CN105051197A

CN105051197A - 保卫细胞表达盒组成及其使用方法

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Publication number: CN105051197A
Application number: CN201480015558.5A
Authority: CN
Inventors: M·努奇奥
Original assignee: Syngenta Participations AG
Current assignee: Syngenta Participations AG
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-06
Publication date: 2015-11-11
Also published as: BR112015023101A2; EP2971002A4; WO2014149826A1; EP2971002A1; US20160032301A1; CA2903206A1; PH12015501943A1; AR095230A1; RU2015144106A; MX2015012811A

Abstract

本发明针对赋予保卫细胞调节的表达的人工转录调节多核苷酸及其使用方法。本发明进一步提供了使用这些转录调节多核苷酸的方法和包含这些转录调节多核苷酸的植物及其植物部分。在农业生物技术中,植物可以根据需要来修饰。用来实现这一点的一个方式是通过使用现代基因工程技术。例如，通过将感兴趣的基因引入植物，植物可以被特异性地修饰为表达希望的表型性状。

Description

保卫细胞表达盒组成及其使用方法

发明领域

本发明涉及植物功能基因组学、分子生物学、基因工程和植物中基因表达的选择性调节的领域。具体地，本发明描述了能够赋予保卫细胞可调型表达的人工转录调节多核苷酸。

关于序列表的电子提交的声明

作为纸质副本的替代提供了一个ASCII文本格式的序列表，该序列表在37C.F.R.§1,821下提交，名称为73701-WO-REG-ORG-P-1_Sequence_Listing_ST25.txt，大小为55.1KB字节，生成于2014年2月18日并且经由EFS-Web提交。这个序列表在此通过引用以其披露内容结合到本说明书中。

发明背景

在农业生物技术中，可以根据人们的需要修饰植物。用来实现这一点的一个方式是通过使用现代基因工程技术。例如，通过将感兴趣的基因引入植物，植物可以被特异性地修饰为表达希望的表型性状。为此，最通常是用包括启动子区、编码区和终止区的异源基因来转化植物。当对异源基因进行基因工程化以用于在植物中表达时，启动子的选择通常是一个因素。虽然会希望组成性地表达某些基因，即贯穿植物终生并且在多数组织和器官中，但是更希望其他基因仅响应具体刺激才表达或限于特定细胞或组织。

已经示出，某些启动子能够以高于其他的速率指导RNA合成。这些被称为“强启动子”。已经示出，某些其他启动子仅在具体类型的细胞或组织中以更高水平指导RNA合成，并且通常称为“组织特异性启动子”，或如果启动子在某些组织中优先指导RNA合成(在其他组织中，会以降低的水平发生RNA合成)，则称为“组织优先启动子”。因为使用启动子控制引入植物、植物组织或植物细胞的感兴趣核酸的表达模式，所以在分离能够在特定组织类型或特定植物发育阶段以某些水平控制感兴趣核酸的表达的新颖启动子方面，存在持续的兴趣。

在植物叶子的表皮中的气孔使得能够控制植物水损失和气体交换，包括二氧化碳从大气进入植物的流入。吸取二氧化碳以用于光合固碳，并且水是通过蒸腾作用的过程通过气孔损失。每一个气孔由专门的一对保卫细胞组成，保卫细胞可以通过调节细胞膨压来控制气孔的大小。植物的水分利用效率是植物生物技术应用和农业的重要方面。水分利用效率限定了植物可以平衡通过气孔的水损失与用于光合作用导致生物质积累的进入叶子中的净CO₂摄取的良好程度。若干生物的和非生物的因子影响气孔孔径，由此调节给定条件下的植物的水利用。例如，CO₂的浓度调节气孔孔径，其中高水平的CO₂减小气孔孔径，并且低水平的CO₂增大气孔孔径。因此，对于CO₂流入植物和植物蒸腾作用，外部大气CO₂发挥了一些控制作用。

本领域中保卫细胞特异性的或保卫细胞优先的启动子的数目是非常有限的(EP-A11111051；普勒施(Plesch)2001)。有利的是具有多种不同启动子的选择，这样使得针对具体基因、构建体、细胞、组织、植物或环境可以选择最适合的启动子。此外，在用多个植物转录单位转化植物方面的与日俱增的兴趣和与出于这些目的使用常用调节序列关联的潜在问题值得使多种启动子序列可用。在保卫细胞中能够控制异源基因的特异性表达的调节元件会在植物生物技术和农业方面具有显著用途。例如，可以表达基因来更紧密地调节气孔的孔径，以便改进植物中的水利用。

发明概述

本发明提供了用于在植物保卫细胞中调节基因表达的组合物和方法。因此，在一个方面，本发明提供了一个重组多核苷酸，该多核苷酸包括、或基本上由以下项组成、或由以下项组成：选自下组的一个核酸，该组由以下项组成：(a)SEQIDNO:1的核酸；以及(b)与(a)的核酸至少95％一致的一个核酸。可替代地，本发明提供了一种重组多核苷酸，该多核苷酸包括一种以下核酸，该核酸与SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28的全长上具有至少90％一致性。此外，本发明提供了一种重组多核苷酸，该多核苷酸包括一种选自下组的核酸，该组由以下各项组成：SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27和SEQIDNO:28。

在一些方面，本发明的重组多核苷酸(例如SEQIDNO:1)可以被可操作地连接至至少一个感兴趣的多核苷酸。在其他方面，本发明的重组多核苷酸(例如SEQIDNO:1)可以被可操作地连接至至少一个内含子。仍在其他方面，本发明的重组多核苷酸可以被可操作地连接至至少一个内含子和至少一个外显子。仍在另外的方面，可操作地连接至至少一个内含子或连接至至少一个内含子和至少一个外显子的本发明的重组多核苷酸可以被任选地进一步可操作地连接至至少一个增强子，例如TMVΩ翻译增强子和/或Kozak序列。在其他方面，可操作地连接至至少一个内含子或连接至至少一个内含子和至少一个外显子，并且任选地进一步连接至TMVΩ翻译增强子和/或Kozak序列的本发明的重组多核苷酸可以被进一步可操作地连接至至少一个感兴趣的多核苷酸。

在一个另外的方面，本发明提供了一种表达盒，该表达盒包括、或基本上由以下项组成、或由以下项组成：本发明的一种重组多核苷酸。在一个另外的方面，本发明的表达盒可以包括、或基本上由以下项组成、或由以下项组成：可操作地连接至至少一个感兴趣的多核苷酸的本发明的重组多核苷酸。仍在其他方面，本发明提供了一种表达盒，该表达盒包括、或基本上由以下项组成、或由以下项组成：可操作地连接至至少一个内含子或连接至至少一个内含子和至少一个外显子的本发明的重组多核苷酸。仍在另外的方面，本发明提供了一种表达盒，该表达盒包括、或基本上由以下项组成、或由以下项组成：可操作地连接至至少一个内含子或连接至至少一个内含子和至少一个外显子的本发明的重组多核苷酸，该重组多核苷酸可以被任选地进一步可操作地连接至一个或多个增强子。任选地，该增强子可以是TMVΩ翻译增强子和/或Kozak序列。在其他方面，本发明提供了一种表达盒，该表达盒包括、或基本上由以下项组成、或由以下项组成：可操作地连接至至少一个内含子或连接至至少一个内含子和至少一个外显子，并且任选地进一步可操作地连接至被进一步可操作地连接至至少一个感兴趣多核苷酸的TMVΩ翻译增强子和/或Kozak序列的本发明的重组多核苷酸。感兴趣的多核苷酸包括一种脱落酸受体或一种修饰的脱落酸受体。

在一个另外的方面，本发明提供了一种表达盒，该表达盒包括与SEQIDNO:1的核酸至少约95％一致的重组多核苷酸。本发明还提供了一种表达盒，该表达盒包括与SEQIDNO:1；SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28的核酸至少约90％一致的重组多核苷酸。

仍在一个另外的方面，本发明提供了细胞、植物或植物部分，该细胞、植物或植物部分包括、或基本上由以下项组成、或由以下项组成：本发明的重组多核苷酸或本发明的表达盒。

在一个另外的方面，本发明提供了一种在植物的保卫细胞中表达感兴趣的多核苷酸的方法，该方法包括将本发明的一种重组多核苷酸和/或本发明的一种表达盒引入植物细胞，使植物细胞再生为用本发明的所述重组多核苷酸和/或所述表达盒稳定地转化的植物，其中在所述稳定地转化的植物的保卫细胞中表达感兴趣的多核苷酸。

在一个另外的方面，提供了一种调节保卫细胞功能(气孔打开和关闭)的方法，该方法包括将本发明的一种重组多核苷酸和/或本发明的一种表达盒引入植物细胞，使植物细胞再生为用本发明的所述重组多核苷酸和/或所述表达盒稳定地转化的植物，由此调节稳定地转化的植物的保卫细胞的功能。

本发明的一个另外的方面提供了改进植物对水分亏缺的反应和植物水分利用效率的一种方法，该方法包括将本发明的重组多核苷酸和/或本发明的表达盒引入植物细胞，使植物细胞再生为用本发明的所述重组多核苷酸和/或所述表达盒稳定地转化的植物，由此在稳定地转化的植物中改进对水分亏缺的反应和水分利用效率。

