に対して反応性であって、−NH−C(−O)−CH2−S−結合を与える。環状付加を介してコンジュゲーションし得る官能基としては、4+2環状付加結合を形成する反応をするジエン(例えば、フラン)およびジエノフィル(例えば、アルケンおよびアルキン)が含まれる。リンカーアームは、相補的反応性材料(例えば、生体分子)に天然の、または組み込まれている、それぞれジエノフィルおよびジエンに対するジエンまたはジエノフィル反応性のいずれかを含むように修飾することができる。クリックケミストリーもまた、コンジュゲーションに使用可能である。リンカーアームは、相補的反応性材料(例えば、生体分子)に天然の、または組み込まれている、それぞれアジドまたはアセチレンに対する好適なアセチレン(例えば、H−C=C−R)またはアジド(例えば、R’−N−N+−N−)反応性を含むように修飾することができる。
いくつかの実施形態では、コンジュゲーションは、有機酸中に天然に存在するカルボン酸基またはその活性エステルを、生体分子中に見られるアミノ基と反応させることにより行われる。活性化エステルの例としては、限定されるものではないが、N−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、N−ヒドロキシスルホスクシンイミジルエステル、p−スルホ−テトラフルオロフェノールエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、p−ニトロフェニルエステル、2,4−ジニトロフェニルエステル、4−ニトロフェニルエステル、3−ヒドロキシ−3,4−ジヒドロ−4−オキソ−1,2,3−ベンゾトリアジン(HODhbt)、限定されるものではないが、ジイソプロピルカルボジイミド(DIPCDI)、N,N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、1−エチル−3−(3’−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドヒドロクロリド(EDC)などの通常のカルボジイミドを用いて活性化されたカルボン酸;および限定されるものではないが、0−ベンゾトリアゾール−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU)、O−(ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(TBTU)、2−(6−クロロ−1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート(HCTU)、(2−(6−クロロ−1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルアミニウムテトラフルオロボレート)(TCTU)、2−(1H−7−アザベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HATU)、1−ベンゾアリウアゾリオキシトリス−(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(BOP)ベンゾトリアゾール−1−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(PYBOP)などのウロニウム塩またはホスホニウム塩で活性化された;カルボン酸またはそれらの組合せが挙げられる。好ましい実施形態では、カルボン酸は、カルボジイミド、好ましくはEDCを用いて活性化される。
生体分子がポリペプチドである場合、反応性アミノ基はリシン残基中に天然に見られ、それにより、それ以上修飾しなくても生体分子のコンジュゲーションを可能とする。生体分子がポリヌクレオチドである場合、一実施形態では、生体分子は、アミノ基の組み込みにより修飾することができる。これは通常、アミノ修飾オリゴヌクレオチドを用いたポリヌクレオチドの合成の際に行われる。選択されたポリヌクレオチドにアミノ基を導入するための方法は、すなわち、WO2011131693、Kojima N. and Komatsu Y., (Curr. Protoc. Nucleic Acid Chem. 2012 Mar; Chapter 4:Unit 4.48.1-23. doi: 10.1002/0471142700.nc0448s48)およびVasilyeva SV et al. (Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2011; 30: 753-67)に記載されている。生体分子がオリゴ糖または多糖である場合、アミノ基は、例えば、US5306492およびPorro et al., (Mol. Immunol., 1985, 22:907-919)に記載されているように還元的アミノ化により挿入することができる。
