WO2023136230A1 - 生体物質間の接触を検出する方法 - Google Patents

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WO2023136230A1
WO2023136230A1 PCT/JP2023/000256 JP2023000256W WO2023136230A1 WO 2023136230 A1 WO2023136230 A1 WO 2023136230A1 JP 2023000256 W JP2023000256 W JP 2023000256W WO 2023136230 A1 WO2023136230 A1 WO 2023136230A1
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peptide
lipid membrane
enzyme
cells
chain
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哲志 山口
晃充 岡本
諒佑 池田
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国立大学法人 東京大学
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting contact between multiple biological substances having lipid membranes, and a lipid membrane modifier for biological substances suitable for the method.
  • Non-Patent Document 1 cancer cells and immune cells are poured into the fine structure on the microchip and placed next to each other, and evaluation is performed by quantifying the amount of immune cell activation and calcium signal induction to cancer cells. .
  • Non-Patent Document 2 a method for detecting contact between cells using a peptide-ligating enzyme, Sortase A (SrtA), has been developed (Non-Patent Document 2).
  • SrtA is an enzyme that joins the C-terminal LPXTG sequence and N-terminal oligoglycine sequence of proteins and peptides.
  • membrane proteins of two kinds of cells whose interactions are to be investigated are expressed by fusion with SrtA and oligoglycine sequences, respectively, and are treated with a labeling agent consisting of fluorescently labeled LPETG.
  • SrtA attaches a labeling agent to the oligoglycine sequences on the other cell, fluorescently labeling them, and allowing them to be visualized. This makes it possible to visualize contact sites between immune cells such as dendritic cells and T cells.
  • split green fluorescent protein split GFP
  • N-terminal side and the C-terminal side of the split green fluorescent protein are expressed on the cell membrane surface of separate cells, and only when the cells contact each other, the two bind to emit green fluorescence.
  • a method has also been reported (Non-Patent Document 3).
  • the object of the present invention is to solve the problems in the conventional technology described above and to develop a method for detecting cell-to-cell contact at the single-cell level without using gene transfer.
  • the present inventors have found that by using a lipid membrane modifier having a specific structure with a hydrophobic chain and a hydrophilic chain, SrtA, etc., can be obtained without gene introduction.
  • the desired enzyme and its substrate peptide sequence can be introduced into the cell surface layer, and cell-to-cell contact can be easily and efficiently performed at the single cell level simply by adding a labeling agent to the cell group to be measured.
  • the present invention has been completed by discovering that it can be detected by
  • the present invention relates to a method of detecting contact between a plurality of biological materials, more specifically comprising: ⁇ 1> A method for detecting contact between a plurality of biological substances having lipid membranes, A) contacting the first biological material with the first lipid membrane modifier to modify the surface of the biological material with the enzyme; B) contacting a second biological material with a second lipid membrane modifier to modify the surface of the second biological material with an oligopeptide or polypeptide; C) a step of mixing the first biological material and the second biological material and adding a labeling agent having a fluorescent dye or a fluorescence modification site in the molecule; D) observing fluorescence emission on the surface of the second biological material caused by the binding of the oligopeptide or polypeptide to the labeling agent by the action of the enzyme; detecting the presence or absence of contact between the first biological material and the second biological material based on the
  • the first lipid membrane modifier has a hydrophobic chain and a hydrophilic chain, and has a structure in
  • the method is a part, the method; ⁇ 2> The method according to ⁇ 1> above, wherein the hydrophilic chain in the first and/or second cell surface modifier contains polyalkylene glycol; ⁇ 3> The above ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein the hydrophobic chain in the first and/or second lipid membrane modifier is an optionally substituted saturated or unsaturated hydrocarbon chain. the method described in; ⁇ 4> Any one of ⁇ 1> to ⁇ 3> above, wherein the first and/or second lipid membrane modifier has a linker portion that connects the hydrophobic chain and the hydrophilic chain.
  • the labeling agent comprises a substrate peptide for the peptide-linked enzyme and the fluorescent dye or fluorescence modification site linked thereto, and the substrate peptide is combined with the oligopeptide in the presence of the peptide-linked enzyme.
  • the method according to ⁇ 6> above which has a peptide sequence that can specifically bind; ⁇ 8> The method according to ⁇ 6> above, wherein the peptide ligating enzyme is sortase A or transglutaminase; ⁇ 9> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 8> above, wherein the oligopeptide comprises oligoglycine; ⁇ 10> The method according to ⁇ 6> above, wherein the labeling agent contains a ligand molecule capable of binding to the polypeptide in the presence of the peptide-modifying enzyme; ⁇ 11> The above-described any one of ⁇ 1> to ⁇ 10>, further comprising a step of adding the other molecule having fluorescence and allowing it to bind to the fluorescence modification site before the step D).
  • Method ⁇ 15> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 14> above, further comprising a step of removing unreacted labeling agents after step C); ⁇ 16> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 15> above, wherein the biological material is selected from the group consisting of cells, organelles, vesicles, viruses, liposomes, and micelles; and ⁇ 17> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 16> above, wherein either one of the first biological material and the second biological material is an immune cell.
  • the present invention also relates to a lipid membrane modifier suitable for the above detection method, more specifically, ⁇ 18> A lipid membrane modifier for a biological material having a hydrophobic chain and a hydrophilic chain, and having a structure in which a peptide-ligating enzyme or a peptide-modifying enzyme is bound to the end of the hydrophilic chain; ⁇ 19> The lipid membrane modifier according to ⁇ 18> above, wherein the hydrophilic chain contains polyalkylene glycol; ⁇ 20> The lipid membrane modifier according to ⁇ 18> or ⁇ 19> above, wherein the hydrophobic chain is an optionally substituted saturated or unsaturated hydrocarbon chain; ⁇ 21> The lipid membrane modifier according to any one of ⁇ 18> to ⁇ 20> above, which has a linker portion that connects the hydrophobic chain and the hydrophilic chain; ⁇ 22> The lipid membrane modifier according to ⁇ 21> above, which has two hydrophobic chains branched from the linker portion; ⁇ 23> The lipid membrane modifier
  • the following effects that could not be achieved by the prior art can be achieved: (1) Contact between cells can be detected by fluorescence response or the like without any genetic manipulation of the cells to be measured; (2) Intercellular contact can be detected in a short time of about 1 hour by a very simple operation of allowing each cell to be measured to react with a labeling agent and mixing them; (3) Since arbitrary cells can be uniformly labeled regardless of the efficiency of gene transfer, the entire cell population can be comprehensively observed.
  • the present invention diseased cells in contact with immune cells can be labeled. cytotoxicity can be evaluated. Therefore, the present invention has extremely high industrial utility for storage/transporters as a technique for accurately managing the activity of therapeutic immune cells.
  • the selection of CAR-T cells and TCR-T cells that match the patient's cancer cells is essential for highly effective tailor-made therapy. If the cell-killing ability against cancer cells can be accurately examined, there is an advantage that immune cells with high therapeutic effects can be easily selected.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the detection concept in the method of the present invention.
  • FIG. 2 is an SDS-PAGE gel electrophoresis image of SrtA modified with DOPE-PEG-NHS.
  • FIG. 3 is a confocal laser microscope image of Jurkat cells treated with AF647-labeled SrtA-PEG-DOPE (FIG. 3A), and an image of untreated Jurkat cells observed as a control experiment (FIG. 3B).
  • left AF647 fluorescence image
  • middle bright-field image
  • right superimposed image of AF647 fluorescence image and bright-field image.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing an outline of the experimental procedure in Examples.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing an outline of the experimental procedure in Examples.
  • FIG. 5 is a confocal fluorescence microscope image after labeling by cell-to-cell contact with SrtA and oligoglycine introduced to the cell surface.
  • A Control untreated cells without all of SrtA, GGG, and AF488;
  • B Cells with all of SrtA, GGG, and AF488;
  • C -(E) SrtA, GGG, and AF488 Control cells that were not treated with either one.
  • FIG. 6 is a confocal laser microscope image on a cell pair array.
  • FIG. 7A is a conceptual diagram of quantitative analysis of intercellular interactions by flow cytometry (discrimination technique for fluorescence-labeled cells) performed in Examples.
  • FIG. 7(B) shows the fluorescence histogram (right) of the cell sample labeled with the photoactivated cell-fixing agent of the present invention and the histogram without GGG-PEG-DOPE (comparative example: middle). Histogram without GGG-PEG-DOPE and without AF488-LPETGG (comparative example: left).
  • FIG. 7(C) is a histogram when unmodified Jurkat was used instead of SrtA-Jurkat, and SrtA not modified with PEG-DOPE was allowed to act.
  • the method of the present invention is a method for detecting contact between a plurality of biological substances having lipid membranes, and is characterized by comprising the following steps A) to E). : A) contacting the first biological material with the first lipid membrane modifier to modify the surface of the biological material with the enzyme; B) contacting a second biological material with a second lipid membrane modifier to modify the surface of the second biological material with an oligopeptide or polypeptide; C) a step of mixing the first biological material and the second biological material and adding a labeling agent having a fluorescent dye or a fluorescence modification site in the molecule; D) observing fluorescence emission on the surface of the second biological material caused by the binding of the oligopeptide or polypeptide to the labeling agent by the action of the enzyme; detecting the presence or absence of contact between the first biological material and the second biological material based on.
  • FIG. 1 shows an example in which a peptide ligase is used as an enzyme and a labeling agent having a peptide sequence linked to a fluorescent dye is used as a representative example.
  • the surface layer of the lipid membrane is modified with an enzyme via the lipid membrane modifier.
  • the surface layer of the lipid membrane is modified with an oligopeptide that serves as a substrate for the enzyme via a lipid membrane modifier.
  • the surface layer of the second biological material emits fluorescence, so that the contact between the two biological materials can be detected by observing the fluorescence emission using a means such as a microscope.
  • the labeling agent is not linked to the surface of the second biological material, indicating that these cells did not come into contact.
  • the presence or absence of contact between biological substances can be detected by simply adding a labeling agent to an environment (in a solution, etc.) in which two biological substances are present. It is conceptual.
  • lipid membrane refers to membrane-like lipids.
  • lipid refers to a group of substances that are sparingly soluble in water and readily soluble in organic solvents. Lipids generally include long-chain fatty acids and their derivatives or analogues, but are also encompassed herein as a group of organic compounds such as steroids, carotenoids, terpenoids, isoprenoids, fat-soluble vitamins, and the like. Lipids include, for example, simple lipids (esters of fatty acids and alcohols, also called neutral lipids.
  • oils and fats triacylglycerol
  • waxes waxes
  • sterol esters fatty acid esters of vitamins
  • compound lipids compounds that have an ester bond or an amide bond, and in addition to fatty acids and alcohols, have polar groups such as phosphoric acid, sugar, sulfuric acid, amine, etc.
  • phospholipids for example, phospholipids (glycerophospholipids and sphingolipids) phospholipids, etc.), glycolipids (including glyceroglycolipids and glycosphingolipids, etc.), lipoproteins, sulfolipids, etc.); derived lipids (fat-soluble compounds produced by hydrolysis of simple lipids and complex lipids) (including fatty acids, higher alcohols, fat-soluble vitamins, steroids, hydrocarbons, etc.), but are not limited thereto.
  • biological materials having such lipid membranes include cells, organelles, vesicles, viruses, liposomes, micelles, and the like.
  • “cells” can include animal cells, plant cells, insect cells, prokaryotic cells, fungal cells, and the like, and generally do not adhere to or spread on the surface of a carrier such as a culture tool, and are in a suspended or precipitated state.
  • Proliferating "floating cells” (for example, blood cells) and "adherent cells” adhering and spreading on the carrier surface are dispersed from the carrier with an appropriate dispersing agent such as EDTA-trypsin, dispase, etc., and temporarily suspended.
  • fibroblasts detached from the carrier with EDTA solution
  • cells in a state of adhering to the carrier are also included.