在一些方面，本发明提供了一种调节光同化率的方法，该方法包括将本发明的重组多核苷酸和/或本发明的表达盒引入植物细胞，使植物细胞再生为用本发明的所述重组多核苷酸和/或所述表达盒稳定地转化的植物，由此在稳定地转化的植物中调节光同化作用速率。

在一个另外的方面，提供了一种调节植物蒸腾作用速率的方法，该方法包括将本发明的重组多核苷酸和/或本发明的表达盒引入植物细胞，使植物细胞再生为用本发明的所述重组多核苷酸和/或所述表达盒稳定地转化的植物，由此在稳定地转化的植物中调节蒸腾作用速率。

在其他方面，提供了一种产生具有调节的保卫细胞功能的植物的方法，该方法包括将本发明的重组多核苷酸和/或本发明的表达盒引入植物细胞，使植物细胞再生为用本发明的所述重组多核苷酸和/或所述表达盒稳定地转化的植物和/或植物部分，由此产生具有经调节的保卫细胞功能的稳定地转化的植物。

另外提供的是包含本发明的重组多核苷酸和/或本发明的表达盒的植物、植物部分、植物细胞连同由它们产生的作物和产品。在一些具体方面，本发明提供了从本发明的植物产生的种子和子代植物。

现在，就在此所述的其他实施例例而言，将更详细地说明本发明的上述以及其他方面。应当理解的是，本发明可以体现为不同的形式，并且不应当被解释为对在此提出的实施例的限制。更确切地说，提出这些实施例以使得本披露将是彻底的和完整的，并将向本领域的普通技术人员充分传达本发明的范围。

详细说明

本说明不旨在是一个本发明以其而实施的所有不同方式，或可以加入本发明中的所有特征的详细目录。例如，关于一个实施例所说明的特征可以结合入其他实施例中，并且关于一个具体实施例所说明的特征可以从那个实施例删除。因此，本发明考虑了，在本发明的一些实施例中，可以排除或省略在此陈述的任何特征或特征的组合。另外，鉴于本披露内容，对在此建议的不同实施例的众多变体以及附加对于本领域技术人员是明显的，这不脱离本发明。因此，以下说明旨在阐述本发明的一些具体实施例，并且并没有穷尽地叙述其所有排列、组合和变化。

除非另外定义，在此所使用的全部技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的意思。在此的本发明的说明中使用的术语仅仅是出于描述具体实施例的目的并且不旨在限制本发明。

在此引用的所有的公开、专利申请、专利以及其他参考文件对于引用中提及的有关句子和/或段落的传授内容通过引用以其全文结合在此。在此采用的技术的参考文献旨在参考本领域中通常理解的技术，包括对本领域的普通技术人员而言很清楚的那些技术的变化或等效技术的替换。

除非上下文另外表明，明确地预期的是在此所述的本发明的不同特征可以按任何组合使用。而且，本发明还考虑到在本发明的一些实施例中，在此提出的任何特征或特征的组合可以被排除或省略。举例说明，如果该说明书陈述包含组分A、B和C的组合物，它明确地预期A、B或C的任何一种或其组合可单一地或以任何组合被省略和放弃。

如在本发明的说明书和所附的权利要求中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”旨在也包括复数形式，除非上下文清楚地另外表明。

如在此使用，“和/或”是指并且涵盖一个或多个相关的列出项的任何及全部可能组合，连同当以可替代性(“或”)解释时组合的缺少。

如在此使用，术语“约”当是指一个可测量的值例如剂量或时间段等时意在涵盖±20％、±10％、±5％、±1％、±0.5％、或甚至±0.1％的指定量的变化。

如在此使用，短语例如“在X和Y之间”与“在约X和Y之间”应解释为包括X和Y。如在此使用，短语例如“在约X和Y之间”是指“在约X和约Y”之间，并且短语例如“从约X至Y”是指“从约X至约Y”。

如此处使用，术语“包括(comprise、comprises和comprising)”指示所说明的特征、整数、步骤、操作、要素、和/或组分的存在，但并不排除一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、要素、组分、和/或其组的存在或添加。

如在此使用的，过渡短语“基本上由……组成”是指一项权利要求的范围将被解释为包括该权利要求中所提到的指定材料或步骤以及不实质上影响要求保护的发明的一个或多个基本特征和新特征的那些材料或步骤。因此，当用于本发明的权利要求中时，术语“基本上由……组成”并不意在被解释为等同于“包括(comprising)”。

本发明提供了用于改变植物保卫细胞中基因表达的组合物和方法，由此提供了以下能力，例如操控水和/或二氧化碳(CO₂)通过植物气孔的交换(例如改变净CO₂摄入和水分利用效率和/或CO₂传感基因(例如通过引用合并在此的WO08134571中描述的基因)的活性)和调节光合同化作用的速率和/或通过蒸腾作用过程的水损失。

本发明针对对于在保卫细胞优先的或保卫细胞特异性的模式中表达感兴趣核酸(例如蒸腾作用调节多核苷酸)有用的重组多核苷酸和核酸构建体(例如表达盒)。因此，本发明的核酸构建体(例如表达盒)包括调节由SEQIDNO:1的核酸编码的多核苷酸的至少一个人工转录。

因此，在一个实施例中，本发明提供了一种重组多核苷酸，该多核苷酸包括、或基本上由以下项组成、或由以下项组成：选自下组的核酸，该组由以下项组成：(a)SEQIDNO:1的核酸；(b)与(a)的核酸至少约95％一致的核酸；(c)由于遗传密码的简并性，不同于(a)或(b)的核酸的核酸；以及(d)(a)、(b)和(c)的任何组合。

在另一实施例中，本发明提供了一种重组多核苷酸，该重组多核苷酸包括、或基本上由以下项组成、或由以下项组成：选自下组的核酸，该组由以下项组成：(a)SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28以及它们的任何组合的核酸；(b)与(a)的核酸至少约75％一致的核酸；(c)由于遗传密码的简并性，不同于(a)或(b)的核酸的核酸；以及(d)(a)、(b)和(c)的任何组合。在SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27和SEQIDNO:28中鉴别的重组多核苷酸包含SEQIDNO:1。SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27和SEQIDNO:28提供了与不同的其他核酸元件组合的SEQIDNO:1，这些元件包括但不限于内含子、外显子、以及翻译增强子。

因此，在一些实施例中，本发明的核酸可以是具有与SEQIDNO:1、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28或它们的任何组合的核酸的实质一致性(例如至少约70％至约100％一致性)的核酸。因此，在一些实施例中，与SEQIDNO:1、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28的核酸实质上一致的本发明的核酸具有与对应的核酸(例如SEQIDNO:1或SEQIDNO:10-28)至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、等、或其中任何范围的一致性。在具体实施例中，本发明的核酸具有与SEQIDNO:1或SEQIDNO:10-28的核酸至少约80％的一致性，与SEQIDNO:1或SEQIDNO:10-28的核酸至少约85％的一致性，与SEQIDNO:1或SEQIDNO:10-28的核酸至少约90％的一致性，与SEQIDNO:1或SEQIDNO:10-28的核酸至少约95％的一致性。

在本发明的一些实施例中，重组多核苷酸可以被可操作地连接至感兴趣的一个多核苷酸。在其他实施例中，重组多核苷酸可以被包括在一个表达盒中。在另外的实施例中，当可操作地连接至感兴趣的一个多核苷酸时，本发明的重组多核苷酸可以赋予所述感兴趣的多核苷酸在用所述重组多核苷酸或包括所述重组多核苷酸的所述表达盒转化的植物或植物部分的保卫细胞中的特异性的或优先的表达。该感兴趣的多核苷酸可以包括提供了除草剂抗性、真菌抗性、昆虫抗性、疾病抗性、线虫抗性、雄性不育、非生物胁迫抗性的或改变了油谱、脂肪酸谱、氨基酸谱或种子的其他营养质量的转基因。特别感兴趣的是涉及非生物胁迫抗性的转基因。例如，脱落酸(ABA)反应通路涉及的转基因，例如ABA受体、PP2C或SnRK1是可能感兴趣的转基因。可以将ABA受体修饰为组成性活性的或修饰为识别除了ABA的分子。请参见WO2010/093954；WO2011/139798(修饰的ABA受体)；WO2013006263(组成性活性的ABA受体)，所有这些都通过引用结合在此。

如将被本领域普通技术人员很好地理解的，包括SEQIDNO:1的核酸的表达盒可以进一步包括Kozak序列连同对于构建表达盒有用的其他核苷酸序列，包括但不限于限制性内切核酸酶识别位点。Kozak序列和限制性内切核酸酶位点这二者都是本领域熟知的(参见例如科扎克(M.Kozak，《核酸研究》(NucleicAcidsRes.)15(20):8125-8148(1987)；中川(Nakagawa)等人《核酸研究》(NucleicAcidsRes.)36(3):861-871(2008)；萨姆布鲁克(Sambrook)(《分子克隆实验指南》(MolecularCloning:ALaboratoryManual)(第二版，冷泉港实验室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress)，普莱恩维尤(Plainview)，纽约(1989))。因此，在一个实施例中，本发明的表达盒可以包括在3’端可操作地连接至Kozak序列的SEQIDNO:1的核酸。在另一实施例中，包括SEQIDNO:1的核酸的本发明的表达盒可以进一步包括在所述表达盒的5’和/或3’端的一个限制性内切核酸酶识别位点。在另外的实施例中，包括在3’端可操作地连接至Kozak序列的SEQIDNO:1的核酸的本发明的表达盒可以进一步包括在5’和/或3’端连接至该表达盒的一个限制性内切核酸酶识别位点。