AQCの電荷移動複合体中の反応性基は、AQC中の反応性基と生体分子中の反応性基との間の反応が立体障害によって妨げられることを避けるために、有機酸中のカルボキシ基に直接カップリングさせることができか、あるいは、スペーサー基またはリンカー基によってこの基に連結することができる。同様に、反応性基とコンジュゲートされる生体分子はまた、その反応を妨げるために生体分子の骨格の間にスペーサー基を含む。いくつかの実施形態では、生体分子に結合された反応性基と有機酸を介してAQCに結合された対応する反応性基の両方がリンカー基を含む。好適なリンカー部分は、炭素、窒素、酸素、水素およびハロゲンから選択される1〜約50個の原子を含む。代表的に基としては、アルキレン基(例えば、−(CH1)n−、ここで、nは1〜12である)、フェニレン基(例えば、o−、m−、およびp−C6H4−)、ならびにアルキレンオキシド基(例えば、エチレンオキシド、−(CH2CH2O)m−、ここで、mは1〜5でした)。他の好適な基としては、−C(=A1)−L1−、−C(=A1)NH−L1−、−C(=A1)NH−L1−NH−、ここで、A1はOおよびSから選択され、L1は上記のリンカー基のいずれかである)が含まれる。
AQCの活性化電荷移動複合体は、保護基を用いた保護形態として提供することができる。保護基の例は、T. W. Greene and P. G. Wuts, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC CHEMISTRY, (Wiley, 第2版 1991), Beaucage and Iyer, Tetrahedron 48:2223-2311 (1992)、およびHarrison and Harrison et al., COMPENDIUM OF SYNTHETIC ORGANIC METHODS, Vols. 1-8 (John Wiley and Sons. 1971-1996)に見出せる。代表的なアミノ保護基には、ホルミル、アセチル、トリフルオロアセチル、ベンジル、ベンジルオキシカルボニル(CBZ)、tert−ブトキシカルボニル(Boc)、トリメチルシリル(TMS)、2−トリメチルシリル−エタンスルホニル(SES)、トリチルおよび置換トリチル基、アリルオキシカルボニル、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル(FMOC)、ニトロ−ベラトリルオキシカルボニル(NVOC)などが含まれる(また、Boyle, A. L. (Editor), CURRENT PROTOCOLS IN NUCLEIC ACID CHEMISTRY, John Wiley and Sons, New York, Volume 1, 2000も参照)。代表的なヒドロキシ保護基としては、ヒドロキシ基がアシル化またはアルキル化されているもの、例えば、ベンジルおよびトリチルエーテル、ならびにアルキルエーテル、テトラヒドロピラニルエーテル、トリアルキルシリルエーテルおよびアリルエーテルが含まれる。さらに、ヒドロキシ基は、a−メチル−6−ニトロピペロンイルオキシカルボニルなどの光除去基のより保護することもできる(McGall, G. H. and Fidanza, J. A., Photolithographic synthesis of high-density olignucleotide arrays, DNA ARRAYS METHODS AND PROTOCOLS, Rampal J. B.編, METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 170:71-101 (2001), Humana Press, Inc., NY; Boyle, Ann L. (編), Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, John Wiley and Sons, New York, Volume 1, 2000)。
細胞内成分を標識するための方法
別の実施形態では、本発明は、1以上の細胞内成分をAQC−CTCと前記細胞内成分と特異的に結合する生体分子とを含んでなるコンジュゲートに接触させ、それにより、顕微鏡による1以上の細胞内成分の検出を可能等することを含んでなる、細胞内成分をin vivo標識するための方法に関する。
別の実施形態では、本発明は、1以上の細胞内成分をAQC−CTCと前記細胞内成分と特異的に結合する生体分子とを含んでなるコンジュゲートに接触させ、それにより、顕微鏡による1以上の細胞内成分の検出を可能等することを含んでなる、細胞内成分をin vivo標識するための方法に関する。