  • organisms having a phospholipid bilayer membrane on their surfaces such as liposomes, exosomes, bacteria, viruses, organelles, and plant cells from which the cell walls have been removed (protoplasts).
  • substances having lipids such as lipid-coated particles can also be immobilized.
  • both the first biological material and the second biological material are cells (sometimes referred to as "first cell” and "second cell”, respectively).
  • one of the first biological substance and the second biological substance is an immune cell, and the other is a cancer cell, a normal cell, or the like for evaluating interaction with the immune cell. be able to.
  • the first and second cells are a combination of cancer cells and immune cells.
  • the method of the present invention can detect cell-to-cell contact, preferably cell-to-cell contact can be observed on a per cell level, i.e. on a one cell to one cell combination basis. It can be said that However, the term "1 cell level" is not limited to literally 1 cell, but can also include 2 to 10 cells.
  • immune cells include, for example, T cells, NK cells, B cells, neutrophils, eosinophils, basophils, monocytes, dendritic cells, macrophages, mast cells, Langerhans cells, keratinocytes cells, microglia, M cells, etc., and artificial immune cells such as CAR-T cells and TCR-T cells.
  • first and second biological agents include T helper cells and B cells; T helper cells and macrophages; Dendritic cells and T cells; Neurons and glial cells; and Kupffer cells; hepatoblasts and hepatic stellate cells; tumor cells and normal cells; Ras-activated benign tumor cells and Src-activated benign tumor cells;
  • step A) is a step of contacting the first biological material with the first lipid membrane modifier to modify the surface of the biological material with the enzyme.
  • the first lipid membrane modifier used here has a hydrophobic chain and a hydrophilic chain, and has a structure in which an enzyme is linked to the side chain or end of the hydrophilic chain. Typically the enzyme is attached to the end of the hydrophilic strand.
  • Hydrophobic chains are linked to the lipid membrane of the biomaterial by hydrophobic interactions, resulting in an enzyme modification of the surface layer of the first biomaterial.
  • the enzyme in the first lipid membrane modifier is preferably a peptide-ligating enzyme or a peptide-modifying enzyme.
  • Peptide ligases are enzymes that catalyze the specific ligation of specific peptide sequences on surface proteins of biological materials with other specific peptide sequences.
  • Peptide-modifying enzymes are enzymes that catalyze the binding and modification of specific molecules (eg, biotin) to specific peptide sequences on surface proteins of biomaterials.
  • Such peptide-ligating enzymes preferably include sortase A (SrtA) and transglutaminase, but are not limited thereto.
  • Sortase A is an enzyme that ligates the C-terminal LPXTG sequence (where "X” is any amino acid residue) of a protein or peptide chain and the N-terminal oligoglycine sequence.
  • Microbial transglutaminase is an enzyme that links Qtag (LLQG) and Ktag (MKHKGS).
  • peptide-modifying enzymes examples include biotin ligase (BirA), farnesyltransferase, myristoyltransferase (N-Myristoyltransferase), phosphopantetheinyl transferase, and tubulin tyrosine ligase. (Tubulin tyrosine ligase), lipoic acid ligase, protein kinase and the like.
  • the hydrophobic chain in the first lipid membrane modifier is not particularly limited as long as it can bind to a biological substance through hydrophobic interaction, and may be a saturated or unsaturated hydrocarbon chain optionally having a substituent. can be.
  • hydrocarbon chains include, for example, C 7-30 alkyl groups (preferably C 7-22 alkyl groups), C 6-14 aryl groups, C 6-14 aryl C 7-30 alkyl groups (preferably C 6-14 aryl C 7-22 alkyl group), and C 7-30 alkyl C 6-14 aryl group (preferably C 6-14 aryl C 7-22 alkyl group).
  • a C 7-30 alkyl group in which adjacent carbon atoms may be linked by 1 to 3 unsaturated bonds adjacent carbon atoms may be linked by 1 to 3 unsaturated bonds
  • adjacent carbon atoms may be linked by 1 to 3 unsaturated bonds
  • a C 7-22 alkyl group or a C 11-22 alkyl group in which adjacent carbon atoms are optionally linked by 1 to 3 unsaturated bonds, or adjacent carbon atoms by 1 to 3 unsaturated bonds
  • It can be an optionally linked C 16-18 alkyl group.
  • the hydrophobic chain (a) is a hexadecyl group, a heptadecyl group, an octadecyl (stearyl) group, a cis-9-hexadecenyl (palmitole) group, a cis-8-heptadecenyl group, a trans-8-heptadecenyl group, a trans -9-octadecenyl (elaidyl) group, cis-9-octadecenyl (oleyl) group, cis,cis-9,12-octadecadienyl (linolenyl) group, (9E,12E,15E)-octadeca-9,12, It can be a 15-trienyl (elaidolinolenyl) group.
  • an oleyl group which is part of phospholipids that constitute cell membranes, is preferred
  • substituents when defined as "optionally having a substituent", the type of substituent, substitution position, and number of substituents are not particularly limited, and two or more substituents may be the same or different.
  • substituents include, but are not limited to, alkyl groups, alkoxy groups, hydroxyl groups, carboxyl groups, halogen atoms, sulfo groups, amino groups, alkoxycarbonyl groups, and oxo groups. These substituents may further have a substituent.
  • the hydrophilic chain in the first lipid membrane modifier is preferably composed of a hydrophilic polymer.
  • Such hydrophilic polymers include polysaccharides such as polyalkylene glycol, polyvinyl alcohol, polyacrylic acid, polypeptide, polyacrylamide, and dextran, or polymers and copolymers of glycolic acid derivatives, lactic acid derivatives, and p-dioxane derivatives. etc. can be used.
  • the polyalkylene glycol is preferably a polymer of oxyalkylene units having 2 to 4 carbon atoms and having an average polymerization number in the range of 2 to 500 (preferably 45 to 500).
  • the hydrophilic polymer is preferably a biocompatible polymer, more preferably polyethylene glycol (PEG). As polyethylene glycol, those having an average molecular weight of 2000 or more are preferable.
  • the hydrophilic chain may further have an arbitrary substituent.
  • the first lipid membrane modifier can have a linker portion that connects the hydrophobic chain and the hydrophilic chain.
  • a linker portion for example, a functional group capable of forming a covalent bond such as an amide bond, an ester bond, an ether bond, a thioether bond, a carbamate bond, a thiocarbamate bond, a triazole bond, or a urea bond can be used.
  • a linker structure such as an oligomer or polymer having such functional groups can be used, and a linker having a branched chain can also be used.
  • Branched linkers include phosphatidyl groups; trihydric alcohols such as glycerol; benzenetriol and benzenetricarboxylic acid such as hydroxyquinol; benzenetriamine; can also be used.
  • the first lipid membrane modifier can have two hydrophobic chains branched from the linker portion.
  • the first lipid membrane modifier can be synthesized by reacting a base molecule having a hydrophobic chain and a hydrophilic chain with an enzyme. That is, the hydrophilic chain and the enzyme can be linked by covalently bonding the reactive functional group and the amino group of the enzyme to the side chain or end of the hydrophilic chain in the base molecule.
  • Such reactive functional groups include N-hydroxy-succinimidyl (NHS), maleimidyl, sulfosuccinimidyl, phthalimidyl, imidazoyl, acryloyl, —CO 2 PhNO 2 (Ph is o—, m -, or a p-phenylene group), or a nitrophenyl group, and those skilled in the art can appropriately use other known active ester groups.
  • a specific example of a base molecule having a hydrophobic chain and a hydrophilic chain is polyethylene glycol lipid (DOPE-PEG) having the following structure. However, it is not limited to this. (Wherein, X is the reactive functional group described above, n is a natural number greater than 2, preferably 2 to 500)
  • step B) is a step of contacting the second biological material with the second lipid membrane modifier to modify the surface of the biological material with the oligopeptide or polypeptide.
  • the second lipid membrane modifier used in step B) is similar to the first lipid membrane modifier in that it has a hydrophobic chain and a hydrophilic chain; It differs in that it has a structure in which an oligopeptide or polypeptide is linked to. Typically, oligopeptides or polypeptides are linked to the ends of hydrophilic chains. Hydrophobic chains, on the other hand, are linked to the lipid membrane of the biomaterial by hydrophobic interactions, thereby modifying the surface layer of the second biomaterial with an oligopeptide or polypeptide.
  • the oligopeptide or polypeptide used for the second lipid membrane modifier can use a peptide sequence that can specifically bind to the labeling agent described below by the catalytic action of the above enzyme.
  • Such an oligopeptide is preferably an oligoglycine, for example, when sortase A is used as the enzyme, and typically contains the sequence "GGGGG” or "GGGYC".
  • biotin-binding proteins such as streptavidin and avidin can be used when the labeling agent contains biotin.
  • the second lipid membrane modifier can be synthesized by reacting a base molecule having a hydrophobic chain and a hydrophilic chain with an oligopeptide or polypeptide. That is, the hydrophilic chain and the enzyme can be linked by covalently bonding the reactive functional group to the side chain or end of the hydrophilic chain in the base molecule and the amino group in the oligopeptide or polypeptide. Examples of such base molecule structures and reactive functional groups are as described above.
  • the types of hydrophobic chains and hydrophilic chains in the second lipid membrane modifier are as described above.
  • the second lipid membrane modifier can have a linker portion that connects the hydrophobic chain and the hydrophilic chain, and the type of such linker and the like are also as described above.
  • Step C is a step of mixing the first biological substance and the second biological substance and adding a labeling agent having a fluorescent dye or a fluorescence modification site in the molecule.
  • a labeling agent contains a peptide sequence (substrate peptide) or molecule capable of specifically binding to an oligopeptide or polypeptide in a second biological material in the presence of an enzyme modified in the first biological material. . Therefore, as shown in FIG. 1, by adding the labeling agent, when the first biological material and the second biological material come into contact, the labeling agent and the second biological material will specifically bind to the oligopeptide or polypeptide in the biological material.
  • the labeling agent may have a fluorescent dye directly linked in the molecule, or may have a fluorescence modification site for subsequent fluorescence labeling. good too.
  • the method of the present invention can further comprise a step of adding another molecule having fluorescence to bind to the fluorescence modification site before step D).
  • fluorescent dye used for the labeling agent a fluorescent compound known in the relevant technical field can be appropriately used according to the desired emission wavelength and the like.
  • fluorescent compound known in the relevant technical field can be appropriately used according to the desired emission wavelength and the like.
  • examples include rhodamine derivatives, fluorescein isothiocyanate (FITC), phycobiliprotein, rare earth metal chelates, dansyl chloride and the like. More specific examples include BODIPY derivatives, Alexa Fluor derivatives, ATTO derivatives, DY derivatives and the like.
  • a fluorescent modification site in a labeling agent means a site that can bind to another fluorescent molecule. That is, after the labeling agent binds to the oligopeptide or polypeptide on the surface of the second biological material, a reagent having fluorescence is separately added to bind to the fluorescence modification site, thereby obtaining the second
  • the surface of the biological material can be post fluorescently labeled. Peptide tags or ligand molecules can be used as such fluorescence modification sites.
  • Peptide tags generally contain peptide sequences that selectively bind to other molecules, such as Myc tag, FLAG tag, His tag, HA tag, V5 tag, V7 tag, VSV-G tag, Glu- Examples include epitope tabs such as Glu tag, CBP tag, and S tag, and Spy tag that binds to SpyCatcher.
  • ligand molecules include molecules having binding properties to specific peptide sequences, typically biotin, Halo-tag ligand chloroalkane, Snap-tag ligand benzylguanine, and the like.
  • another fluorescent molecule is a substance containing a peptide sequence or the like capable of binding to the fluorescence modification site and a fluorescent dye, such as a binding protein to which the fluorescent dye is linked.
  • Typical examples of combinations of fluorescent modification sites and other molecules having fluorescence include biotin and fluorescence-labeled streptavidin; or peptides containing a tag sequence and fluorescence-labeled antibodies. can be done.