因此，在本发明的代表性实施例中，一个表达盒可以包括SEQIDNO:26的核酸，该核酸按以下顺序：5’至3’，包括SEQIDNO:1的核酸和Kozak序列。

在本发明的另外的实施例中，本发明的表达盒可以包括在3’端可操作地连接至一个内含子的SEQIDNO:1的核酸。可以使用可用于本发明的任何内含子，包括但不限于来自任何保卫细胞基因和/或任何泛素基因的内含子。仍在其他实施例中，可用于本发明的内含子可以是如在玉蜀黍基因组数据库(maizegdb.org)中鉴别的内含子，包括但不限于GRMZM2G061447、GRMZM2G019200、GRMZM2G098237、GRMZM2G120596和/或GRMZM2G132854。在一些代表性实施例中，该内含子可以由SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、和/或SEQIDNO:8的核酸编码。在一个具体实施例中，该内含子可以由SEQIDNO:2的核酸编码。在另外的实施例中，该内含子可以由SEQIDNO:3的核酸编码。在一些实施例中，包括在3’端可操作地连接至一个内含子的SEQIDNO:1的核酸的一个表达盒可以进一步任选地包括可操作地连接至所述内含子的3’端的一个Kozak序列。

因此，在一些具体实施例中，包括SEQIDNO:1的核酸的一个表达盒可以包括任选地连接至SEQIDNO:1的核酸的3’端的SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、和/或SEQIDNO:8的核酸。如将被本领域普通技术人员很好地理解的，包括可操作地连接至SEQIDNO:1的核酸的3’端的SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、和/或SEQIDNO:8的核酸的一个表达盒可以进一步包括可操作地连接至SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、和/或SEQIDNO:8的核酸的3’端的一个Kozak序列。

仍在另外的实施例中，本发明的一个表达盒可以包括在3’端可操作地连接至一个内含子的SEQIDNO:1的核酸，其中该内含子进一步在3’端可操作地连接至一个外显子或其一部分。该外显子或其一部分可以是可用于本发明的任何外显子或其一部分。在代表性实施例中，可操作地连接至该内含子的外显子或其一部分可以是由SEQIDNO:9的核酸编码。

如本领域普通技术人员将理解的，包括在本发明的表达盒中的外显子或其一部分可以被进一步在3’端任选地连接至一个Kozak序列。因此在一些实施例中，包括在3’端可操作地连接至一个内含子(该内含子可以在3’端可操作地连接至一个外显子或其一部分)的SEQIDNO:1的核酸的一个表达盒可以进一步任选地包括可操作地连接至该外显子的3’端的一个Kozak序列。因此，在一个代表性实施例中，本发明的一个表达盒包括SEQIDNO:25和/或SEQIDNO:27的核酸。

在一些具体实施例中，包括在一个内含子的3’端可操作地连接至该内含子的SEQIDNO:1的一个表达盒(其中该内含子被进一步在它的3’端可操作地连接至一个外显子或其一部分)可以包括SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、和/或SEQIDNO:23的核酸。如将被本领域普通技术人员很好地理解的，SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、和/或SEQIDNO:23的核酸可以进一步包括可操作地连接至所述核酸的3’端的一个Kozak序列。

在本发明的代表性实施例中，一个表达盒可以包括SEQIDNO:25和/或SEQIDNO:27的核酸，这些核酸的每一个按以下顺序：5’至3’，包括SEQIDNO:1的核酸、一个内含子、一个外显子的部分和一个Kozak序列。

仍在另外的实施例中，包括在3’端可操作地连接至一个内含子(该内含子可以在3’端可操作地连接至一个外显子或其一部分)的SEQIDNO:1的核酸的一个表达盒可以进一步任选地包括一个翻译增强子，例如TMVΩ翻译增强子，该翻译增强子可操作地连接至该外显子或其一部分的3’端或连接至可操作地连接至该外显子或其一部分的3’端的一个Kozak序列的3’端。TMV翻译增强子是本领域已知的(参见例如，加利(Gallie)等人，《核酸研究》(NucleicAcidsRes.)20:4631-4638(1992)；加利(GallieDR)《核酸研究》(NucleicAcidsRes.)30:3401-3411(2002)以及法伊弗(Pfeiffer)等人，《核酸研究》(Proc.Natl.AcadSci)109(17):6626-6631(2012))。在一个代表性实施例中，可以由SEQIDNO:29的核酸编码TMVΩ翻译增强子。

因此，在一些实施例中，提供了一个表达盒，该表达盒包括在3’端可操作地连接至一个内含子的SEQIDNO:1的核酸，该内含子可以在3’端可操作地连接至一个外显子，该表达盒可以进一步任选地包括TMVΩ翻译增强子和Kozak序列这二者，其中该Kozak序列可以被可操作地连接至该外显子的3’端，并且该TMVΩ翻译增强子可以被可操作地连接至该Kozak序列的3’端。因此，在一个代表性实施例中，本发明的一个表达盒可以按以下顺序：5’至3’，包括SEQIDNO:1的核酸、一个内含子、一个外显子，以及任选地一个Kozak序列和/或一个TMV翻译增强子。

另外，在一些具体实施例中，本发明的一个表达盒可以包括SEQIDNO:24的核酸，该核酸按以下顺序：5’至3’，包括SEQIDNO:1的核酸、一个内含子、一个外显子的部分和TMVΩ翻译增强子序列。

如将被本领域普通技术人员很好地理解的，本发明的一个表达盒可以任选地进一步包括连接至所述表达盒的5’和/或3’端的一个限制性内切核酸酶识别位点。因此，在本发明的一些实施例中，一个表达盒可以按以下顺序：5’至3’，包括一个限制性内切核酸酶识别位点、SEQIDNO:1的核酸、和一个限制性内切核酸酶识别位点。在其他实施例中，本发明的一个表达盒可以按以下顺序：5’至3’，包括一个限制性内切核酸酶识别位点、SEQIDNO:1的核酸、一个Kozak序列、和一个限制性内切核酸酶识别位点。仍在其他实施例中，本发明的一个表达盒可以按以下顺序：5’至3’，包括一个限制性内切核酸酶识别位点、SEQIDNO:1的核酸、一个内含子、和一个限制性内切核酸酶识别位点。在一个另外的实施例中，本发明的一个表达盒可以按以下顺序：5’至3’，包括一个限制性内切核酸酶识别位点、SEQIDNO:1的核酸、一个内含子、一个Kozak序列、和一个限制性内切核酸酶识别位点。在本发明的另外的实施例中，一个表达盒可以按以下顺序：5’至3’，包括一个限制性内切核酸酶识别位点、SEQIDNO:1的核酸、一个内含子、一个外显子、和一个限制性内切核酸酶识别位点。在本发明的另外的实施例中，一个表达盒可以按以下顺序：5’至3’，包括一个限制性内切核酸酶识别位点、SEQIDNO:1的核酸、一个内含子、一个外显子、一个Kozak序列、和一个限制性内切核酸酶识别位点。在本发明的另外的实施例中，一个表达盒可以按以下顺序：5’至3’，包括一个限制性内切核酸酶识别位点、SEQIDNO:1的核酸、一个内含子、一个外显子、一个TMVΩ翻译增强子、和一个限制性内切核酸酶识别位点。仍在本发明的另外的实施例中，一个表达盒可以按以下顺序：5’至3’，包括一个限制性内切核酸酶识别位点、SEQIDNO:1的核酸、一个内含子、一个外显子、一个TMVΩ翻译增强子、一个Kozak序列、和一个限制性内切核酸酶识别位点。

如在此使用的，术语“核酸”、“核酸分子”、“核苷酸序列”以及“多核苷酸”可以互换使用并且涵盖RNA和DNA二者，包括cDNA、基因组DNA、mRNA、合成的(例如，化学合成的)DNA或RNA、以及RNA和DNA的嵌合体。术语多核苷酸、核苷酸序列、或核酸是指核苷酸链而与链长度无关。核酸可以是双链或单链的。在单链时，核酸可以是有义链或反义链。可以使用寡核苷酸类似物或衍生物(例如，肌苷或硫代磷酸酯核苷酸)合成核酸。此类寡核苷酸可以例如用于制备具有改变的碱基配对能力或对核酸酶的增强的抗性的核酸。本发明进一步提供了为本发明的核酸、核苷酸序列、或多核苷酸的互补序列(该互补序列可以是完全互补序列或部分互补序列)的核酸。在此提供的核酸分子和/或核苷酸序列在此以5'至3'方向从左至右呈现，并且使用代表核苷酸字符的标准代码表示，如美国序列规则37CFR§§1.821-1.825和世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25中所述。

具有同源性的不同核酸或蛋白质在此被称作“同源物”。术语同源物包括来自相同物种和其他物种的同源序列以及来自相同物种和其他物种的直向同源序列。“同源性”是指就位置一致性(即，序列相似性或一致性)百分比而言，两个或更多个核酸和/或氨基酸序列之间的相似性水平。同源性也是指不同核酸或蛋白质之间相似功能特性的概念。因此，本发明的组合物和方法进一步包括本发明的多核苷酸和多肽序列的同源物。如在此使用的“直向同源”是指在物种形成过程中由共同的祖先基因产生的不同物种中的同源核苷酸序列和/或氨基酸序列。本发明的同源物与本发明的核酸具有实质序列一致性(例如，70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、和/或100％)。