一実施形態では、生体分子は、1以上の細胞内コンパートメントで発現されるポリペプチドと特異的に結合するポリペプチドであり、この場合、本発明によるAQC−CTCを含んでなるコンジュゲートは免疫組織化学に使用可能である。
別の実施形態では、生体分子は、対象とする核酸配列と特異的にハイブリダイズする(hibrdises)核酸であり、この場合、本発明によるAQC−CTCを含んでなるコンジュゲートは、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)に使用可能である。一般に、FISH法は、下記の工程:(a)検討下の組織または他の生体材料を支持体(例えば、スライドガラスまたはマイクロタイターウェルの壁面に固定化する工程、(b)FISHプローブの標的核酸への接近性を高めるために組織または材料を処理する工程、(c)標的核酸を含有する組織または材料をプローブと接触させて特異的なハイブリダイゼーション複合体を形成する工程、(d)複合体のハイブリダイゼーション後洗浄により、標的に特異的にハイブリダイズされていないプローブを選択的に除去する工程、および(e)標的核酸分子とハイブリダイゼーション複合体を形成したプローブの検出を含む。このような方法は、Gall and Pardue, (1981) Methods of Enzymology 21:470-480; Henderson, (1982) International Review of Cytology, 76: 1-46;およびAngerer, et al., (1985) in Genetic Engineering: Principles and Methods (Setlow and Hollaender, 編) vol. 7, pp. 43-65, Plenum Press, New Yorkを含む多くの文献に記載されている。
いくつかの実施形態では、生体分子は、ポリペプチドおよび核酸からなる群から選択される。さらにより好ましい実施形態では、ポリペプチドは抗体である。
コンジュゲートは、色素化合物と対象サンプル成分との間の接触を促進するようにサンプルと接触させる。一般に、コンジュゲートまたはコンジュゲートを含有する溶液を単にサンプルに加える。本発明の特定の結合相手は、生体細胞の膜を透過しない傾向があり、ひと度、生存細胞内にあれば、一般によく保持される。原形質膜に透過性とする処理、例えば、エレクトロポレーション、ショック処理または高い細胞外ATPは、結合相手を細胞に導入するために使用可能である。あるいは、結合相手は、例えば、加圧マイクロインジェクション、スクレープローディング(scrape loading)、パッチクランプ法、または食作用により、物理的に細胞に挿入することができる。
被験体由来のいずれの組織サンプルを使用してもよい。使用可能な組織サンプルの例としては、限定されるものではないが、乳房、前立腺、卵巣、結腸、肺、子宮内膜、胃、唾液腺または膵臓が含まれる。組織サンプルは、限定されるものではないが、外科的切除、吸引または生検を含む様々な手順によって得ることができる。組織は新鮮物であっても、または冷凍されていてもよい。一実施形態では、組織サンプルは固定されるか、またはパラフィンに包埋される。組織サンプルは従来の方法論[例えば、"Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology," 第3版 (1960) Lee G. Luna, HT (ASCP) Editor, The Blakston Division McGraw-Hill Book Company, New York; The Armed Forces Institute of Pathology Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology (1994) Ulreka V. Mikel編, Armed Forces Institute of Pathology, American Registry of Pathology, Washington, D.C.参照]により固定(保存)してよい。例としては、中性緩衝ホルマリン、ブアン液(Bouin’s)またはパラホルムアルデヒドを、組織サンプルの固定に使用してよい。
細胞成分と会合したCTC−AQCの検出は、下記のデバイスCCDカメラ、ビデオカメラ、写真フィルム、レーザースキャニングデバイス、蛍光計、フォトダイオード、量子カウンター、落射蛍光顕微鏡、走査顕微鏡、フローサイトメーター、蛍光マイクロプレートリーダーのいずれかを使用するか、または光電子増倍管などのシグナルを増幅するための手段によって行うことができる。サンプルがフローサイトメーターを用いて検査される場合、サンプルの検査は場合により、サンプルの一部をそれらの蛍光応答に従って選別することを含む。