  • the labeling agent contains a substrate peptide for the peptide-ligated enzyme and a fluorescent dye or fluorescent modification site linked thereto.
  • the substrate peptide means one having a peptide sequence capable of specifically binding to the oligopeptide of the second biological substance in the presence of the peptide ligating enzyme.
  • the peptide ligating enzyme in the first biological material is sortase A
  • the oligopeptide in the second biological material is oligoglycine
  • the substrate peptide in the labeling agent contains the LPXTG sequence.
  • "X" is any one or more amino acid residues, preferably E, D, A, N, Q, or K.
  • the labeling agent can comprise a ligand molecule that can bind to the polypeptide of the second biomaterial in the presence of the peptide-modifying enzyme.
  • a ligand molecule is preferably biotin, which can specifically bind to a polypeptide (such as a biotin-binding protein) modified by a second biological substance, for example.
  • chloroalkane which is a ligand for Halo-tag
  • benzylguanine which is a ligand for Snap-tag
  • step D as shown in FIG. 1, the oligopeptide or polypeptide on the surface of the second biological material binds to the labeling agent by the action of the enzyme modified on the surface of the first biological material. Observing the resulting fluorescence emission, ie the fluorescence emission at the surface of the second biological material. Accordingly, in step E), it is possible to detect the presence or absence of contact between the first biological material and the second biological material based on the observation result of the fluorescence emission.
  • the observation of fluorescence emission in step D) can typically be performed using means such as changes in fluorescence intensity in fluorescence spectroscopy or microscopic images. In addition, it can be observed using a Raman microscope, scanning probe microscope, ghost imaging, holographic microscope, electron microscope, and nonlinear optical microscope.
  • step D when the first biological material and the second biological material are brought into contact with each other, the peptide sequence in the surrounding labeling agent is unique to the oligopeptide on the surface of the second biological material due to the action of the enzyme. physically connect. Therefore, when fluorescence emission is observed on the surface of the second biological material as a result of observation of fluorescence emission in step D, it means that the first and second biological materials have come into contact with each other. On the other hand, if no fluorescence emission is observed from the second biological material, the labeling agent is not linked to the surface of the second biological material, indicating that these cells did not come into contact. These results allow step E) to detect the presence or absence of contact between the first biological material and the second biological material. In particular, when cells are used as the biological substance, the presence or absence of contact between cells can be detected at the single-cell level.
  • either one of the first and second biological substances can be fluorescently stained with a color different from the fluorescent dye of the labeling agent before step A) or B).
  • This is advantageous in that the cells in the intermediate state in which the enzyme in the first biological substance and the labeling agent having the fluorescent dye are bound can be clearly distinguished from the fluorescently labeled second cells.
  • fluorescent staining can also be performed after step A) or B). Methods well known in the art can be used as means for fluorescently staining biological substances such as cells.
  • a step of removing unreacted labeling agents can be further included after step C).
  • the washing can be performed by a method known in the art.
  • the first and second biological substances are treated with a solution that does not damage cells, such as cell culture medium, physiological saline, and isotonic buffer.
  • An operation to wash can be performed.
  • an operation of washing with pure water, other aqueous solutions, organic solvents, or the like can also be performed.
  • a series of steps in the method of the present invention can be performed in a substrate or container having any material and shape.
  • the shape of such a substrate may be in the form of a substrate (plate-like or film-like, such as a slide glass, dish, microplate, microarray substrate, etc.), or in the form of a carrier (e.g., particles such as beads, or colloidal). ), fibrous structures, tubes, containers (eg, test tubes and vials).
  • Materials for the substrate include glass; cement; ceramics or fine ceramics such as ceramics; polymer resins such as polyethylene terephthalate, cellulose acetate, polycarbonate, polystyrene and polymethyl methacrylate; biomaterials such as polypeptides and proteins; Porous glass; porous ceramics; porous silicon; porous activated carbon; non-woven fabric; filter paper;
  • the surface of the substrate may be coated with a polymer such as polycation, or treated with a silane coupling agent having substituents introduced into the substrate surface, or may be reacted by plasma treatment.
  • a functional group may be introduced.
  • the present invention provides a lipid membrane modifier for a biological substance suitable for the detection method described above.
  • lipid membrane modifiers are characterized by having a structure comprising a hydrophobic chain and a hydrophilic chain, with a peptide ligating enzyme or a peptide modifying enzyme bound to the end of the hydrophilic chain.
  • the lipid membrane modifier corresponds to the first lipid membrane modifier described above, and as already described, comprises a base molecule having a hydrophobic chain and a hydrophilic chain and an oligopeptide or polypeptide. It can be synthesized by reacting. That is, the hydrophilic chain and the enzyme can be linked by covalently bonding the reactive functional group to the side chain or end of the hydrophilic chain in the base molecule and the amino group in the peptide-ligating enzyme or peptide-modifying enzyme. . Examples of such base molecule structures and reactive functional groups are as described above.
  • the lipid membrane modifier of the present invention can have a linker portion that connects the hydrophobic chain and the hydrophilic chain, and the type of such linker and the like are also as described above.
  • reaction solution was added dropwise to 35 mL diethyl ether ⁇ 4 under ice-cooling, centrifuged ( ⁇ 10° C., 8000 G for 10 minutes + 10000 G for 10 minutes), and the supernatant was removed by decantation. The remaining white solid was vacuum dried in a desiccator.
  • the resulting PEG-lipid modified SrtA (SrtA-PEG-DOPE) was purified by dialysis in PBS. Modification of the PEG lipid was confirmed by the shift of the SrtA-derived band toward higher molecular weights in sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) (FIG. 2). Note that the fluorescent dye (AF647) was ligated for the purpose of confirming the modification in FIG.
  • SrtA on the cell surface by the synthesized lipid membrane modifier was confirmed by the following measurements. After culturing the human leukemia cell line Jurkat cells, they were collected at the bottom of the tube by centrifugation, and then washed twice with PBS. This cell pellet was suspended in the above-prepared AF647-labeled SrtA-PEG-DOPE aqueous solution in PBS (final concentration: 50 ⁇ M) (cell density: 7.6 ⁇ 10 6 cells/mL), and allowed to stand at room temperature for 15 minutes. , introduced SrtA into the cell membrane.
  • the SrtA-PEG-DOPE aqueous solution was removed and washed twice with PBS.
  • the cells were resuspended in PBS (cell density: 3.8 ⁇ 10 6 cells/mL), seeded on a glass bottom dish, and examined with AF647 fluorescence (optical slice 1 ⁇ m) and bright field using a confocal laser scanning microscope (Leika SP8). A microscopic image (objective lens: 63x) was acquired.
  • AF647 fluorescence optical slice 1 ⁇ m
  • Leika SP8 confocal laser scanning microscope
  • GGGYC A peptide (GGGYC) containing triglycine at the N-terminus was purified after solid-phase synthesis, reacted with a cell surface modifier having a maleimide group (DOPE-PEG-Mal) in MOPS buffer (pH 7.0), and PEG lipid A modified triglycine peptide (GGG-PEG-DOPE) was synthesized. Synthesis conditions were the same as in the literature (Tomita et al., Biotechnol. Bioeng. 2013, 110, 2785-2789).
  • Alexa Fluor 488 was introduced to the N-terminus of the peptide (DLPETGG) containing the SrtA substrate sequence for fluorescence labeling.
  • agent AF488-DLPETGG was synthesized.
  • red-stained Jurkat cells were treated with an aqueous solution of GGG-PEG-DOPE in PBS (final concentration: 66 ⁇ M) for 15 minutes in an incubator, washed, and triglycine peptide was introduced into the cell surface layer.
  • SrtA-introduced Jurkat cells (SrtA-Jurkat) (2.4 ⁇ 10 cells/mL) and triglycine-introduced Jurkat cells (GGG-Jurkat) (2.4 ⁇ 10 cells/mL) were mixed in PBS, and a cell fixative (Biocompatible anchor) was added.
  • a cell fixative Biocompatible anchor
  • AF488-DLPETGG aqueous solution final concentration 40 ⁇ M, in SrtA reaction buffer: 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl 2 , pH 8.0), allowed to act at room temperature for 70 minutes, and intercellular Fluorescent labeling was performed via peptide ligation reaction. Thereafter, the AF488-DLPETGG aqueous solution was removed and replaced with PBS, and fluorescence was observed with a confocal laser microscope. For comparison, similar measurements were performed under the following conditions A to E.
  • condition C (FIG. 5C) without introduction of SrtA
  • condition D (FIG. 5D) without introduction of oligoglycine
  • condition E (FIG. 5E) with no fluorescent labeling agent were used.
  • no green fluorescence was observed from the surface layer of GGG-Jurkat cells as in condition A (FIG. 5A) in the untreated case.
  • the green fluorescence observed on the surface of GGG-Jurkat cells under condition B is fluorescence due to the binding of the fluorescent labeling agent by SrtA on the surface of SrtA-Jurkat cells.
  • the fluorescence-labeled GGG-PEG-DOPE diffused throughout the cell membrane.
  • FIG. 6 Visualization of Intercellular Interactions on Cell Pair Array Cell-cell contacts were observed at the single-cell level using microchannels whose bottom surface was modified with a light-activated cell-fixing agent (FIG. 6). Specifically, a photoactivated cell-fixing agent solution (final concentration: 100 ⁇ M, PBS containing 50% DMSO) was injected into a microchannel whose bottom surface was coated with collagen, and left to stand at 37° C. for 3 hours. The bottom surface of the channel was modified with a light-activated cell-fixing agent.
  • a photoactivated cell-fixing agent solution final concentration: 100 ⁇ M, PBS containing 50% DMSO
  • spots of light (wavelength: 360 nm) with a diameter of about 10 to 15 ⁇ m were placed on the bottom surface of the flow path in a grid pattern (50 blocks of 5 vertical spots ⁇ 10 horizontal spots) at intervals of 100 ⁇ m. irradiated.
  • the above suspension of SrtA-Jurkat cells was injected into the channel, allowed to stand at room temperature for 10 minutes, then PBS was flowed to wash away unfixed cells, and the cells were placed only on the light-irradiated spots.
  • a spot of light was irradiated so as to be laterally adjacent to the immobilized SrtA-Jurkat cells, and the GGG-Jurkat cell suspension was injected.
  • FIG. 7A shows a conceptual diagram of the quantitative analysis.
  • FIGS. 7(B) and (C) show the fluorescence histogram (right) of the cell sample labeled with the photoactivated cell-fixing agent of the present invention and the histogram without GGG-PEG-DOPE (comparative example: middle). Histogram without GGG-PEG-DOPE and without AF488-LPETGG (comparative example: left).
  • FIG. 7(C) is a histogram when unmodified Jurkat was used instead of SrtA-Jurkat, and SrtA not modified with PEG-DOPE was allowed to act.