“异源”核酸是一个天然地不与将该核酸引入其中的宿主细胞相关联的核酸，包括天然存在的核酸的非天然存在的多拷贝。

如在此使用，术语“嵌合的”指示一个DNA序列(例如一个载体或一个基因)是由以下构成：通过生成非天然存在的DNA序列的重组DNA技术而融合在一起的不同来源的两个或更多个DNA序列。

“野生型”核酸、核苷酸序列、多肽或氨基酸序列是指一种天然存在的或內源性的核酸、核苷酸序列、多肽或氨基酸序列。因此，例如，“野生型mRNA”是天然存在于有机体中的或对有机体来说是內源性的mRNA。“同源”核酸序列是一个与将该核酸序列引入其中的一个宿主细胞天然地关联的核酸。

在一些实施例中，本发明的这些重组核酸分子、多核苷酸序列以及多肽是“分离的”。“分离的”核酸分子、“分离的”核苷酸序列或“分离的”多肽是通过人工从其天然环境中分开而存在的一种核酸分子、核苷酸序列或多肽并因此不是自然产物。分离的核酸分子、核苷酸序列或多肽可以纯化形式存在，即与天然存在的有机体或病毒的至少一些其他组分(例如，细胞或病毒结构组分或通常发现与该多核苷酸有关的其他多肽或核酸)至少部分地分开。在多个代表性实施例中，分离的核酸分子、分离的核苷酸序列和/或分离的多肽是至少约1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或更大纯度的。

在其他实施例中，分离的核酸分子、核苷酸序列或多肽可以存在于非天然环境中，例如像重组宿主细胞。因此，例如，就核苷酸序列而言，术语“分离的”意指它从其天然存在于其中的染色体和/或细胞中分离出来。如果将一种多核苷酸从其天然存在于其中的染色体和/或细胞中分离出并且然后将其插入它并不天然存在于其中的遗传背景、染色体、和/或细胞(例如，不同的宿主细胞、不同的调节序列、和/或与自然中发现的不同的基因组位置)中，则该多核苷酸也是被分离的。因此，这些重组核酸分子、核苷酸序列以及它们所编码的多肽是“分离的”，因为它们通过人工方式从其天然环境中分开而存在并因此不是自然产物，然而，在一些实施例中，它们可以被引入到一个重组宿主细胞中并存在于该重组宿主细胞中。“人工的多核苷酸或多肽”、“工程化的多核苷酸或多肽”、“设计的多核苷酸或多肽”、“合成的多核苷酸或多肽”、“非天然存在的多核苷酸或多肽”、或类似表达是通过人为干涉产生的并且不是野生型的多核苷酸或多肽。

如此处使用的“可操作地连接”或“可操作地关联”意指所指定的元件是彼此功能上相关的，并且还通常是物理相关的。因此，如此处使用的术语“可操作地连接的”或“可操作地关联的”是指在功能上关联的一个单一核酸分子上的核苷酸序列。因此，可操作地连接至一个第二核苷酸序列的一个第一核苷酸序列是指当该第一核苷酸序列被放入与该第二核苷酸序列的功能关系中时的情况。例如，如果一个启动子或转录调节多核苷酸影响一个核苷酸序列的转录或表达，则该启动子或转录调节多核苷酸与所述核苷酸序列可操作地关联。本领域普通技术人员将理解，一个控制序列(例如启动子或转录调节多核苷酸)不需要和与其可操作地关联的一个核苷酸序列邻接，只要这一个或多个控制序列能发挥功能指导其表达。因此，例如，未翻译的已转录的间插序列可以在一个启动子或转录调节多核苷酸与一个待表达的核苷酸序列之间存在，并且该启动子或转录调节多核苷酸仍可以被认为是“可操作地连接”至该待表达的核苷酸序列上。

如在此使用的“序列一致性”是指两个最佳比对的多核苷酸或肽序列在组分(例如核苷酸或氨基酸)的整个比对窗口内不变的程度。可以通过已知方法轻易地计算“一致性”，该方法包括但不局限于在计算分子生物学(ComputationalMolecularBiology)(莱斯克(Lesk)，A.M.编辑)牛津大学出版社(OxfordUniversityPress)，纽约(1988)；生物运算:信息学和基因组项目(Biocomputing:InformaticsandGenomeProjects)(史密斯(Smith)，D.W.编辑)学术出版社(AcademicPress)，纽约(1993)；序列数据的计算机分析(ComputerAnalysisofSequenceData)，第I部分(格里芬(Griffin)，A.M.和格里芬(Griffin)，H.G.编辑)胡马纳出版社(HumanaPress)，新泽西(1994)；分子生物学中的序列分析(SequenceAnalysisinMolecularBiology)(冯海耶(vonHeinje)，G.编辑)学术出版社(AcademicPress)(1987)；和序列分析引物(SequenceAnalysisPrimer)(哥博斯科夫(Gribskov)，M.和德弗罗(Devereux)，J，编辑)斯托克顿出版社(StocktonPress)，纽约(1991)中描述的那些。

如在此使用的，术语“序列一致性百分比”或“一致性百分比”是指在最佳比对两个序列时，与测试(“主题”)多核苷酸分子(或其互补链)相比，参考(“查询”)多核苷酸分子(或其互补链)的线性多核苷酸序列中的相同核苷酸的百分比。在一些实施例中，“一致性百分比”可以是指氨基酸序列中相同氨基酸的百分比。

如在此使用，在两个核酸分子、核苷酸序列或蛋白质序列背景下的短语“实质上一致”是指当比较并比对最大对应性时具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％核苷酸或氨基酸残基一致性的两个或更多个序列或子序列，如使用以下序列比较算法之一或通过目测检查所测量的。在本发明的一些实施例中，在至少约50个残基至约150个残基长度的序列区域上存在实质上一致性。因此，在本发明的一些实施例中，在至少约50、约60、约70、约80、约90、约100、约110、约120、约130、约140、约150、或更大残基长度的序列区域上存在实质上一致性。在一些具体实施例中，这些序列在至少约150个残基上是实质上一致的。在一个另外的实施例中，这些序列在编码区或参考序列的全长上是实质上一致的。例如，本发明的一个多核苷酸可以在SEQIDNO:1的全长上具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性。此外，在代表性实施例中，实质上一致的核苷酸的或蛋白的序列实现实质上相同的功能(例如赋予保卫细胞特异性的表达和/或赋予保卫细胞优先的表达)。

对于序列比较，典型地，一个序列充当与测试序列进行比较的一个参考序列。当使用一种序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入到计算机中(若有必要，则指定子序列坐标)，并且指定序列算法程序的参数。然后，这种序列比较算法基于所指定的程序参数来计算这个或这些测试序列相对于该参考序列的序列一致性百分比。

用于比对一个比较窗口的最佳序列比对是本领域技术人员所熟知的并且可以由以下工具实施：如史密斯和沃特曼(Waterman)的局部同源性算法、尼德曼(Needleman)和翁施(Wunsch)的同源性比对算法、皮尔森(Pearson)和利普曼(Lipman)的相似性搜索方法，并且任选地由这些算法的计算机化实现方式来实施，如作为Wisconsin(材料科学软件公司(AccelrysInc.)，圣地亚哥(SanDiego)，加利福尼亚州)的部分可获得的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA。测试序列和参考序列的已比对区段的“一致性分数”是由两个已比对序列所共有的相同组分的数目除以参考序列区段(即，完整的参考序列或参考序列的更小限定部分)中组分的总数目。序列一致性百分比被表示为一致性分数乘以100。一个或多个多核苷酸序列的比较可以是相对于全长多核苷酸序列或其一部分，或相对于较长的多核苷酸序列。出于本发明的目的，也可以使用针对翻译的核苷酸序列的2.0版BLASTX和针对多核苷酸序列的2.0版BLASTN测定“一致性百分比”。

用于执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)公开地获得。这种算法涉及首先通过识别查询序列中具有长度W的短词而识别得分高的序列对(HSP)，这些得分高的序列对当与数据库的序列中具有相同长度的一个词(word)进行比对时匹配或满足某个阳性值的阈值分值T。T被称为邻近字码得分阈值(阿尔丘尔(Altschul)等人，1990)。这些初始的邻近字码命中充当种子用于起始搜索以发现包含它们的较长的HSP。然后，将这些字码命中在两个方向上沿着每个序列延伸直到累积的比对得分可以得到增加。对于核苷酸序列，使用参数M(对于一对匹配残基的奖赏得分；总是>0)和N(对于错配残基的罚分；总是<0)来计算累积的得分。对于氨基酸序列，使用得分矩阵来计算该累积得分。当累积的比对得分从它所达到的最大值降低了数量X，由于一个或多个负得分的残基比对使的积累使累积的得分降至0或0以下时，这些词的命中记录在每个方向的延伸停止，或者到达了各自序列的末端。BLAST算法的参数W、T、以及X决定了该比对的灵敏度与速度。BLASTN程序(对核苷酸序列来说)使用字长(W)为11、期望值(E)为10、截止值(cutoff)为100、M＝5、N＝4、以及两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长(W)为3、期望值(E)为10、以及BLOSUM62评分矩阵作为默认设置(参见赫尼科夫(Henikoff)&赫尼科夫(Henikoff)，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.)USA89:10915(1989))。