本発明を下記の実施例により説明するが、これらの実施例は、本発明の範囲の単に例示であって、限定ではないと解釈されるべきである。
試薬
ストレプトアビジン(ストレプトミセス・アビディニイ由来、アフィニティー精製、≧13U/mg)およびオリゴ−ビオチン(36bpオリゴヌクレオチド−ビオチン、
は、Sigma−aldrichから購入し、それ以上精製せずに用い、文献および製造者により推奨されているような保存溶液:水中、ストレプトアビジン0.5mg/mLおよびTEバッファー(トリス−EDTAバッファー溶液、pH=8.0、Fluka)中、オリゴ−ビオチン1nMを作製した。
ストレプトアビジン(ストレプトミセス・アビディニイ由来、アフィニティー精製、≧13U/mg)およびオリゴ−ビオチン(36bpオリゴヌクレオチド−ビオチン、
AQC−CTCは標準的プロトコールにより合成した。5.4mLの水と必要量の水酸化テトラブチルアンモニウム(水中40%、Fluka)中、激しく撹拌しながら、16−ヒドロキシパルミチン酸(98%、Aldrich)(2mL、10mg/mL)の水溶液を16−メルカプトパルミチン酸(90%、Aldrich)の水溶液(0.622mL、10mg/mL)と、基準中央値が得られるまで混合した。得られたナノソーム溶液に、容量400μLのHAuCl4・3H2O(塩化Au(III)水和物、金属塩基99.999%、Aldrich)(5.8mg/mL)溶液を加え、その後、400μLのNaBH4(96%、Aldrich)溶液(0.05M)により還元した。この溶液を35℃で1時間撹拌した。AQC−CTCを得るために、この溶液をBeckman Airfuge(登録商標)Air−Driven超遠心機にて90,000rpmで1時間、超遠心分離にかけ、分離上清としてAQC−CTCを得た。この超遠心分離工程は、従前に合成されたナノソームを崩壊させる不安定化工程である。前記工程は、様々な大きさのAQCからAQC−CTCを得るために必要である。
実施例1 AQC−CTCのストレプトアビジン蛍光増強によるビオチン化オリゴヌクレオチドの検出
表1に示すように、15μLのAQC−CTC(150mg/L)、55μLのストレプトアビジン溶液(水中0.5mg/mL)および漸増量のオリゴ−ビオチン溶液(TEバッファー中1nM)を含有する3種類の異なる溶液を作製した。1時間のインキュベーション後、各サンプルの蛍光を測定した。
表1に示すように、15μLのAQC−CTC(150mg/L)、55μLのストレプトアビジン溶液(水中0.5mg/mL)および漸増量のオリゴ−ビオチン溶液(TEバッファー中1nM)を含有する3種類の異なる溶液を作製した。1時間のインキュベーション後、各サンプルの蛍光を測定した。
図1は、種々の溶液:(A)ストレプトアビジンを含むAQC−CTC、(B)ストレプトアビジンと0.1mmolのオリゴ−ビオチンを含むAQC−CTC、および(C)ストレプトアビジンと0.5mmolのオリゴ−ビオチンを含むAQC−CTCの250nmの励起における発光スペクトルを示す(Cary Eclipse Varian蛍光分光光度計を用い、光路3×3mmおよび用量45μLの石英セル中で測定)。このスペクトルは、600nmに発光極大を示し、これはオリゴ−ビオチンを添加すると低下し、この発光極大はオリゴ−ビオチンの量を増すにつれ低下する。
実施例2 AQC−CTCのストレプトアビジン/HABA蛍光増強/消光によるビオチン化オリゴヌクレオチド検出
表2に示すように、示された容量のストレプトアビジン溶液(0.5mg/mL)に0.25μLのHABA溶液(10mM)および0.5μLのAQC−CTC溶液(およそ150mg/L)を加えて2種類の溶液を作製した。次に、この溶液Bに0.5μLのオリゴ−ビオチン溶液(1nM)を加え、両サンプルを30分間インキュベートした。
表2に示すように、示された容量のストレプトアビジン溶液(0.5mg/mL)に0.25μLのHABA溶液(10mM)および0.5μLのAQC−CTC溶液(およそ150mg/L)を加えて2種類の溶液を作製した。次に、この溶液Bに0.5μLのオリゴ−ビオチン溶液(1nM)を加え、両サンプルを30分間インキュベートした。
図2は、異なる溶液(A)HABAとストレプトアビジンを含むAQC−CTC、および(B)HABA、ストレプトアビジンと0.5μLのオリゴ−ビオチンを含むAQC−CTCの250nmの励起における発光スペクトルを示す(Cary Eclipse Varian蛍光分光光度計を用い、光路3×3mmおよび用量45μLの石英セル中で測定)。図2に示すように、オリゴ−ビオチンの添加は、オリゴ−ビオチンとストレプトアビジンとの間の相互作用のために発光極大強度の低下をもたらす。