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Abstract

【課題】　遺伝子導入を用いることなく、１細胞レベルで細胞間接触を検出する手法を開発することを課題とする。 【解決手段】　疎水性鎖と親水性鎖を有する特定の構造を有する細胞脂質膜修飾剤を用いることで、遺伝子導入を用いることなくＳｒｔＡ等の所望の酵素とその基質となるペプチド配列を細胞表層に導入でき、これらの測定対象の細胞群に標識剤を添加するという操作を行うだけで、簡便かつ効率的に細胞間接触を１細胞レベルで検出し得る方法。

Description

生体物質間の接触を検出する方法
　本発明は、脂質膜を有する複数の生体物質間の接触を検出する方法、及び、当該方法に好適な生体物質用脂質膜修飾剤に関する。
　細胞間の相互作用は発生や神経伝達、免疫などの多くの生命現象を担うため、その検出と定量は、生命システムの理解や薬剤探索、細胞治療の診断において重要である。特に、がんやウイルス感染症に対する免疫の働きが、その重症化や治癒率に関与することから、免疫細胞と疾病細胞との相互作用が注目されている。ＮＫ細胞や細胞傷害性Ｔ細胞などの細胞殺傷性の免疫細胞は、生体内に生じたがん細胞やウイルス感染細胞などの異常細胞と相互作用し、殺傷することによって健康維持に大きく寄与している。このような背景の下、免疫細胞の細胞傷害性を正確に計測する技術は、体調管理や疾病の早期診断、薬物や健康食品、治療の効果のモニタリング、治療用免疫細胞の評価といった幅広い応用が考えられ、極めて重要である。
　例えば、免疫細胞の活性化を調べる古典的な技術としては、モデルがん細胞（ヒト白血病細胞Ｋ５６２株など）と共培養し、５１Ｃｒ放出測定法や乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）放出法などによって死細胞の数を数える方法が知られている。また近年、免疫細胞の細胞傷害性を１細胞レベルで定量できる細胞アレイも報告されている（非特許文献１）。この技術では、マイクロチップ上の微細構造中に、がん細胞と免疫細胞とを流し込んで隣接させ、免疫細胞の活性化やがん細胞へのカルシウムシグナル誘導量を定量化することによって評価を行う。
　しかしながら、これら従来技術では、細胞間の相互作用によって誘導されたと推測される細胞の変化を測定しているだけで、相互作用自体を計測していない。それぞれの細胞表面上の分子が接触できるほど近接したかどうかは不明である。したがって、上記の技術で計測された細胞の変化は、細胞間の接触によって生じたのかは厳密には不明である。また、接触したにも関わらず細胞に変化が生じなかったものも検出できない。免疫細胞の活性を正確に評価するためには、接触した疾患細胞の中で殺傷できたものの割合を評価するべきであり、細胞間の接触を調べずに評価しても活性の擬陽性や過大評価、擬陰性や過少評価の原因となり、正確な評価が困難である。
　そのため、近年、細胞間の接触を蛍光顕微鏡で可視化する技術が盛んに研究されている。例えば、細胞間の接触を検出する技術として、ペプチド連結酵素であるソルターゼＡ(Ｓｏｒｔａｓｅ Ａ；ＳｒｔＡ)を用いた細胞間接触検出法が開発されている（非特許文献２）。ＳｒｔＡは、タンパク質やペプチドのＣ末端ＬＰＸＴＧ配列と、Ｎ末端オリゴグリシン配列とを連結する酵素である。この手法では、相互作用を調べたい二種類の細胞の膜タンパク質に、それぞれＳｒｔＡとオリゴグリシン配列とを融合して発現させ、蛍光標識したＬＰＥＴＧから成るラベル化剤を作用させる。細胞間で分子間が接触できるほど近接している部位では、ＳｒｔＡが相手の細胞上のオリゴグリシン配列にラベル化剤を連結させて蛍光標識し、可視化することができる。これにより、樹状細胞とＴ細胞といった免疫細胞同士の接触部位の可視化が可能となる。
　また、分割型緑色蛍光タンパク質（ｓｐｌｉｔ ＧＦＰ）のＮ末端側とＣ末端側を、それぞれ別の細胞の細胞膜表層に発現させ、細胞間の接触が生じた場合のみ両者が結合して緑色蛍光を発する手法も報告されている（非特許文献３）。
　しかしながら、これら従来の細胞間接触の検出手法では、分析対象である細胞のペアにＳｒｔＡ等の融合タンパク質遺伝子を導入することが必要となる。従って、遺伝子導入効率が低い細胞の相互作用や、治療用の免疫細胞など、遺伝子導入が望ましくない用途の細胞には応用できないという課題があった。
Dura et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2016, 113, E3599 Pasqual, et al., Nature 2018, 553, 496-500 Kinoshita et al., iScience 2019, 31, 28-38
　そこで、本発明は、上述の従来技術における問題点を解消し、遺伝子導入を用いることなく、１細胞レベルで細胞間接触を検出する手法を開発することを課題とするものである。
　本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った結果、疎水性鎖と親水性鎖を有する特定の構造を有する脂質膜修飾剤を用いることで、遺伝子導入を用いることなくＳｒｔＡ等の所望の酵素とその基質となるペプチド配列を細胞表層に導入でき、これらの測定対象の細胞群に標識剤を添加するという操作を行うだけで、簡便かつ効率的に細胞間接触を１細胞レベルで検出し得ることを見出し、本発明を完成するに至ったものである。
　すなわち、本発明は、一態様において、複数の生体物質間の接触を検出する方法に関し、より具体的には、
＜１＞脂質膜を有する複数の生体物質間の接触を検出する方法であって、
Ａ）第１の生体物質と第１の脂質膜修飾剤とを接触させ、前記生体物質の表面に酵素を修飾する工程；
Ｂ）第２の生体物質と第２の脂質膜修飾剤とを接触させ、前記第２の生体物質の表面にオリゴペプチド又はポリペプチドを修飾する工程；
Ｃ）前記第１の生体物質及び前記第２の生体物質を混合し、分子内に蛍光色素又は蛍光修飾部位を有する標識剤を添加する工程；
Ｄ）前記酵素の作用によって前記オリゴペプチド又はポリペプチドと前記標識剤が結合することにより生じる、前記第２の生体物質の表面における蛍光発光を観測する工程；及び
Ｅ）前記蛍光発光の観測結果に基づき、前記第１の生体物質と前記第２の生体物質の間の接触の有無を検出する工程
を含み、
　前記第１の脂質膜修飾剤は、疎水性鎖及び親水性鎖を有し、前記親水性鎖の側鎖又は末端に前記酵素が連結した構造を有しており；
　前記第２の脂質膜修飾剤は、疎水性鎖及び親水性鎖を有し、前記親水性鎖の側鎖又は末端に前記オリゴペプチド又はポリペプチドが連結した構造を有しており； 
　前記標識剤は、前記酵素の存在化下において前記オリゴペプチド又はポリペプチドと特異的に結合し得るペプチド配列又は分子を含み：及び
　前記蛍光修飾部位は、蛍光性を有する他の分子と結合可能な部位である、
該方法；
＜２＞前記第１及び／又は第２の細胞表層修飾剤における親水性鎖が、ポリアルキレングリコールを含む、上記＜１＞に記載の方法；
＜３＞前記第１及び／又は第２の脂質膜修飾剤における疎水性鎖が、置換基を有していてもよい飽和又は不飽和の炭化水素鎖である、上記＜１＞又は＜２＞に記載の方法；
＜４＞前記第１及び／又は第２の脂質膜修飾剤が、前記疎水性鎖と前記親水性鎖とを連結するリンカー部を有する、上記＜１＞～＜３＞のいずれか１に記載の方法；
＜５＞前記第１及び／又は第２の脂質膜修飾剤が、前記リンカー部から分岐する２本の疎水性鎖を有する、上記＜４＞に記載の方法；
＜６＞前記酵素が、ペプチド連結酵素又はペプチド修飾酵素である、上記＜１＞～＜５＞のいずれか１に記載の方法；
＜７＞前記標識剤が、前記ペプチド連結酵素に対する基質ペプチドと、これに連結した前記蛍光色素又は蛍光修飾部位とを含み、前記基質ペプチドは、前記ペプチド連結酵素の存在化下において前記オリゴペプチドと特異的に結合し得るペプチド配列を有するものである、上記＜６＞に記載の方法；
＜８＞前記ペプチド連結酵素が、ソルターゼＡ（Ｓｏｒｔａｓｅ Ａ）又はトランスグルタミナーゼである、上記＜６＞に記載の方法；
＜９＞前記オリゴペプチドが、オリゴグリシンを含む、上記＜１＞～＜８＞のいずれか１に記載の方法；
＜１０＞前記標識剤が、前記ペプチド修飾酵素の存在下において前記ポリペプチドと結合し得るリガンド分子を含む、上記＜６＞に記載の方法；
＜１１＞前記工程Ｄ）の前に、前記蛍光性を有する他の分子を添加して、前記蛍光修飾部位に結合させる工程をさらに含む、上記＜１＞～＜１０＞のいずれか１に記載の方法；
＜１２＞前記蛍光修飾部位が、ペプチドタグ又はリガンド分子である、上記＜１＞～＜１１＞のいずれか１に記載の方法；
＜１３＞前記蛍光性を有する他の分子が、蛍光色素が連結した結合タンパク質である、上記＜１＞～＜１２＞のいずれか１に記載の方法；
＜１４＞前記工程Ａ）又はＢ）の前又は後に、第１及び第２の生体物質のいずれか一方を蛍光染色することを含む、上記＜１＞～＜１３＞のいずれか１に記載の方法；
＜１５＞前記工程Ｃ）の後に、未反応の標識剤を除去する工程をさらに含む、上記＜１＞～＜１４＞のいずれか１に記載の方法；
＜１６＞前記生体物質が、細胞、細胞小器官、小胞、ウイルス、リポソーム、及びミセルからなる群から選択される、上記＜１＞～＜１５＞のいずれか１に記載の方法；及び
＜１７＞第１の生体物質及び前記第２の生体物質のいずか一方が、免疫細胞である、上記＜１＞～＜１６＞のいずれか１に記載の方法
を提供するものである。
　また、別の態様において、本発明は、上記検出方法に好適な脂質膜修飾剤にも関し、より具体的には、
＜１８＞疎水性鎖及び親水性鎖を有し、前記親水性鎖の末端にペプチド連結酵素又はペプチド修飾酵素を結合した構造を有する生体物質の脂質膜修飾剤；
＜１９＞前記親水性鎖が、ポリアルキレングリコールを含む、上記＜１８＞に記載の脂質膜修飾剤；
＜２０＞前記疎水性鎖が、置換基を有していてもよい飽和又は不飽和の炭化水素鎖である、上記＜１８＞又は＜１９＞に記載の脂質膜修飾剤；
＜２１＞前記疎水性鎖と前記親水性鎖とを連結するリンカー部を有する、上記＜１８＞～＜２０＞のいずれか１に記載の脂質膜修飾剤；
＜２２＞前記リンカー部から分岐する２本の疎水性鎖を有する、上記＜２１＞に記載の脂質膜修飾剤；
＜２３＞前記ペプチド連結酵素が、ソルターゼＡ（Ｓｏｒｔａｓｅ Ａ）又はトランスグルタミナーゼである、上記＜１８＞～＜２２＞のいずれか１に記載の脂質膜修飾剤；
＜２４＞脂質膜を有する複数の生体物質間の接触を検出するために用いられる、上記＜１８＞～＜２３＞のいずれか１に記載の脂質膜修飾剤；及び
＜２５＞前記生体物質が、細胞、細胞小器官、小胞、ウイルス、リポソーム、及びミセルからなる群から選択される、上記＜１８＞～＜２４＞のいずれか１に記載の脂質膜修飾剤
を提供するものである。
　本発明によれば、従来技術ではなし得なかった以下の効果を奏することができる：
（１）測定対象の細胞に対して遺伝子操作を一切行うことなく、細胞間の接触を蛍光応答等により検出できる点；
（２）測定対象の細胞にそれぞれ標識剤を作用させて混合するだけの極めて簡便な操作によって、１時間程度の短時間で細胞間接触を検出できる点；
（３） 遺伝子導入などの効率に因らず、任意の細胞を均一に標識できるため、細胞集団全体を網羅的に観測できる点。