除了计算百分比序列一致性之外，BLAST算法还进行两个序列之间的相似性统计分析(参见例如，卡林(Karlin)&阿尔丘尔(Altschul),《美国国家科学院院刊》(Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA)90:5873-5787(1993))。由BLAST算法提供的相似性的一种量度是最小概率总和(P(N))，它提供了在两个核苷酸或氨基酸序列之间会偶然发生一个匹配的概率的一个指示。例如，如果在一个测试核苷酸序列与一个参考核苷酸序列的比较中的最小概率总和是小于约0.1至小于约0.001，则该测试核酸序列被认为是与该参考序列相似的。因此，在本发明的一些实施例中，在测试核苷酸序列与参考核苷酸序列的比较中的最小概率总和是小于约0.001。

当两个核苷酸序列在严格条件下彼此杂交时这两个核苷酸序列也可以被认为是实质上一致的。在一些代表性实施例中，被认为实质上一致的两个核苷酸序列在高严格条件下彼此杂交。

在核酸杂交实验(如DNA和RNA杂交)的背景下“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”是序列依赖性的，并且在不同的环境参数下是不同的。对核酸杂交的广泛指导见于蒂森(Tijssen)的生物化学和分子生物学实验室技术-使用核酸探针的杂交(LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbes)第2章第I部分“杂交原理和核酸探针测定策略综述(Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays)”，爱思唯尔(Elsevier)，纽约(1993)。总体上，高严格杂交和洗涤条件在限定的离子强度和pH下被选定为比特定序列的热熔点(T_m)低约5℃。

T_m是50％的目标序列与完全匹配的探针进行杂交时的温度(在限定的离子强度和pH下)。极严格条件被选定为等于具体探针的T_m。用于互补核苷酸序列(它们在DNA或RNA印迹中在滤器上具有超过100个互补残基)的杂交的严格杂交条件的一个实例是在42℃下含有1mg肝素的50％甲酰胺，其中杂交是进行过夜的。高严格洗涤条件的一个实例是0.15MNaCl，在72℃下持续约15分钟。严格洗涤条件的一个实例是在65℃下以0.2xSSC洗涤15分钟(参见萨姆布鲁克，以下针对SSC缓冲液的说明)。经常，高严格洗涤之前会先进行低严格洗涤，以去除背景探针信号。对于例如多于100个核苷酸的双链体的中等严格性洗涤的一个实例是在45℃下以1xSSC进行15分钟。对于例如多于100个核苷酸的双链体的低严格性洗涤的一个实例是在40℃下以4-6xSSC进行15分钟。对于短探针(例如，约10至50个核苷酸)，严格条件典型地涉及小于约1.0M的Na离子的盐浓度，典型地在pH7.0至8.3下约0.01至1.0M的Na离子浓度(或其他盐类)，并且温度典型地是至少约30℃。还可以通过加入去稳定剂(如甲酰胺)来实现严格条件。一般而言，在特定的杂交测定中相比于不相关的探针观察到的高出2倍(或更高)的信噪比表明检测到一个特定杂交。如果在严格条件下彼此不杂交的核苷酸序列所编码的蛋白质是实质上一致的，则这些核苷酸序列仍然是实质上一致的。例如，当使用遗传密码所允许的最大密码子简并性来生成核苷酸序列的一个拷贝时，这种情况可能发生。

以下是可以用于克隆同源核苷酸序列的杂交/洗涤条件的设置的例子，这些同源核苷酸序列是与本发明的参考核苷酸序列实质上一致的。在一个实施例中，一个参考核苷酸序列在50℃下在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO₄、1mMEDTA中与该“测试”核苷酸序列杂交，同时在50℃下在2XSSC、0.1％SDS中洗涤。在另一个实施例中，该参考核苷酸序列在50℃下在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中与该“测试”核苷酸序列杂交，同时在50℃下在1XSSC、0.1％SDS中洗涤；或者在50℃下在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO₄、1mMEDTA中杂交，同时在50℃下在0.5XSSC、0.1％SDS中洗涤。仍在另外的实施例中，该参考核苷酸序列在50℃下在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO₄、1mMEDTA中与该“测试”核苷酸序列杂交，同时在50℃下在0.1XSSC、0.1％SDS中洗涤；或者在50℃下在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO₄、1mMEDTA中杂交，同时在65℃下在0.1XSSC、0.1％SDS中洗涤。

在具体实施例中，两个核苷酸序列或两个多肽序列是实质上一致的另一个指示可以是由第一核酸所编码的蛋白质与由第二核酸所编码的蛋白质具有免疫交叉反应性或与其特异性结合。因此，在一些实施例中，一种多肽可以是与一种第二多肽实质上一致的，例如其中这两种多肽仅区别于保守取代。

如在此使用，关于一个核苷酸序列(例如，RNA或DNA)的术语“表达”、“表达了”、“表达的”或“表达”等指示该核苷酸序列被转录并且可任选被翻译。因此，一个核苷酸序列可以表达一个感兴趣的多肽或一个功能性的未翻译的RNA。“功能性”RNA包括在细胞中具有生物功能(例如调节基因表达)的任何未翻译的RNA。这类功能性RNA包括但不限于RNAi(例如、siRNA、shRNA)、miRNA、反义RNA、核糖酶、RNA适体等。

如在此使用，“表达盒”是指能够在一个适当的宿主细胞中指导一个特定的核苷酸序列的表达的一个核酸序列，包括一个转录调节多核苷酸，该转录调节多核苷酸可操作地连接至感兴趣的多核苷酸，该感兴趣的多核苷酸可操作地连接至终止信号。它还可以包括正确翻译该核苷酸序列所需的序列。该编码区可以对感兴趣的蛋白质进行编码，但是还可以在正义或反义方向上对感兴趣的功能性RNA(例如反义RNA或非翻译RNA)进行编码。在一些实施例中，包括该感兴趣的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意味着至少一个它的组分相对于至少一个它的其他组分是异源的。

如在此使用，“一个或多个调节序列”是指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、内部或下游(3'非编码序列)，影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译的核苷酸序列。调节序列包括但不限于，启动子、增强子、外显子、内含子、翻译前导序列、终止信号、以及多腺苷酸化信号序列。调节序列包括自然序列以及合成序列、连同可以是合成序列与自然序列的组合的多个序列。“一个人工的调节序列”、“一个工程化的调节序列”、“一个设计的调节序列”、“一个合成的调节序列”、“一个非天然存在的调节序列”是通过人为干涉产生的并且不是野生型调节序列的一个调节序列。例如，可以改变或设计一个野生型调节序列来改进一个基因的转录、翻译或表达。可替代地，可以不参考一个具体的野生型调节序列来产生调节序列。

一个“增强子”是改进多核苷酸或多肽的表达的核酸。增强子可以是转录增强子或翻译增强子。“转录增强子”是一个核酸，它可以刺激启动子的活性，并且可以是该启动子或插入的异源元件的一个固有元件以增强启动子的水平或组织特异性。一级序列可以存在于双链DNA分子中的任一个链上，并且甚至当放置在启动子的上游或下游时能够发挥功能。术语“启动子”的意思可以包括“启动子调节序列”。术语“翻译增强子序列”是指一个基因的处于启动子与编码序列之间的DNA序列部分，它被转录至RNA中并且存在于翻译起始密码子上游(5')的完全加工mRNA中。翻译增强子序列可影响初级转录物至mRNA的加工、mRNA稳定性或翻译效率。本领域技术人员知道可适用于执行本发明的终止子以及增强子序列。这些序列为本领域技术人员已知或可容易获得。

在一些实施例中，调节序列或区域可以相对于宿主细胞是野生型的/类似的，和/或调节序列可以相对于其他调节序列是野生型的/类似的。可替代地，调节序列可以相对于宿主细胞和/或彼此(即，这些调节序列)是异源的。

“转录调节多核苷酸”是指这样一个多核苷酸，它位于编码序列的转录起始位点的上游，并且它通过提供正确转录所需的RNA聚合酶以及其他因子的识别来控制该编码序列的表达。例如启动子的类型可以包括是组成性的、诱导性的、时间调节的、发育激活的、化学激活的、组织优先的和/或组织特异性的启动子。因此，例如，如在此描述，SEQIDNO:1和/或SEQIDNO:10-28的核酸可以发挥功能作为转录调节多核苷酸，当植物包含所述核酸时，针对感兴趣的多核苷酸，赋予保卫细胞特异性的或优先的表达。

“人工的转录调节多核苷酸”；“工程化的转录调节多核苷酸”；“设计的转录调节多核苷酸”；“合成的转录调节多核苷酸”或“非天然存在的转录调节多核苷酸”是通过人为干涉改变或产生的并且不是野生型的。例如，可以不参考特定的天然存在的转录调节多核苷酸来设计人工的转录调节多核苷酸，或人工的转录调节多核苷酸可以修饰一个存在的转录调节多核苷酸。

“受调节的启动子”是指非组成性地、但是却以一种时间地和/或空间地调节方式指导基因表达的启动子，并且包括组织特异性的、组织优先的启动子以及诱导型启动子这二者。它包括自然序列以及合成序列、连同可能是合成序列与自然序列的组合的多个序列。不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型中、或在不同的发育阶段、或响应于不同的环境条件来指导基因的表达。