実施例3 タンパク質分子とナノソームのカップリングのための方法
新たに作製したN−(3−ジメチルアミノプロピル)−N’−エチルカルボジイミドヒドロクロリド(EDC)の水溶液を、pH9ホウ酸バッファー中のナノソーム溶液に加えた。5分間中速で撹拌した後、pH9ホウ酸バッファー中、このタンパク質溶液を加えた。撹拌を2時間続け、最終的なタンパク質−ナノソームコンジュゲートを、遠心分離限外濾過により精製した。
新たに作製したN−(3−ジメチルアミノプロピル)−N’−エチルカルボジイミドヒドロクロリド(EDC)の水溶液を、pH9ホウ酸バッファー中のナノソーム溶液に加えた。5分間中速で撹拌した後、pH9ホウ酸バッファー中、このタンパク質溶液を加えた。撹拌を2時間続け、最終的なタンパク質−ナノソームコンジュゲートを、遠心分離限外濾過により精製した。
Claims (34)
- ビオチン結合性分子と、一般式(I)の少なくとも2つの異なるサイズの金属原子量子クラスター(AQC)としてのMnおよびM’n’の電荷移動複合体(CTC):
Mn +M’n´ − (I)
[式中、
金属AQCの金属MおよびM’は、同じまたは異なる金属であり、
Mnは、その酸化形態Mn +で存在するより小さいAQCであり、
M’n’は、その還元形態M’n’ −で存在するより大きいAQCであり、
Mn +とM’n’ −とは静電相互作用により結合され、
nおよびn’はそれぞれ、MおよびM’の金属原子数であり、かつ、
nはn’より小さい]
とを含有する複合体であって、前記ビオチン結合性分子と前記電荷移動複合体とが共有結合されていない、複合体。 - 前記ビオチン結合性分子がストレプトアビジンまたは機能的に等価なその変異体である、請求項1に記載の複合体。
- 前記金属MおよびM’が遷移金属またはそれらの組合せから独立に選択される、請求項1または2に記載の複合体。
- 金属MおよびM’が遷移金属Au、Ag、Cuおよびそれらの組合せ、より好ましくは、Au、Agおよびそれらの組合せから独立に選択される、請求項3に記載の複合体。
- nおよびn’が2〜309、2〜102、2〜55、または2〜25の金属原子数である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の複合体。
- nとn’との差が5〜50原子である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の複合体。
- 前記電荷移動複合体が、原子量子クラスターMnおよびM’n’に結合されたω−ヒドロキシ酸配位子およびω−メルカプト酸配位子をさらに含んでなる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の複合体。
- 前記ω−ヒドロキシ酸が、mが2〜30の値を有する一般式(HO−(CH2)m−COOH)を有し、かつ/または、前記ω−メルカプト酸が、pが2〜30の値を有する一般式HS−(CH2)p−COOH配位子を有する、請求項7に記載の複合体。
- (i)少なくとも2つの異なるサイズの金属原子量子クラスター(AQC)としてのMnおよびM’n’の電荷移動複合体であって、請求項1に定義される式Iを有し、かつ、前記金属AQCのMおよびM’は同じまたは異なる金属であり、Mnはその酸化形態Mn +で存在するより小さいAQCであり、M’n’はその還元形態M’n’ −で存在するより大きいAQCであり、Mn +とM’n’ −とは静電相互作用により結合され、nおよびn’はそれぞれ金属原子数である、電荷移動複合体と、
(ii)ビオチン結合性分子と
を一緒にまたは別個に含有するパーツキット。 - サンプル中のビオチン化分子の検出のための方法であって、
(i)前記サンプルと請求項1〜4のいずれか一項に記載の複合体とを、前記ビオチン化分子が前記複合体中のビオチン結合性分子に結合するのに十分な条件下で接触させる工程、および
(ii)工程(i)の接触後に、AQCの励起波長での前記サンプルの励起に応答したAQCによる蛍光発光の強度の変化を検出する工程
を含んでなり、接触工程後のAQCにより発せられる蛍光強度の低下が、前記サンプル中にビオチン化分子が存在することを示す、方法。 - 前記ビオチン化分子が核酸、ポリペプチドまたは多糖である、請求項10に記載の方法。
- 前記ビオチン結合性分子が、ビオチンのそれよりも低いビオチン結合性分子に対する親和性を示すビオチン類似体との複合体として提供される、請求項10または11に記載の方法。
- 前記ビオチン類似体が4−ヒドロキシアゾベンゼン−2−カルボン酸(HABA)である、請求項12に記載の方法。
- 生体分子と、一般式(I)の少なくとも2つの異なるサイズの金属AQCとしてのMnおよびM’n’の電荷移動複合体:
Mn +M’n’ − (I)
[式中、
金属AQCの金属MおよびM’は、同じまたは異なる金属であり、