　加えて、本発明によれば、免疫細胞と接触した疾患細胞を標識できるため、「標識された細胞」に含まれる「細胞死を誘導された細胞」の割合を調べることによって、正確に免疫細胞の細胞傷害性を評価できる。したがって、本発明は、治療用免疫細胞の正確な活性管理技術として、保管・運搬業者にとって極めて高い産業上の有用性がある。また、治療用細胞の加工産業においても、患者のがん細胞に合致するＣＡＲ－Ｔ細胞やＴＣＲ－Ｔ細胞の選別が、効果の高いテーラーメード治療に必要不可欠であることから、本発明によって患者のがん細胞に対する細胞殺傷性を正確に調べることができれば、治療効果の高い免疫細胞を簡単に選別できるという利点がある。
図１は、本発明の方法における検出概念を示す模式図である。 図２は、ＤＯＰＥ－ＰＥＧ－ＮＨＳで修飾を施したＳｒｔＡのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動の画像である。 図３は、ＡＦ６４７標識ＳｒｔＡ－ＰＥＧ－ＤＯＰＥを作用させたＪｕｒｋａｔ細胞の共焦点レーザー顕微鏡画像（図３Ａ）、及び 対照実験として観察した未処理のＪｕｒｋａｔ細胞の画像（図３Ｂ）である。図中、左： ＡＦ６４７蛍光画像、中：明視野画像、右：ＡＦ６４７蛍光画像と明視野画像の重ね合わせ画像。 図４は、実施例における実験手順の概要を示す模式図である。 図５は、ＳｒｔＡとオリゴグリシンをそれぞれ細胞表層に導入した細胞間の接触による標識後の共焦点蛍光顕微鏡画像である。（Ａ）ＳｒｔＡとＧＧＧ、ＡＦ４８８の全てを作用させなかった対照用未処理細胞；（Ｂ）ＳｒｔＡとＧＧＧ、ＡＦ４８８の全てを作用させた細胞；（Ｃ）～（Ｅ）ＳｒｔＡとＧＧＧ、ＡＦ４８８のいずれか一つを作用させなかった対照用細胞。 図６は、細胞ペアアレイ上における共焦点レーザー顕微鏡画像である。 図７（Ａ）は、実施例で行ったフローサイトメトリー（蛍光標識細胞の識別技術）による細胞間相互作用の定量解析の概念図である。図７（Ｂ）は、本発明の光活性化細胞固定化剤で標識した細胞サンプルの蛍光ヒストグラム（右）と同様に測定したGGG-PEG-DOPE無しの場合のヒストグラム（比較例：中央）、GGG-PEG-DOPEおよびAF488-LPETGG無しの場合のヒストグラム（比較例：左）である。図７（Ｃ）は、ＳｒｔＡ－Ｊｕｒｋａｔの代わりに未修飾のＪｕｒｋａｔを用い、ＰＥＧ－ＤＯＰＥを修飾していないＳｒｔＡを作用させた場合のヒストグラムである。
　以下、本発明の実施形態について説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
１．本発明の生体物質間接触の検出方法
　本発明の方法は、脂質膜を有する複数の生体物質間の接触を検出する方法であって、以下の工程Ａ）～Ｅ）を含むことを特徴とする：
Ａ）第１の生体物質と第１の脂質膜修飾剤とを接触させ、前記生体物質の表面に酵素を修飾する工程；
Ｂ）第２の生体物質と第２の脂質膜修飾剤とを接触させ、前記第２の生体物質の表面にオリゴペプチド又はポリペプチドを修飾する工程；
Ｃ）前記第１の生体物質及び前記第２の生体物質を混合し、分子内に蛍光色素又は蛍光修飾部位を有する標識剤を添加する工程；
Ｄ）前記酵素の作用によって前記オリゴペプチド又はポリペプチドと前記標識剤が結合することにより生じる、前記第２の生体物質の表面における蛍光発光を観測する工程；及び
Ｅ）前記蛍光発光の観測結果に基づき、前記第１の生体物質と前記第２の生体物質の間の接触の有無を検出する工程。
　本発明の方法における検出概念を図１に示す（なお、図１では代表例として、酵素としてペプチド連結酵素を用い、蛍光色素を連結したペプチド配列を有する標識剤を用いる例を示している）。第１の生体物質は、脂質膜修飾剤を介して脂質膜の表層に酵素が修飾されている。第２の生体物質は、脂質膜修飾剤を介して脂質膜の表層に当該酵素の基質となるオリゴペプチドが修飾されている。これらの生体物質が接触した場合、上記酵素の作用により、周囲に存在する蛍光色素を有する標識剤におけるペプチド配列が、第２の生体物質の表層におけるオリゴペプチドと連結される。その結果、第２の生体物質の表層は蛍光を発光することになるため、かかる蛍光発光を顕微鏡等の手段で観測することで２つの生体物質が接触したことを検出することができる。一方、第２の生体物質から蛍光発光が観測されない場合には、標識剤が第２の生体物質表層に連結されないことから、これらの細胞が接触しなかったことが分かる。このように、本発明の方法によれば、２種の生体物質が存在する環境（溶液中等）に、標識剤を添加するという簡便な操作のみによって、生体物質間の接触の有無を検出するという概念に基づくものである。
　ここで、本発明における観測の対象となる生体物質としては、脂質膜を有する構造体を広く対象とすることができる。ここで「脂質膜」とは膜状の脂質のことである。本明細書中、「脂質」とは、水に溶けにくく、有機溶媒に溶けやすい物質群をいう。通常、脂質には、長鎖脂肪酸及びその誘導体、または類似体が含まれるが、本明細書においては、ステロイド、カロテノイド、テルペノイド、イソプレノイド、脂溶性ビタミンなどの有機化合物群もまた包含される。脂質としては、例えば、単純脂質（脂肪酸とアルコールとのエステルで中性脂質ともいう。例えば、油脂（トリアシルグリセロール）、蝋（ワックス、高級アルコールの脂肪酸エステル）、ステロールエステル、ビタミンの脂肪酸エステルなどが挙げられる）；複合脂質（エステル結合あるいはアミド結合を有し、脂肪酸とアルコールのほかにリン酸、糖、硫酸、アミンなど極性基をもつ化合物のことである。例えばリン脂質（グリセロリン脂質及びスフィンゴリン脂質など）、糖脂質（グリセロ糖脂質及びスフィンゴ糖脂質など）、リポタンパク質、スルホ脂質などが含まれる）；誘導脂質（単純脂質および複合脂質の加水分解によって生成する化合物のうち脂溶性のものをいい、脂肪酸、高級アルコール、脂溶性ビタミン、ステロイド、炭化水素などが含まれる）が挙げられるが、それらに限定されない。
　かかる脂質膜を有する生体物質としては、例えば、細胞、細胞小器官、小胞、ウイルス、リポソーム、及びミセルなどを挙げることができる。ここで、「細胞」には、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、原核細胞、真菌細胞などを含むことができ、一般に培養器具等の担体表面に接着・伸展せず、懸濁または沈殿状態で増殖する「浮遊細胞」と呼ばれるもの（例えば血球細胞）や、担体表面に接着・伸展する「接着細胞」をＥＤＴＡ－トリプシン、ディスパーゼ等の適当な分散剤で担体から分散させ、一時的に浮遊させたもの（例えばＥＤＴＡ液で担体から剥離した線維芽細胞）、および担体に接着した状態の細胞を含む。また、リポソーム、エキソソーム、細菌、ウイルス、オルガネラ、細胞壁を除去した植物細胞（プロトプラスト）等の表面にリン脂質二重膜を有する生命体も含まれる。また、本発明の固定化材料によれば、これら以外にも、脂質コート粒子など脂質を有する物質を固定化することもできる。　
　典型的には、第１の生体物質及び前記第２の生体物質は、いずれも細胞である（それぞれ「第１の細胞」及び「第２の細胞」と呼ぶ場合がある。）。好ましい態様では、第１の生体物質及び前記第２の生体物質のいずか一方が免疫細胞であり、他方が当該免疫細胞との相互作用を評価するためのがん細胞や正常細胞などであることができる。したがって、好ましくは、第１と第２の細胞が、がん細胞と免疫細胞の組み合わせである。この場合、本発明の方法によって、細胞間の接触を検出することができるが、好ましくは、細胞間の接触を１細胞レベル、すなわち、1細胞対1細胞の組合せの単位で観測することができるということができる。ただし、「１細胞レベル」とは、文字通り１細胞を意味する場合だけに限らず、２～１０細胞のような場合も含み得る用語である。
　本明細書において、免疫細胞には、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、好中球、好酸球、好塩基球、単球、樹状細胞、マクロファージ、マスト細胞、ランゲルハンス細胞、角化細胞、ミクログリア、Ｍ細胞などや、人工の免疫細胞としてＣＡＲ－Ｔ細胞やＴＣＲ－Ｔ細胞などが含まれる。
　第１の生体物質と第２の生体物質の組合せに関して、その他の例としては、ヘルパーＴ細胞とＢ細胞；ヘルパーＴ細胞とマクロファージ；樹状細胞とＴ細胞；神経細胞とグリア細胞；肝実質細胞とクッパ―細胞；肝芽細胞と肝星細胞；腫瘍細胞と正常細胞；Ｒａｓ活性化良性腫瘍細胞とＳｒｃ活性化良性腫瘍細胞などを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
　以下、上記工程Ａ～Ｅについて、具体的に説明する。
＜工程Ａ＞
　上述のように、工程Ａ）は、第１の生体物質と第１の脂質膜修飾剤とを接触させ、前記生体物質の表面に酵素を修飾する工程である。ここで用いられる第１の脂質膜修飾剤は、疎水性鎖及び親水性鎖を有しており、当該親水性鎖の側鎖又は末端に酵素が連結した構造を有している。典型的には、酵素は、親水性鎖の末端に連結されている。一方、疎水性鎖は、生体物質の脂質膜と疎水性相互作用により連結され、これにより、第１の生体物質の表面層に酵素が修飾される。
　第１の脂質膜修飾剤における酵素は、好ましくは、ペプチド連結酵素又はペプチド修飾酵素である。ペプチド連結酵素は、生体物質の表面タンパク質における特定のペプチド配列と、他の特定のペプチド配列との特異的な連結を触媒する酵素である。ペプチド修飾酵素は、生体物質の表面タンパク質における特定のペプチド配列への、特定の分子（例えば、ビオチン）の結合・修飾を触媒する酵素である。かかるペプチド連結酵素としては、好ましくは、ソルターゼＡ(Ｓｏｒｔａｓｅ Ａ；ＳｒｔＡ)やトランスグルタミナーゼを挙げることができるが、これに限定されるものではない。ソルターゼＡは、タンパク質やペプチド鎖のＣ末端ＬＰＸＴＧ配列（ここで、「Ｘ」は、任意のアミノ酸残基である）と、Ｎ末端オリゴグリシン配列とを連結する酵素である。微生物由来のトランスグルタミナーゼ（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ）は、Ｑｔａｇ（ＬＬＱＧ）とＫｔａｇ（ＭＫＨＫＧＳ）を連結する酵素である。
　また、ペプチド修飾酵素としては、例えば、ビオチンリガーゼ（ＢｉｒＡ）、ファルネシル基転移酵素（Ｆａｒｎｅｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）やミリストイル基転移酵素（Ｎ－Ｍｙｒｉｓｔｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ホスホパンテテイニル基転移酵素（Ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、チューブリンチロシンリガーゼ（Ｔｕｂｕｌｉｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｌｉｇａｓｅ）、リポ酸転移酵素（Ｌｉｐｏｉｃ ａｃｉｄ ｌｉｇａｓｅ）、プロテインキナーゼ等を挙げることができる。