“组织特异性启动子”是指以下受调节的启动子，它们不表达于所有植物细胞中而是仅仅在特异器官(例如，叶子、根或种子)的一个或多个细胞类型、特异性组织(例如，维管的、皮层的、薄壁组织的)、或特异的细胞类型(例如，叶实质或种子存储细胞)中。这些还包括受时间调节的启动子，例如在胚形成的初期或晚期、在种子或果实发育的果实成熟期间、在叶子被彻底分化中、或在衰老的起始时。“组织优先启动子”是优先地在某些组织中指导RNA合成的启动子(即RNA合成可以按降低的水平存在于其他组织中)。

如在此使用，“保卫细胞”是指调节气孔的孔径(即打开和关闭)并且借此控制气体交换的连同蒸腾作用的量的专门的表皮细胞。这些细胞特征在于它们的高度调节的膨压(即压力依赖性形状)，这会分别在低的或高的膨压时引起气孔的关闭或打开。保卫细胞源自表皮细胞并且不同于它们周围的表皮细胞，不同之处不仅在于它们的豆状形状，而且还在于它们光合作用的能力。

本发明的背景下的“保卫细胞特异性转录”是指按一种以下方式通过转录调节元件对核酸序列进行的转录，在该方式中，在保卫细胞中所述核酸序列的转录，在整个植物中在它的发育阶段中的任一个期间，构成从所述核酸序列转录的RNA的整体量的多于90％、优选多于95％、更优选多于99％。

此处的“保卫细胞优先转录”是指按一种以下方式通过转录调节元件对核酸序列进行的转录，在该方式中，在保卫细胞中所述核酸序列的转录，在整个植物中在它的发育阶段中的任一个期间，构成从所述核酸序列转录的RNA的整体量的多于50％、优选多于70％、更优选多于80％。

优选地，本发明的转录调节多核苷酸包括位于感兴趣的多核苷酸(例如希望转录的核苷酸序列)的转录起始的上游的并且能够诱导下游序列的转录的至少一个启动子序列。转录调节多核苷酸可以进一步包括其他元件，例如5’未翻译序列、增强子序列、内含子、和/或外显子。

启动子可以包括在启动子的功能中发挥作用的若干区域。这些区域中的一些是模块化的，换言之，它们可以被用于分离，以便赋予启动子活性，或它们可以与其他元件组装在一起，以便构成新启动子。这些启动子区域中的第一个就紧邻编码序列位于其上游并且形成“核心启动子区域”，该核心启动子区域通常包含共有序列，正常是紧邻编码序列位于其上游的20-70个碱基对。核心启动子区域典型地包含TATA盒和通常的一个起始元件连同起始位点。在多数启动子中，这样一个区域正常存在有一些变化。核心启动子区域通常称为最小启动子区域，因为它的功能性在于其自身用以促进基础水平的转录。

核心启动子区域的存在限定了为一个启动子的一个序列：如果该区域不存在，则该启动子是非功能性的。核心区发挥作用以将一般的转录机构吸引至该启动子，以便转录起始。然而，核心启动子区域典型地不足以按希望的水平提供启动子活性。一系列调节序列，通常在核心的上游，构成了启动子的剩余部分。调节序列可以决定表达水平、表达的空间模式和时间模式，并且对于启动子的子集，决定在诱导性条件下的表达(由外部因子，例如光、温度、化学品和激素来调节)。调节序列可以是DNA序列6-100个碱基对的短区域，这些短区域限定了反式作用因子例如转录因子的结合位点。调节序列还可以是增强子，即DNA序列的更长区域，这些更长区域可以在到核心启动子区域一个距离(有时到核心区域有几千多个碱基)处发挥作用。调节序列可以受反式作用因子影响，这些反式作用因子包括但不限于一般的转录机构、转录因子和染色质装配因子。

在一个代表性实施例中，本发明的最小转录调节多核苷酸可以是SEQIDNO:1的核酸。在一个另外的实施例中，本发明的最小转录调节多核苷酸可以是SEQIDNO:10-28的核酸。

“内含子”指几乎唯一地在真核基因中发生的DNA的一个内插区段，但这个内插区段在该基因产物中没有被翻译成氨基酸序列。通过一个称为剪接的过程从未成熟的mRNA中去除这些内含子，该剪接使外显子未被改变，从而形成一个mRNA。出于本发明的目的，术语“内含子”的定义可以包括对源自靶基因的内含子的核酸的修饰。

“外显子”是指携带对一个蛋白或其一部分进行编码的序列的DNA的一个区段。因此，外显子限定了包括5’非编码序列(或UTR)、蛋白编码序列、和3’非编码序列(或UTR)的mRNA。外显子被间插的、非编码序列(内含子)分离。出于本发明的目的，术语“外显子”的定义可以包括外显子的多个部分和对源自靶基因的外显子的核酸的修饰。

在一些实施例中，本发明的表达盒可以包括一个非翻译前导序列。已知源自病毒的多个非翻译前导序列用来增强基因表达。确切地说，来自烟草花叶病病毒(TMV，“Ω-序列”)、玉蜀黍褪绿斑驳病毒(MCMV)、以及苜蓿花叶病病毒(AMV)的前导序列已显示有效增强表达(加利(Gallie)等人(1987)《核酸研究》(NucleicAcidsRes.)15:8693-8711；以及斯库策斯基(Skuzeski)等人(1990)《植物分子生物学报》(PlantMol.Biol.)15:65-79)。本领域已知的其他前导序列包括但不限于：小核糖核酸病毒前导子，例如脑心肌炎(EMCV)5'非编码区前导子(埃尔罗伊-斯坦因(Elroy-Stein)等人(1989)《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:6126-6130)；马铃薯y病毒组前导子，例如烟草蚀纹病毒(TEV)前导子(艾利森(Allison)等人(1986)《病毒学》(Virology)154:9-20)；玉蜀黍矮花叶病毒(MDMV)前导子(艾利森(Allison)等人(1986)，同上)；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)前导子(马策亚克(Macejak)和萨摩(Samow)(1991)《自然》(Nature)(353:90-94)；来自AMV的外壳蛋白mRNA的非翻译前导子(AMVRNA4；乔布林(Jobling)和格尔克(Gehrke)(1987)《自然》(Nature)325:622-625)；烟草花叶病TMV前导子(加利(Gallie)等人(1989)《RNA分子生物学》(MolecularBiologyofRNA)237-256)；以及MCMV前导子(隆梅尔(Lommel)等人(1991)病毒学(Virology)81:382-385)。还参见，黛拉-乔帕(Della-Cioppa)等人(1987)《植物生理学报》(PlantPhysiol.)84:965-968。

表达盒还可以任选地包括一个转录和/或翻译终止区(即，终止区)。在具体实施例中，终止区是在植物中具有功能性的转录终止区。多种转录终止子是可供用于在表达盒中使用的并且负责在超出感兴趣的异源核酸时的转录终止以及正确的mRNA聚腺苷酸化。该终止区对于该转录起始区可以是类似的，对于该可操作地连接的感兴趣的核酸序列可以是类似的，对于该植物宿主可以是类似的，或者可以是源自另一种来源(即，对于该启动子或转录调节多核苷酸、该感兴趣的核酸、该植物宿主、或其任意组合而言是外来的或异源的)。常见的转录终止子包括但不限于CAMV35S终止子、tml终止子、胭脂碱合酶终止子和/或豌豆rbcsE9终止子。这些终止子可以在单子叶植物和双子叶植物二者中使用。此外，可以使用编码序列的类似转录终止子。在一些实施例中，终止子序列可以是SEQIDNO:30的核酸。

本发明的一个表达盒还可以包括编码可筛选标记的一个核酸，该可筛选标记可以用于针对所述标记的存在筛选转化的有机体或有机体的细胞。可筛选标记的很多实例是本领域已知的，并且可以用于在此描述的表达盒，并且包括但不限于：编码β-葡萄糖醛酸酶或uidA(GUS、编码不同的显色底物已知的酶的一个核酸；编码调节花青素颜料(红色)在植物组织中的产生的产物的R-基因座核酸(德拉波塔(Dellaporta)等人，“通过用Ac进行转座子-标记的玉蜀黍R-nj等位基因的分子克隆(MolecularcloningofthemaizeR-njallelebytransposon-taggingwithAc)”，第263-282页，其中：染色体结构和功能：新概念的影响(ChromosomeStructureandFunction:ImpactofNewConcepts)，第18次斯塔德勒遗传学研讨会(thStadlerGeneticsSymposium)(古斯塔夫森(Gustafson)和阿佩尔(Appels)编辑，普莱纽姆出版社(PlenumPress)1988))；编码β-内酰胺酶(不同的显色底物(例如，PADAC，显色的头孢菌素)已知的酶)的一个核酸(萨克利夫(Sutcliffe)(1978)《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:3737-3741)；编码xylE、编码邻苯二酚双加氧酶的一个核酸(茹科夫斯基(Zukowsky)等人(1983)《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)80:1101-1105)；编码酪氨酸酶(能够将酪氨酸氧化成DOPA和多巴醌(它们又缩合形成黑色素)的酶)的一个核酸(卡茨(Katz)等人(1983)《普通微生物学杂志》(J.Gen.Microbiol.)129:2703-2714)；编码β-半乳糖苷酶(存在显色底物的酶)的一个核酸；编码允许生物体发光检测的荧光素酶(lux)的一个核酸(欧(Ow)等人(1986)《科学》(Science)234:856-859)；编码可以用于钙敏感性的生物体发光检测中的水母发光蛋白的一个核酸(普瑞舍(Prasher)等人(1985)《生物化学与生物物理研究通讯》(Biochem.Biophys.Res.Comm.)126:1259-1268)；或者编码绿色荧光蛋白的一个核酸(尼德兹(Niedz)等人(1995)《植物细胞报告》(PlantCellReports)14:403-406)。本领域技术人员能够选择用于在本发明的表达盒中使用的适合的可筛选标记。