Mnは、その酸化形態Mn +で存在するより小さいAQCであり、
M’n’は、その還元形態M’n’ −で存在するより大きいAQCであり、
Mn +とM’n’ −とは静電相互作用により結合され、
nおよびn’はそれぞれ、MおよびM’の金属原子数であり、かつ、
nはn’より小さい]
とを含んでなるコンジュゲートであって、
前記原子量子クラスターMnおよびM’n’に結合されたω−ヒドロキシ酸配位子およびω−メルカプト酸配位子をさらに含んでなり、かつ、前記生体分子がω−ヒドロキシ酸配位子および/またはω−メルカプト酸配位子に共有結合されている、コンジュゲート。 - 前記生体分子が核酸、多糖およびポリペプチドからなる群から選択される、請求項14に記載のコンジュゲート。
- 前記ポリペプチド生体分子が抗体である、請求項15に記載のコンジュゲート。
- 前記金属MおよびM’が遷移金属またはそれらの組合せから独立に選択される、請求項14〜16のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
- 前記遷移金属がAu、AgおよびCuからなる群から選択される、請求項17に記載のコンジュゲート。
- nおよびn’が2〜309、2〜102、2〜55、または2〜25の金属原子数である、請求項14〜18のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
- nとn’との差が5〜50原子である、請求項14〜19のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
- ω−ヒドロキシ酸が、mが2〜30の値を有する一般式(HO−(CH2)m−COOH)を有し、かつ/または、ω−メルカプト酸が、pが2〜30の値を有する一般式HS−(CH2)p−COOH配位子を有する、請求項14〜20のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
- その表面において第1の反応性基で官能基化されているAQCの電荷移動複合体を、前記第1の反応性基と反応し得る基を含有する生体分子と反応させることを含んでなる、請求項14〜21のいずれか一項に記載のコンジュゲートの製造方法。
- 前記生体分子内の基が、前記反応工程の前に生体分子対の予備官能基化により導入されている、請求項22に記載の方法。
- 前記第1の反応性基が活性化カルボキシル基である、請求項22または23のいずれか一項に記載の方法。
- 第1の反応性基と反応し得る生体分子中の基が活性化ヒドロキシル基または活性化アミノ基である、請求項22〜24のいずれか一項に記載の方法。
- サンプル中の標的分子を検出するための方法であって、
(i)前記サンプルを請求項14〜21のいずれか一項に記載のコンジュゲートと接触させる工程、ここで、前記コンジュゲートの生体分子は、前記生体分子が前記標的分子に結合するのに十分な条件下で、前記標的分子に特異的に結合する、および
(ii)前記生体分子と前記標的分子との間の複合体形成を検出する工程
を含んでなる、方法。 - 前記標的分子が第1のポリペプチドであれば、前記コンジュゲートの一部を形成する生体分子は第2のポリペプチドおよびアプタマーからなる群から選択される、請求項27に記載の方法。
- 前記第2のポリペプチドが抗体である、請求項28に記載の方法。
- 前記標的分子が第1の核酸であれば、前記コンジュゲートの一部を形成する生体分子は、第1の核酸と特異的にハイブリダイズする第2の核酸である、請求項27に記載の方法。
- 前記標的分子が多糖であれば、前記コンジュゲートの一部を形成する生体分子はレクチンであり、または前記標的分子がレクチンであれば、結合相手は多糖である、請求項19に記載の方法。
- 前記標的分子が細胞、細菌、ウイルス、もしくは酵母細胞内に存在するか、またはポリマー、ポリマー膜もしくはポリマー粒子に固定化されている、請求項26〜31のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞内成分を検出するための方法であって、1以上の細胞内成分を請求項14〜21のいずれか一項に記載のAQC−CTCを含んでなるコンジュゲートと接触させることを含んでなり、生体分子が、前記細胞内成分と特異的に結合し、それにより顕微鏡による1以上の細胞内成分の検出を可能とする結合相手である、方法。
- 前記結合相手がポリペプチドおよび核酸からなる群から選択される、請求項32に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが抗体である、請求項33に記載の方法。
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