　第１の脂質膜修飾剤における疎水性鎖は、疎水性相互作用により生体物質に結合できるものである限り特に限定されないが、置換基を有していてもよい飽和又は不飽和の炭化水素鎖であることができる。かかる炭化水素鎖の例示としては、例えば、Ｃ7-30アルキル基（好ましくはＣ7-22アルキル基）、Ｃ6-14アリール基、Ｃ6-14アリールＣ7-30アルキル基（好ましくはＣ6-14アリールＣ7-22アルキル基）、及びＣ7-30アルキルＣ6-14アリール基（好ましくはＣ6-14アリールＣ7-22アルキル基）などが挙げられる。好ましくは、隣接する炭素原子が１～３個の不飽和結合によって連結されていてもよいＣ7-30アルキル基、隣接する炭素原子が１～３個の不飽和結合によって連結されていてもよいＣ7-22アルキル基、又は隣接する炭素原子が１～３個の不飽和結合によって連結されていてもよいＣ11-22アルキル基、又は隣接する炭素原子が１～３個の不飽和結合によって連結されていてもよいＣ16-18アルキル基であることができる。より好ましくは、疎水性鎖（ａ）は、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル（ステアリル）基、シス－９－ヘキサデセニル（パルミトレイル）基、シス－８－ヘプタデセニル基、トランス－８－ヘプタデセニル基、トランス－９－オクタデセニル（エライジル）基、シス－９－オクタデセニル（オレイル）基、シス，シス－９，１２－オクタデカジエニル（リノレニル）基、（９Ｅ，１２Ｅ，１５Ｅ）－オクタデカ－９，１２，１５－トリエニル（エライドリノレニル）基であることができる。特に、細胞膜を構成するリン脂質の一部であるオレイル基が好ましい。さらに、これらの疎水性鎖は、任意の置換基で置換されていてもよく、またＮ、Ｓ、Ｏ等のヘテロ原子を含んでもよい。
　本明細書において、「置換基を有していてもよい」と定義されている場合には、置換基の種類、置換位置、及び置換基の個数は特に限定されず、２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。これらの置換基にはさらに置換基が存在していてもよい。
　第１の脂質膜修飾剤における親水性鎖は、好ましくは、親水性ポリマーにより構成される。かかる親水性ポリマーとしては、ポリアルキレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリペプチド、ポリアクリルアミド、およびデキストラン等の多糖類、あるいはグリコール酸誘導体や乳酸誘導体、ｐ－ジオキサン誘導体の重合体や共重合体等を用いることができる。ポリアルキレングリコールとしては、好ましくは炭素数２～４のオキシアルキレン単位の重合体であり、その平均重合数が２～５００（好ましくは、４５～５００）の範囲であるものを用いることができる。当該親水性ポリマーは、生体適合性のポリマーであることが好ましく、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であることがより好ましい。ポリエチレングリコールとしては、平均分子量２０００以上のものが好ましい。なお、親水性鎖は、さらに任意の置換基を有していてもよい。
　好ましい態様では、第１の脂質膜修飾剤は、疎水性鎖と親水性鎖とを連結するリンカー部を有することができる。かかるリンカー部としては、例えば、アミド結合やエステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、カルバメート結合、チオカルバメート結合、トリアゾール結合、尿素結合等の共有結合を形成し得る官能基を用いることができる。また、かかる官能基を有するオリゴマーやポリマーのようなリンカー構造を用いることもできるし、分岐鎖を有するリンカーを用いることもできる。分岐型のリンカーとしては、ホスファチジル基；グリセロールなどの３価アルコール；ヒドロキシキノールなどのベンゼントリオールやベンゼントリカルボン酸；ベンゼントリアミン；４-アミノサリチル酸などの３つ以上の反応性官能基を有するベンゼン環を用いることもできる。
　好ましい態様では、第１の脂質膜修飾剤は、上記リンカー部から分岐する２本の疎水性鎖を有することができる。
　第１の脂質膜修飾剤は、疎水性鎖及び親水性鎖を有する基剤分子と、酵素とを反応させることにより合成することができる。すなわち、基剤分子における親水性鎖の側鎖又は末端に反応性官能基と、酵素のアミノ基を共有結合させることにより、親水性鎖と酵素とを連結させることができる。かかる反応性官能基としては、Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミジル（ＮＨＳ）基、マレイミジル基、スルホスクシンイミジル基、フタルイミジル基、イミダゾイル基、アクリロイル基、－ＣＯ２ＰｈＮＯ２(Ｐｈは、ｏ－、ｍ－、又はｐ－フェニレン基を示す)、又はニトロフェニル基などを挙げることができ、当業者であればその他の公知の活性エステル基を適宜用いることができる。
　疎水性鎖及び親水性鎖を有する基剤分子の具体例としては、以下の構造を有するポリエチレングリコール脂質（ＤＯＰＥ－ＰＥＧ）を挙げることができる。ただし、これに限定されるものではない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 （式中、Ｘは、上述の反応性官能基であり、ｎは、２より大きい自然数、好ましくは２～５００である）
　＜工程Ｂ＞
　上述のように、工程Ｂ）は、第２の生体物質と第２の脂質膜修飾剤とを接触させ、前記生体物質の表面にオリゴペプチド又はポリペプチドを修飾する工程である。工程Ｂ）で用いられる第２の脂質膜修飾剤は、疎水性鎖及び親水性鎖を有している点では第１の脂質膜修飾剤と同様であるが、親水性鎖の側鎖又は末端にオリゴペプチド又はポリペプチドが連結した構造を有する点で異なる。典型的には、オリゴペプチド又はポリペプチドは、親水性鎖の末端に連結されている。一方、疎水性鎖は、生体物質の脂質膜と疎水性相互作用により連結され、これにより、第２の生体物質の表面層にオリゴペプチド又はポリペプチドが修飾される。
　第２の脂質膜修飾剤に用いられるオリゴペプチド又はポリペプチドは、上記酵素の触媒作用によって、後述の標識剤と特異的に結合し得るペプチド配列を用いることができる。かかるオリゴペプチドとしては、例えば、酵素としてソルターゼＡを用いる場合には、オリゴグリシンであることが好ましく、典型的には配列「ＧＧＧＧＧ」又は「ＧＧＧＹＣ」含む。また、ポリペプチドとしては、標識剤がビオチンを含む場合には、ストレプトアビジンやアビジンなどのビオチン結合性タンパク質を用いることができる。
　第２の脂質膜修飾剤は、疎水性鎖及び親水性鎖を有する基剤分子と、オリゴペプチド又はポリペプチドとを反応させることにより合成することができる。すなわち、基剤分子における親水性鎖の側鎖又は末端に反応性官能基と、オリゴペプチド又はポリペプチドにおけるアミノ基を共有結合させることにより、親水性鎖と酵素とを連結させることができる。かかる基剤分子の構造や反応性官能基の例は、上述のとおりである。
　第２の脂質膜修飾剤における疎水性鎖や親水性鎖の種類等については上述のとおりである。好ましい態様において、第２の脂質膜修飾剤は、疎水性鎖と親水性鎖とを連結するリンカー部を有することができるが、かかるリンカーの種類等についても上述のとおりである。
＜工程Ｃ＞
　工程Ｃは、第１の生体物質と第２の生体物質を混合し、分子内に蛍光色素又は蛍光修飾部位を有する標識剤を添加する工程である。かかる標識剤は、第１の生体物質に修飾された酵素の存在化下において、第２の生体物質におけるオリゴペプチド又はポリペプチドと特異的に結合し得るペプチド配列（基質ペプチド）又は分子を含むものである。したがって、図１に示したように、当該標識剤を添加することによって、第１の生体物質と第２の生体物質が接触した場合には、酵素の触媒作用を介して、標識剤と第２の生体物質におけるオリゴペプチド又はポリペプチドとが特異的に結合することになる。
　後の工程Ｄ）において蛍光観測するために、標識剤には、分子内に蛍光色素が直接連結されていてもよいし、或いは、事後的に蛍光標識するための蛍光修飾部位を有していてもよい。後者の場合、一態様として、本発明の方法は、工程Ｄ）の前に、蛍光性を有する他の分子を添加して、蛍光修飾部位に結合させる工程をさらに含むことができる。
　標識剤に用いられる蛍光色素としては、当該技術分野において公知の発蛍光性の化合物を所望の発光波長等に応じて適宜用いることができる。例えば、ローダミン誘導体、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコビリタンパク質、希土類金属キレート、ダンシルクロライドなどを挙げることができる。より具体的な例としては、ＢＯＤＩＰＹ誘導体、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ誘導体、ＡＴＴＯ誘導体、ＤＹ誘導体などを挙げることができる。
　標識剤における蛍光修飾部位とは、蛍光性を有する他の分子と結合可能な部位を意味する。すなわち、標識剤が、第２の生体物質の表面上のオリゴペプチド又はポリペプチドに結合した後に、別途、蛍光性を有する試薬を添加して当該蛍光修飾部位に結合されることで、第２の生体物質の表面を事後的に蛍光標識することができる。かかる蛍光修飾部位としては、ペプチドタグ又はリガンド分子を用いることができる。ペプチドタグは、一般に、他の分子と選択的に結合するペプチド配列を含むものであり、例えば、Myc tagやFLAG tag、His tag、HA tag、V5 tag、V7 tag、VSV-G tag、Glu-Glu tag、CBP tag、S tagなどのエピトープタブや、SpyCatcher と結合するSpy tagなどを挙げることができる。リガンド分子としては、特定のペプチド配列に結合性を有する分子、代表的には、ビオチンや、Ｈａｌｏ－ｔａｇのリガンドであるクロロアルカン、Ｓｎａｐ－ｔａｇのリガンドであるベンジルグアニンなどを挙げることができる。一方、「蛍光性を有する他の分子」としては、これら蛍光修飾部位結合し得るペプチド配列等と、蛍光色素とを含む物質であって、例えば、蛍光色素が連結した結合タンパク質を挙げることができる。典型的な例としては、蛍光修飾部位と蛍光性を有する他の分子と組み合わせの典型例としては、ビオチンと蛍光標識化ストレプトアビジン；又は、タグ配列を含むペプチドと蛍光標識化抗体などを挙げることができる。
　好ましい態様では、標識剤は、上記ペプチド連結酵素に対する基質ペプチドと、これに連結した蛍光色素又は蛍光修飾部位とを含む。ここで、基質ペプチドは、ペプチド連結酵素の存在化下において第２の生体物質のオリゴペプチドと特異的に結合し得るペプチド配列を有するものを意味する。代表的な例において、第１の生体物質におけるペプチド連結酵素がソルターゼＡであり、第２の生体物質におけるオリゴペプチドがオリゴグリシンであり、標識剤における基質ペプチドがＬＰＸＴＧ配列を含む。当該基質ペプチドの配列において、「Ｘ」は、任意の１又は複数のアミノ酸残基であり、好ましくは、Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｎ、Ｑ、又はＫである。
　別の実施態様では、標識剤は、ペプチド修飾酵素の存在下において第２の生体物質のポリペプチドと結合し得るリガンド分子を含むことができる。かかるリガンド分子は、例えば、第２の生体物質に修飾されたポリペプチド（ビオチン結合タンパク質など）に対して、特異的に結合し得るビオチンであることが好ましい。その他、Ｈａｌｏ－ｔａｇのリガンドであるクロロアルカンやＳｎａｐ－ｔａｇのリガンドであるベンジルグアニンを挙げることができる。
＜工程Ｄ及びＥ＞