在一些实施例中，在此描述的重组多核苷酸可以被用于连接载体。术语“载体”是指用于将一种核酸(或多种核酸)转移、递送或引入到细胞中的组合物。载体包括一种含有有待被转移、递送或引入的一个或多个核苷酸序列的核酸分子。用于在植物和其他有机体的转化中使用的载体在本领域是熟知的。一般类别的载体的非限制性实例包括但不限于病毒载体、质粒载体、噬菌体载体、噬菌粒载体、黏粒载体、福斯质粒载体、噬菌体、人工染色体、或农杆菌二元载体，这些载体是处于双链或单链的线性的或环形的形式，可以是或可以不是自身可传播的或可移动的。如在此定义的载体可以通过整合进细胞基因组转化原核的或真核的宿主，或在染色体外存在(例如具有一个复制起点的自主复制质粒)。另外包括的是穿梭载体，穿梭载体一词是指DNA运载体，该DNA运载体自然地或经设计能够在两个不同的宿主有机体中复制，这些宿主有机体可以是选自：放线菌以及相关的物种、细菌和真核生物(例如，高等植物、哺乳动物、酵母或真菌细胞)。在一些代表性实施例中，该载体中的核酸是在适当的启动子或其他调节元件的控制之下、或与其可操作地相连接的，用于在一种宿主细胞中(如，一种微生物例如细菌的、或植物的细胞中)进行转录。该载体可以是一种双功能的表达载体，它在多种宿主中发挥作用。在基因组DNA的情况下，这可以包含它所拥有的启动子或其他调节元件；而在cDNA的情况下，这可以是处于适当的启动子或其他的调控元件的控制之下，用于在该宿主细胞中表达。

载体的非限制性实例是源自根癌农杆菌二元载体pBIN19的质粒pBI101，允许使用β-葡萄糖醛酸酶(GUS)表达信号来合并及测试启动子(杰弗逊(Jefferson)等人，1987，《欧洲分子生物学学会杂志》(EMBOJ)，6:3901-3907)。该载体的大小是12.2kb。它具有低拷贝RK2复制起点并且在细菌和植物这二者中赋予卡那霉素抗性。存在根据本发明可以使用的本领域普通技术人员已知的多个其他表达载体。载体的另外的非限制性实例包括：RK2(贝文(Bevan)，《核酸研究》(Nucl.AcidsRes.)(1984))；用于与农杆菌一起使用的二元载体pCIB200和pCIB2001，例如在WO95133818(实例35)(还参见EP0332104，实例19)披露了它们的构建；二元载体pCIB10，它包含编码卡那霉素抗性以用于选择的一个基因；广泛宿主范围的质粒pRK252，由罗斯坦(Rothstein)等人(《基因》(Gene)53:153-161(1987))描述了它的构建。格里策特(Gritzret)(《基因》(Gene)25:179-188(1983))描述了已经并入潮霉素B磷酸转移酶的基因而构建的pCIB10的不同衍生物。这些衍生物使得能够仅针对潮霉素来选择转基因植物细胞(pCIB743)，或针对潮霉素和卡那霉素来进行选择(pCIB715、pCIB717)。

因此，可获得多种转化载体用于植物转化，并且可以将本发明的重组多核苷酸和表达盒用于与任何这类载体进行连接。载体的选择将取决于优选的转化技术以及用于转化的目标种类。因此，在另外的实施例中，本发明的重组多核苷酸可以包含在重组载体中。载体的大小可以取决于该载体是否包含一个或多个表达盒(例如，用于分子堆叠)而显著变化。因此，载体大小的范围可以是从约3kb至约125kb。因此，在一些实施例中，载体的大小是约3kb、4kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、11kb、12kb、13kb、14kb、15kb、16kb、17kb、18kb、19kb、20kb、21kb、22kb、23kb、24kb、25kb、26kb、27kb、28kb、29kb、30kb、31kb、32kb、33kb、34kb、35kb、36kb、37kb、38kb、39kb、40kb、41kb、42kb、43kb、44kb、45kb、46kb、47kb、48kb、49kb、50kb、55kb、60kb、65kb、70kb、75kb、80kb、85kb、90kb、95kb、100kb、105kb、110kb、115kb、120kb、125kb或其中的任意范围。在一些实施例中，载体大小可以是约3kb至约122kb、约3kb至约50kb、或约3kb至约10kb。

因此，在本发明的另外的实施例中，提供了产生转基因细胞(例如植物的或细菌的细胞)的方法，所述方法包括将本发明的一个重组多核苷酸和/或表达盒引入细胞。在另外的方面，本发明提供了产生转基因的植物细胞、植物、和/或植物部分的方法，该方法包括将本发明的一个重组多核苷酸和/或表达盒引入所述植物细胞、植物或植物部分，由此产生包含所述重组多核苷酸或所述表达盒的转基因的植物细胞、植物或植物部分。在一些实施例中，包含本发明的一个重组多核苷酸和/或表达盒的转基因植物细胞可以被再生为在其基因组中包含本发明的所述重组多核苷酸和/或所述表达盒的转基因的植物或植物部分。在其他实施例中，其中当该重组多核苷酸可操作地连接至感兴趣的一个多核苷酸时，用所述重组核苷酸转化的植物在这一转化的植物的保卫细胞中特异性地或优先地表达可操作地连接的多核苷酸。

在代表性实施例中，提供了产生转基因的植物或植物部分的方法，所述方法包括将本发明的一个表达盒引入植物细胞，所述表达盒包括可操作地连接至一个感兴趣的多核苷酸的本发明的一个重组多核苷酸；从所述植物细胞再生植物或植物部分。在一些实施例中，以保卫细胞优先的或保卫细胞特异性的方式，在所述转基因的植物或植物部分中表达感兴趣的多核苷酸。

本发明的另外的方面提供了转化的植物的或细菌的细胞与包含转化的植物细胞的经转化的植物和/或植物部分，其中这些经转化的植物细胞与转化的植物和/或植物部分包括本发明的一个或多个重组多核苷酸(例如SEQIDNO:1、SEQIDNO:10-28或它们的任何组合)。

在一些具体实施例中，本发明提供了包含本发明的一个或多个重组多核苷酸的转基因植物细胞和/或从所述转基因植物细胞再生的转基因植物或植物部分。因此，在本发明的一些实施例中，提供了这样一种转基因植物，该转基因植物具有感兴趣的一个多核苷酸的保卫细胞特异性的或保卫细胞优先的表达，所述转基因植物是从包含可操作地连接至所述感兴趣多核苷酸的本发明的至少一种重组多核苷酸的转基因植物细胞再生。

在实践本发明时，可以采用任何植物(或植物的分类，例如分为属或更高的类别-目)，包括被子植物，裸子植物，单子叶植物，双子叶植物，C3、C4、CAM植物，微藻，和/或大型藻。

因此,可以与本发明的一个转录调节多核苷酸一起使用的植物的一些非限制性实例可以包括蔬菜作物，包括洋蓟、球茎甘蓝、芝麻菜、韭葱、芦笋、莴苣(例如，结球莴苣、叶莴苣、长叶莴苣)、小白菜(bokchoy)、黄肉芋、瓜类(例如，甜瓜、西瓜、克伦肖瓜(crenshaw)、白兰瓜、罗马甜瓜)、甘蓝类作物(例如，球芽甘蓝、卷心菜、花椰菜、西兰花、羽衣甘蓝、无头甘蓝、大白菜、小白菜)、刺菜蓟、胡萝卜、洋白菜(napa)、秋葵、洋葱、芹菜、欧芹、鹰嘴豆、欧洲防风草、菊苣、胡椒、马铃薯、葫芦(例如，西葫芦、黄瓜、小西葫芦、倭瓜、南瓜)、萝卜、干球洋葱、芜菁甘蓝、紫茄子(也称为茄子)、婆罗门参、苣菜、青葱、苦苣、大蒜、菠菜、绿洋葱、倭瓜、绿叶菜类(greens)、甜菜(例如糖甜菜、热带糖甜菜和饲料甜菜)、甘薯、唐莴苣、山葵、番茄、芜菁、木薯、以及香辛料；水果和/或蔓生作物，例如苹果、杏、樱桃、油桃、桃、梨、李子、西梅、樱桃、榅桲、杏仁、栗子、榛子、山核桃、开心果、胡桃、柑橘、蓝莓、博伊增莓(boysenberry)、小红莓、穗醋栗、罗甘莓、树莓、草莓、黑莓、葡萄、鳄梨、香蕉、猕猴桃、柿子、石榴、菠萝、热带水果、梨果、瓜、芒果、木瓜、以及荔枝；大田作物植物，例如三叶草、苜蓿、月见草、白芒花、玉米/玉蜀黍(饲料玉米、甜玉米、爆米花)、小米、啤酒花、卡诺拉(canola)/油菜、荷荷芭、花生、稻、红花、小粒谷类作物(稻、大麦、燕麦、黑麦、小麦等)、高粱、烟草、木棉、豆科植物(豆类、小扁豆、豌豆、大豆)、含油植物(油菜、芥菜、罂粟、橄榄、向日葵、红花、椰子、蓖麻油植物、可可豆、落花生)、拟南芥属、纤维植物(棉花、亚麻、大麻、黄麻)、樟科(肉桂、莰酮)、或一种植物例如咖啡、甘蔗、茶、以及天然橡胶植物；和/或花坛植物，例如开花植物、仙人掌、肉质植物和/或观赏植物(例如兰花、康乃馨、玫瑰)，以及树例如森林(阔叶树和常绿树，例如针叶树)、果树、观赏树、以及结坚果的树(nut-bearingtree)、以及灌木和其他苗木。在本发明的实践中有用的其他植物包括多年生的禾本科植物，例如芦竹属、柳枝稷、草原草(prairiegrasses)、印度草(Indiangrass)、大须芒草(Bigbluestemgrass)、芒属、等。认识到可以使用多种植物的混合物。