　工程Ｄ）は、図１に示すように、第１の生体物質の表面に修飾された酵素の作用によって、第２の生体物質の表面におけるオリゴペプチド又はポリペプチドと上記標識剤が結合することにより生じる蛍光発光、すなわち、第２の生体物質の表面における蛍光発光を観測する工程である。これにより、工程Ｅ）において、かかる蛍光発光の観測結果に基づき、第１の生体物質と第２の生体物質の間の接触の有無を検出することができる。
　工程Ｄ）における蛍光発光を観測は、典型的には、蛍光分光法における蛍光強度の変化や顕微鏡画像などの手段を用いて行うことができる。その他に、ラマン顕微鏡、走査プローブ顕微鏡、ゴーストイメージング、ホログラフィック顕微鏡、電子顕微鏡、非線形光学顕微鏡を用いて観測することができる。
　上述のように、第１の生体物質と第２の生体物質が接触した場合、上記酵素の作用により、周囲に存在する標識剤におけるペプチド配列が、第２の生体物質の表層におけるオリゴペプチドと特異的に結合する。したがって、工程Ｄにおける蛍光発光の観測結果、第２の生体物質の表面に蛍光発光が見られた場合には、第１及び第２の生体物質が接触したことを意味する。一方、第２の生体物質から蛍光発光が観測されない場合には、標識剤が第２の生体物質表層に連結されないことから、これらの細胞が接触しなかったことが分かる。これらの結果により、工程Ｅ）では、第１の生体物質と第２の生体物質の間の接触の有無を検出することができる。特に、生体物質として細胞を用いる場合には、細胞間の接触の有無を１細胞レベルで検出することができる。
　好ましい態様において、工程Ａ）又はＢ）の前に、第１及び第２の生体物質のいずれか一方を、標識剤の蛍光色素とは異なる色により蛍光染色することもできる。これによって、第１の生体物質における酵素と蛍光色素を有する標識剤が結合した中間体の状態の細胞を、蛍光標識された第２の細胞と明確に区別することができる点で有利である。場合によって、かかる蛍光染色は、工程Ａ）又はＢ）の後に行うこともできる。細胞等の生体物質を蛍光染色するための手段としては、当該技術分野において周知の手法を用いることができる。
　別の好ましい態様では、工程Ｃ）の後に、未反応の標識剤を除去する工程をさらに含むことができる。当該洗浄は、当該技術分野において公知の手法で行うことができ、例えば、第１及び第２生体物質を、細胞用の培地や生理食塩水、等張の緩衝液といった細胞等を傷害しない溶液で洗浄する操作を行うことができる。場合によっては、純水やその他の水溶液、有機溶媒などで洗浄する操作も行うことができる。
　本発明の方法における一連の工程は、任意の材質・形状を有する基材又は容器の中で行うことができる。例えば、かかる基材の形状は、基板状（プレート状又はフィルム状のもの、例えばスライドガラス、ディッシュ、マイクロプレート、マイクロアレイ用基板等）であっても、担体（例えばビーズなどの粒子状やコロイド状のもの）、繊維状構造物、管、容器（例えば試験管及びバイアル）であってもよい。基材の材質としては、ガラス；セメント；陶磁器等のセラミックスもしくはファインセラミックス；ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン及びポリメチルメタクリレートなどのポリマー樹脂；ポリペプチド及びタンパク質などの生体材料；シリコン；活性炭；多孔質ガラス；多孔質セラミックス；多孔質シリコン；多孔質活性炭；不織布；濾紙；メンブレンフィルター；金などの導電性材料、などが挙げられる。場合によって、基材の表面は、ポリ陽イオンなどのポリマーによる被覆処理、あるいは基材表面への導入置換基を有するシランカップリング剤による処理が施されていてもよいし、あるいはプラズマ処理により反応性官能基が導入されていてもよい。
２．本発明の脂質膜修飾剤
　別の側面において、本発明は、上述の検出方法に好適な生体物質の脂質膜修飾剤を提供するものである。かかる脂質膜修飾剤は、疎水性鎖及び親水性鎖を有し、前記親水性鎖の末端にペプチド連結酵素又はペプチド修飾酵素を結合した構造を有することを特徴とする。
　当該脂質膜修飾剤は、上記の第１の脂質膜修飾剤に相当するものであり、既に述べたように、疎水性鎖及び親水性鎖を有する基剤分子と、オリゴペプチド又はポリペプチドとを反応させることにより合成することができる。すなわち、基剤分子における親水性鎖の側鎖又は末端に反応性官能基と、ペプチド連結酵素又はペプチド修飾酵素におけるアミノ基を共有結合させることにより、親水性鎖と酵素とを連結させることができる。かかる基剤分子の構造や反応性官能基の例は、上述のとおりである。
　当該脂質膜修飾剤における疎水性鎖及び親水性鎖の種類等については上述のとおりである。好ましい態様において、本発明の脂質膜修飾剤は、疎水性鎖と親水性鎖とを連結するリンカー部を有することができるが、かかるリンカーの種類等についても上述のとおりである。
　以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
１．脂質膜修飾剤用基剤分子の合成
　以下の手順により、２本のオレイル基（疎水性鎖）を有するリン脂質（ＤＯＰＥ）とポリエチレングリコール（親水性鎖）を連結し、反応性官能基として末端にＮ－ヒドロキシ－スクシンイミジル（ＮＨＳ）基を導入したＰＥＧ脂質基剤分子（ＤＯＰＥ－ＰＥＧ－ＮＨＳ）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　５０ｍＬの二口ナスフラスコ（１）にSUNBRIGHT DE-050 GSを１８５ｍｇ (３７ μｍｏｌ, １ｅｑ)を加えて真空乾燥、Ａｒ置換を行い、乾燥ＤＣＭ １０ｍＬを加えて溶かした。別の１０ｍｌ二口ナスフラスコ（２）にCOATSOME ME-8181 を２４．７ ｍｇ (３３ μｍｏｌ, ０．９ｅｑ)を加えて真空乾燥、Ａｒ置換を行い、乾燥ＤＣＭ ３ｍＬを加えて溶かした。（２）の溶液を（１）のフラスコに氷冷下でゆっくり滴下した。その後、乾燥Ｅｔ３Ｎ ５０μＬ (３６０ μｍｏｌ, １０ｅｑ)を加え、室温で３日間撹拌。反応溶液を３５ｍＬジエチルエーテル×４に氷冷下で滴下し、遠心分離(-10℃, 8000Gで10分＋10000Gで10分)したのちデカンテーションで上清除去した。残った白色固体デシケーター中で真空乾燥した。
２．酵素（Ｓｏｒｔａｓｅ　Ａ）を連結した脂質膜修飾剤の合成
　１００ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．２)中で、ペプチド連結酵素ＳｒｔＡ（終濃度５０μＭ）と上記で合成した基剤ＤＯＰＥ－ＰＥＧ－ＮＨＳ（終濃度２５０μＭ）、Alexa Ｆｌｕｏｒ６４７ ＮＨＳエステル（AF647-NHS, 終濃度50μM）を混合し、１時間室温で静置することにより、ＳｒｔＡ表面のアミノ基とのアミドカップリング反応を介して、ＳｒｔＡにＰＥＧ脂質（ＰＥＧ－ＤＯＰＥ）と蛍光色素（ＡＦ６４７）を修飾した。反応は５０μＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８）でクエンチした。得られたＰＥＧ脂質修飾ＳｒｔＡ（ＳｒｔＡ－ＰＥＧ－ＤＯＰＥ）は、ＰＢＳ中での透析により精製した。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）におけるＳｒｔＡ由来のバンドの高分子量側へのシフトから、ＰＥＧ脂質の修飾を確認した（図２）。なお、蛍光色素（ＡＦ６４７）は、図２の修飾確認の目的で連結したものである。
　合成した脂質膜修飾剤によって細胞表面にＳｒｔＡが修飾されることを以下の測定により確認した。ヒト白血病細胞株Ｊｕｒｋａｔ細胞を培養後、遠心分離によってチューブの底に集めた後、ＰＢＳで2回洗浄した。この細胞ペレットを、上記で作製したＡＦ６４７標識ＳｒｔＡ－ＰＥＧ－ＤＯＰＥのＰＢＳ水溶液（終濃度５０μＭ）で懸濁し（細胞密度７．６×１０６個／ｍＬ）、１５分間室温で静置することにより、細胞膜にＳｒｔＡを導入した。遠心分離によってチューブの底に細胞を集めた後、ＳｒｔＡ－ＰＥＧ－ＤＯＰＥ水溶液を除去し、ＰＢＳで２回洗浄した。この細胞を再度ＰＢＳに懸濁し（細胞密度３．８×１０６個／ｍＬ）、ガラスボトムディッシュに播種後、共焦点レーザー顕微鏡（Leika社製ＳＰ８）でＡＦ６４７蛍光（光学スライス1μｍ）および明視野の顕微鏡画像（対物レンズ：63倍）を取得した。その結果、細胞表層からＳｒｔＡに標識したＡＦ６４７蛍光が観察され、細胞表層へのＳｒｔＡの導入が確認された（図３）。
３．オリゴペプチドを連結した脂質膜修飾剤の合成
　以下の手順により、以下の手順により、オリゴグリシンペプチドを導入したＰＥＧ脂質基剤分子（ＧＧＧ－ＤＯＰＥ－ＰＥＧ）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　Ｎ末端にトリグリシンを含むペプチド（ＧＧＧＹＣ）を固相合成後に精製し、マレイミド基を有する細胞表層修飾剤（ＤＯＰＥ－ＰＥＧ－Ｍａｌ）とＭＯＰＳ緩衝液（pH7.0）中で反応させ、ＰＥＧ脂質を修飾したトリグリシンペプチド（ＧＧＧ－ＰＥＧ－ＤＯＰＥ）を合成した。合成条件については、文献（Tomita et al., Biotechnol. Bioeng. 2013, 110, 2785-2789）と同様の条件を用いた。
４．標識剤の合成
　文献（Lan et al., FASEB J. 2014, 28, 3965-3974）の記載に従い、ＳｒｔＡ基質配列を含むペプチド（ＤＬＰＥＴＧＧ）のＮ末端にＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（ＡＦ４８８）を導入した蛍光標識剤（ＡＦ４８８－ＤＬＰＥＴＧＧ）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
５．細胞間接触の蛍光検出
　上記で合成した２～４で合成したＳｒｔＡを連結した脂質膜修飾剤、オリゴペプチドを連結した脂質膜修飾剤、及び蛍光標識剤を用いて、細胞間の接触を評価した。実験手順の概要を図４に示す。
　モデル細胞として、無染色のＪｕｒｋａｔ細胞と、細胞質に赤色蛍光染色（ＣｙｔｏＲｅｄ使用）を施したＪｕｒｋａｔ細胞とを用いて、細胞間接触を介した蛍光標識を行った。まず、３７℃、５％ ＣＯ２条件のインキュベーター内で、無染色のＪｕｒｋａｔ細胞にＡＦ６４７標識ＳｒｔＡ－ＰＥＧ－ＤＯＰＥ（終濃度７３μＭ）を１５分間作用させて、ＳｒｔＡを細胞表層に導入した。
　同様に、赤色染色のＪｕｒｋａｔ細胞にＧＧＧ－ＰＥＧ－ＤＯＰＥのＰＢＳ水溶液（終濃度６６μＭ）をインキュベーター内で１５分間作用させ、洗浄を行い、細胞表層にトリグリシンペプチドを導入した。
　ＳｒｔＡ導入Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＳｒｔＡ－Ｊｕｒｋａｔ）（２．４ｘ１０７個/ｍＬ）とトリグリシン導入Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＧＧＧ－Ｊｕｒｋａｔ）（２．４ｘ１０７個/ｍＬ）とをＰＢＳ中で混ぜ、細胞固定化剤（Biocompatible anchor for membrane: ＢＡＭ, 日油社製）修飾ガラスボトムディッシュに播種した。３０分間室温で静置し、播種した細胞をＢＡＭ修飾表面に固定化した。ＰＢＳを除いて、ＡＦ４８８－ＤＬＰＥＴＧＧ水溶液（終濃度４０μＭ, in SrtA reaction buffer: 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, pH 8.0）に置換し、室温で７０分間作用させて、細胞間でのペプチド連結反応を介した蛍光標識を行った。その後、ＡＦ４８８－ＤＬＰＥＴＧＧ水溶液を除いて、ＰＢＳに置換し、共焦点レーザー顕微鏡で蛍光の観察を行った。比較のため、以下のＡ～Ｅの条件において同様の測定を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　その結果、条件Ｂにおいて、ＧＧＧ－Ｊｕｒｋａｔ細胞の細胞表層に緑色蛍光が観察された（図５Ｂ）。
一方、対照実験として、ＳｒｔＡを導入しなかった条件Ｃ（図５Ｃ）やオリゴグリシンを導入しなかった条件Ｄ（図５Ｄ）、蛍光標識剤を作用させなかった条件Ｅ（図５Ｅ）は、いずれの場合も、未処理の場合の条件Ａ（図５Ａ）と同様にＧＧＧ－Ｊｕｒｋａｔ細胞の表層から緑色蛍光は観察されなかった。
　これらの結果から、条件ＢにおいてＧＧＧ－Ｊｕｒｋａｔ細胞の表層に観察された緑色蛍光は、ＳｒｔＡ－Ｊｕｒｋａｔ細胞表層のＳｒｔＡによって蛍光標識剤が連結されたことにより蛍光であるといえる。また、当該緑色蛍光は、ＧＧＧ－Ｊｕｒｋａｔ細胞の細胞膜全体から観察されていることから、蛍光標識されたＧＧＧ－ＰＥＧ－ＤＯＰＥは、細胞膜全体に拡散することも示唆された。
　さらに、図５Ｂの画像から、細胞表層が青色のＳｒｔＡ－Ｊｕｒｋａｔ細胞と接しているＧＧＧ－Ｊｕｒｋａｔ細胞でのみ、細胞表層から緑色蛍光が観察された。これらの結果より、ＳｒｔＡ－Ｊｕｒｋａｔ細胞上の分子と接触できる距離まで近接したＧＧＧ－Ｊｕｒｋａｔ細胞のみが蛍光標識されたことが実証された。
６．細胞ペアアレイ上における細胞間相互作用の可視化
　光活性化細胞固定化剤を底面に修飾したマイクロ流路を用いて１細胞レベルで用いて細胞間の接触を観測した（図６）。具体的には、コラーゲンを底面に被覆したマイクロ流路に光活性化細胞固定化剤の溶液（終濃度100μＭ、５０％ ＤＭＳＯを含むＰＢＳ）を注入し、３７℃で3時間静置して、流路底面に光活性化細胞固定化剤を修飾した。この流路底面に、マスクレス露光装置を用いて直径約１０～１５μｍの光（波長：３６０ｎｍ）のスポットを１００μｍ間隔で碁盤目状（縦５×横１０スポットを１ブロックとして、５０ブロック）に照射した。流路内に上記ＳｒｔＡ－Ｊｕｒｋａｔ細胞の懸濁液を注入し、室温で１０分間静置後、ＰＢＳを流して固定化されなかった細胞を洗い流し、光照射スポット上にのみ細胞を配置した。次に同様の方法で、固定化したＳｒｔＡ－Ｊｕｒｋａｔ細胞の横に隣接するように光のスポットを照射し、上記ＧＧＧ－Ｊｕｒｋａｔ細胞の懸濁液を注入した。室温で１０分間静置後、ＰＢＳを流して、固定化されなかった細胞を洗い流し、ＳｒｔＡ－Ｊｕｒｋａｔ細胞の横にのみＧＧＧ－Ｊｕｒｋａｔ細胞を配置した。この流路に、上記５．と全く同じ条件でＡＦ４８８－ＤＬＰＥＴＧＧ水溶液を注入し、１時間後にＰＢＳを流して、未反応のＡＦ４８８－ＤＬＰＥＴＧＧを洗い流した。その後、共焦点レーザー顕微鏡で蛍光の観察を行った。
７．細胞間相互作用の定量解析
　次いで、フローサイトメトリー（蛍光標識細胞の識別技術）による細胞間相互作用の定量解析を行った。図７（Ａ）に当該定量解析の概念図を示す。
　具体的な実験手順は以下のとおりである。ＳｒｔＡ－Ｊｕｒｋａｔ及びＧＧＧ－Ｊｕｒｋａｔの懸濁液 (ＰＢＳ中、それぞれ６×１０７個/ｍｌ) は、上記と同様に調製した。 ただし、この実験では、ＧＧＧ－Ｊｕｒｋａｔは赤く染色しなかった。これらの細胞をマイクロチューブ内で混合した。遠心分離後、上清をＡＦ４８８－ＤＬＰＥＴＧＧ水溶液（終濃度４０μＭ, in ＳｒｔＡ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ: ５０ｍＭ Tris, １５０ｍＭ ＮａＣｌ, ５ｍＭ ＣａＣｌ２, ｐＨ８.０）に置換し、室温で１時間静置した。遠心分離し、ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞混合物をフローサイトメーター (Guava easyCyte 8、Luminex Japan Co. Ltd.社製) で分析した。対照実験として、ＡＦ６４７標識ＳｒｔＡ－ＰＥＧ－ＤＯＰＥ、ＧＧＧ－ＰＥＧ－ＤＯＰＥ、および/または、ＡＦ４８８－ＤＬＰＥＴＧＧをそれぞれ使用せずに同様の実験を行った。接触細胞の定量化のために、FlowJoソフトウェア（Treestar Inc社製）を使用して、ＡＦ４８８蛍光陽性細胞をＡＦ６４７蛍光陰性細胞画分からカウントした。ＡＦ４８８蛍光陽性の閾値は、ＧＧＧ－ＰＥＧ－ＤＯＰＥを使用しない対照実験の陽性率を5%に設定するように決定した。
　得られた結果を図７（Ｂ）及び（Ｃ）に示す。図７（Ｂ）は、本発明の光活性化細胞固定化剤で標識した細胞サンプルの蛍光ヒストグラム（右）と同様に測定したGGG-PEG-DOPE無しの場合のヒストグラム（比較例：中央）、GGG-PEG-DOPEおよびAF488-LPETGG無しの場合のヒストグラム（比較例：左）である。図７（Ｃ）は、ＳｒｔＡ－Ｊｕｒｋａｔの代わりに未修飾のＪｕｒｋａｔを用い、ＰＥＧ－ＤＯＰＥを修飾していないＳｒｔＡを作用させた場合のヒストグラムである。
　図７（Ｂ）に示したGGG-PEG-DOPE無しの比較実験（中央）の結果より、この手法では、AF488-LPETGGの細胞への非特異的吸着によるバックグランド蛍光が、５％であることが分かった。その分を差し引くと、本発明の技術で標識したサンプルの結果（右）から、今回の条件（細胞を1対1でまぜて1時間静置）では、１４％（１９％－５％＝１４％）の細胞が相互作用したことが分かった。
　なお、図７（Ｃ）に示した比較実験では、全てのＧＧＧ－Ｊｕｒｋａｔが遊離のＳｒｔＡによって標識されるため、５０％の細胞が蛍光陽性であると考えられるところ、実際に、解析結果は５６％－５％＝５１％となり、今回のフローサイトメトリによる解析方法が妥当に機能していることが確認された。

Claims (25)

  1. 　脂質膜を有する複数の生体物質間の接触を検出する方法であって、
    Ａ）第１の生体物質と第１の脂質膜修飾剤とを接触させ、前記生体物質の表面に酵素を修飾する工程；
    Ｂ）第２の生体物質と第２の脂質膜修飾剤とを接触させ、前記第２の生体物質の表面にオリゴペプチド又はポリペプチドを修飾する工程；
    Ｃ）前記第１の生体物質及び前記第２の生体物質を混合し、分子内に蛍光色素又は蛍光修飾部位を有する標識剤を添加する工程；
    Ｄ）前記酵素の作用によって前記オリゴペプチド又はポリペプチドと前記標識剤が結合することにより生じる、前記第２の生体物質の表面における蛍光発光を観測する工程；及び
    Ｅ）前記蛍光発光の観測結果に基づき、前記第１の生体物質と前記第２の生体物質の間の接触の有無を検出する工程
    を含み、
    　前記第１の脂質膜修飾剤は、疎水性鎖及び親水性鎖を有し、前記親水性鎖の側鎖又は末端に前記酵素が連結した構造を有しており；
    　前記第２の脂質膜修飾剤は、疎水性鎖及び親水性鎖を有し、前記親水性鎖の側鎖又は末端に前記オリゴペプチド又はポリペプチドが連結した構造を有しており； 
    　前記標識剤は、前記酵素の存在化下において前記オリゴペプチド又はポリペプチドと特異的に結合し得るペプチド配列又は分子を含み：及び
    　前記蛍光修飾部位は、蛍光性を有する他の分子と結合可能な部位である、
    該方法。
  2. 　前記第１及び／又は第２の細胞表層修飾剤における親水性鎖が、ポリアルキレングリコールを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記第１及び／又は第２の脂質膜修飾剤における疎水性鎖が、置換基を有していてもよい飽和又は不飽和の炭化水素鎖である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記第１及び／又は第２の脂質膜修飾剤が、前記疎水性鎖と前記親水性鎖とを連結するリンカー部を有する、請求項１～３のいずれか１に記載の方法。
  5. 　前記第１及び／又は第２の脂質膜修飾剤が、前記リンカー部から分岐する２本の疎水性鎖を有する、請求項４に記載の方法。
  6. 　前記酵素が、ペプチド連結酵素又はペプチド修飾酵素である、請求項１～５のいずれか１に記載の方法。
  7. 　前記標識剤が、前記ペプチド連結酵素に対する基質ペプチドと、これに連結した前記蛍光色素又は蛍光修飾部位とを含み、前記基質ペプチドは、前記ペプチド連結酵素の存在化下において前記オリゴペプチドと特異的に結合し得るペプチド配列を有するものである、請求項６に記載の方法。
  8. 　前記ペプチド連結酵素が、ソルターゼＡ（Ｓｏｒｔａｓｅ Ａ）又はトランスグルタミナーゼである、請求項６に記載の方法。
  9. 　前記オリゴペプチドが、オリゴグリシンを含む、請求項１～８のいずれか１に記載の方法。
  10. 　前記標識剤が、前記ペプチド修飾酵素の存在下において前記ポリペプチドと結合し得るリガンド分子を含む、請求項６に記載の方法。
  11. 　前記工程Ｄ）の前に、前記蛍光性を有する他の分子を添加して、前記蛍光修飾部位に結合させる工程をさらに含む、請求項１～１０のいずれか１に記載の方法。
  12. 　前記蛍光修飾部位が、ペプチドタグ又はリガンド分子である、請求項１～１１のいずれか１に記載の方法。
  13. 　前記蛍光性を有する他の分子が、蛍光色素が連結した結合タンパク質である、請求項１～１２のいずれか１に記載の方法。
  14. 　前記工程Ａ）又はＢ）の前又は後に、第１及び第２の生体物質のいずれか一方を蛍光染色することを含む、請求項１～１３のいずれか１に記載の方法。
  15. 　前記工程Ｃ）の後に、未反応の標識剤を除去する工程をさらに含む、請求項１～１４のいずれか１に記載の方法。
  16. 　前記生体物質が、細胞、細胞小器官、小胞、ウイルス、リポソーム、及びミセルからなる群から選択される、請求項１～１５のいずれか１に記載の方法。
  17. 　第１の生体物質及び前記第２の生体物質のいずか一方が、免疫細胞である、請求項１～１６のいずれか１に記載の方法。
  18. 　疎水性鎖及び親水性鎖を有し、前記親水性鎖の末端にペプチド連結酵素又はペプチド修飾酵素を結合した構造を有する生体物質の脂質膜修飾剤。
  19. 　前記親水性鎖が、ポリアルキレングリコールを含む、請求項１８に記載の脂質膜修飾剤。
  20. 　前記疎水性鎖が、置換基を有していてもよい飽和又は不飽和の炭化水素鎖である、請求項１８又は１９に記載の脂質膜修飾剤。
  21. 　前記疎水性鎖と前記親水性鎖とを連結するリンカー部を有する、請求項１８～２０のいずれか１に記載の脂質膜修飾剤。
  22. 　前記リンカー部から分岐する２本の疎水性鎖を有する、請求項２１に記載の脂質膜修飾剤。
  23. 　前記ペプチド連結酵素が、ソルターゼＡ（Ｓｏｒｔａｓｅ Ａ）又はトランスグルタミナーゼである、請求項１８～２２のいずれか１に記載の脂質膜修飾剤。
  24. 　脂質膜を有する複数の生体物質間の接触を検出するために用いられる、請求項１８～２３のいずれか１に記載の脂質膜修飾剤。
  25. 　前記生体物質が、細胞、細胞小器官、小胞、ウイルス、リポソーム、及びミセルからなる群から選択される、請求項１８～２４のいずれか１に記載の脂質膜修飾剤。
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