如在此使用，术语“植物部分”包括但不限于，胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、果仁、穗、穗轴、果壳、茎秆、根、根尖、花药、植物细胞(包括在植物和/或植物的部分中完整的植物细胞)、植物原生质体、植物组织、植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团(plantclumps)、以及类似物。此外，如在此使用的，“植物细胞”是指该植物的一种结构和生理单元，该单元包含一个细胞壁并且还可以是指原生质体。本发明的植物细胞可以处于一种分离的单细胞形式中，或者可以是一种培养的细胞，或者可以是较高级的组织单位(例如像，植物组织或植物器官)的一部分。“原生质体”是一种分离的植物细胞，没有细胞壁或仅具有部分细胞壁。因此，在本发明的一些实施例中，包含本发明的核酸分子和/或核苷酸序列的转基因细胞是任何植物或植物部分的细胞，包括但不限于，根细胞、叶细胞、组织培养物细胞、种子细胞、花细胞、果实细胞、花粉细胞、以及类似物。

在一些具体实施例中，本发明提供了从本发明的转基因植物中产生的转基因种子，其中该转基因种子包含本发明的重组多核苷酸和/或表达盒。

“植物细胞培养物”意指植物单元(例如像，原生质体、细胞培养物细胞、植物组织中的细胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、接合子以及处于不同发育阶段的胚)的培养物。在本发明的一些实施例中，提供了一种转基因组织培养物或转基因植物细胞培养物，其中该转基因组织或细胞培养物包含本发明的核酸分子/核苷酸序列。

如在此使用的，“植物器官”是植物的一个独特而明显结构化和分化的部分，如根、茎、叶、花蕾或胚。

如在此使用的“植物组织”意指组织化成结构和功能单元的一组植物细胞。包括植物中或培养物中的任何植物组织。这个术语包括但不限于：全株植物、植物器官、植物种子、组织培养物以及被组织化成结构和/或功能单元的任何植物细胞群组。这个术语与以上列出的或由该定义以其他方式涵盖的任何具体类型的植物组织的联合应用或单独应用并不旨在排除任何其他类型的植物组织。

在多核苷酸序列(例如，本发明的重组多核苷酸和/或表达盒)的背景下的“引入”意指以一种方式将一个多核苷酸序列呈递给该植物、植物部分和/或植物细胞，该方式使得该多核苷酸序列可以进入细胞内部。在有待引入多于一个多核苷酸序列时，这些多核苷酸序列可以作为单一的多核苷酸或核酸构建体(例如表达盒)的一部分、或者作为分开的多核苷酸或核酸构建体(例如表达盒)而组装，并且可以位于相同或不同的转化载体上。因此，可以在单一的转化事件中、在分开的转化事件中、或者例如作为育种方案的一部分，将这些多核苷酸引入到植物细胞中。因此，如在此使用的术语“转化”是指将异源核酸引入一个细胞中。细胞的转化可以是稳定或瞬时的。因此，在一些实施例中，可以用本发明的一个重组多核苷酸稳定地转化植物细胞、植物部分或植物。在其他实施例中，可以用本发明的重组多核苷酸瞬时地转化植物细胞、植物部分或植物。可替代地，可以通过使包含该多核苷酸的植物与不包含该多核苷酸的植物杂交，来将一个多核苷酸引入植物。后续代的至少一些成员将包含本发明的多核苷酸。

在多核苷酸背景下的“瞬时转化”意指：多核苷酸被引入细胞中并且没有整合到该细胞的基因组中。

在被引入细胞中的多核苷酸的背景下，“稳定引入(stablyintroducing)”或“稳定引入的(stablyintroduced)”意指所引入的多核苷酸被稳定地合并到该细胞的基因组中，并且因此该细胞用该多核苷酸进行了稳定转化。

如在此使用的，“稳定转化(Stabletransformation)”或“稳定转化的(stablytransformed)”意指一种多核苷酸被引入到细胞中并且整合到该细胞的基因组中。因此，整合的多核苷酸能够由其子代继承，更具体地说，由多个连续世代的子代继承。如在此所使用的“基因组”还包括核和质体基因组，并且因此包括多核苷酸到例如叶绿体基因组中的整合。如在此使用的稳定转化也可以是指在染色体外(例如，作为微型染色体)维持的转基因。

瞬时转化可以通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)或蛋白质印迹来检测，这些测定可以检测由一个或多个引入到有机体中的转基因编码的肽或多肽的存在。细胞的稳定转化可以通过例如细胞的基因组DNA与核酸序列(这些核酸序列与引入有机体(例如，植物)中的转基因的核苷酸序列特异性杂交)的DNA印记杂交测定来检测。细胞的稳定转化还可以通过例如细胞的RNA与核酸序列的RNA印迹杂交测定来检测，这些核酸序列与引入到植物或其他有机体中的转基因的核苷酸序列特异性杂交。细胞的稳定转化还可以通过例如聚合酶链式反应(PCR)或本领域熟知的其他扩增反应来进行检测，这些反应采用与转基因的一个或多个目标序列杂交的特异性引物序列，从而导致该转基因序列的扩增，这种扩增可以根据标准方法进行检测。转化还可以通过本领域熟知的直接测序和/或杂交方案进行检测。

可以通过本领域普通技术人员已知的任何方法将本发明的一个重组多核苷酸(例如，SEQIDNO:1、SEQIDNO:10-28、或它们的任何组合)引入细胞中。在本发明的一些实施例中，细胞的转化包括核转化。在其他实施例中，细胞的转化包括质体转化(例如，叶绿体转化)。

用于转化植物的程序是熟知的并且在本领域内是常规的并且普遍描述于文献中。用于植物转化的方法的非限制性实例包括通过以下各项的转化：细菌介导的核酸递送(例如，经由农杆菌)、病毒介导的核酸递送、碳化硅或核酸须晶介导的核酸递送、脂质体介导的核酸递送、微注射、微粒轰击、磷酸钙介导的转化、环糊精介导的转化、电穿孔、纳米粒子介导的转化、超声处理、渗入、PEG介导的核酸吸收、以及使得核酸引入到植物细胞中的任何其他电学的、化学的、物理的(机械的)和/或生物的机制，包括其任意组合。对于本领域已知的不同植物转化方法的一般指导包括今井(Miki)等人(在格里克B.R.(Glick,B.R.)和汤普逊J.E.(Thompson,J.E.)编辑的《植物分子生物学与生物技术方法》(MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology)中的“用于将外来DNA引入植物中的程序(ProceduresforIntroducingForeignDNAintoPlants)”(CRC出版公司(CRCPress,Inc.)，波卡拉顿(BocaRaton)，1993)，第67-88页)和拉科沃奇-特罗扬诺夫斯卡(Rakowoczy-Trojanowska)(《细胞与分子生物学快报》(Cell.Mol.Biol.Lett.)7:849-858(2002))。

农杆菌介导的转化是一种用于转化植物、尤其是双子叶植物的普遍使用的方法，因为它的高转化效率以及因为它对于许多不同物种的广泛实用性。农杆菌介导的转化典型地涉及将携带感兴趣的外来DNA的二元载体转移到适当的农杆菌菌株，这可能取决于由宿主农杆菌菌株或者在共同存在的Ti质粒上或染色体地携带的vir基因的互补序列(乌肯斯(Uknes)等人，(1993)《植物细胞》(PlantCell)5:159-169)。该重组二元载体向农杆菌中的转移可以利用携带该重组二元载体的大肠杆菌、辅助大肠杆菌菌株(该辅助菌株携带能够将该重组二元载体移动到目标农杆菌菌株中的质粒)通过一种三亲本交配程序实现。可替代地，可以通过核酸转化将该重组二元载体转移到农杆菌中(和威尔米策(Willmitzer)(1988)《核酸研究》(NucleicAcidsRes.)16:9877)；Weigel&Glazebrook，(2006)使用电穿孔的农杆菌转化(TransformationofAgrobacteriumUsingElectroporation)，《冷泉港实验方案》(ColdSpringHarbProtoc)，doi：10.1101/pdb.prot4665；以及Weigel&Glazebrook,(2006)使用冻融方法的农杆菌转化(TransformationofAgrobacteriumUsingtheFreeze-ThawMethod)，《冷泉港实验方案》(ColdSpringHarbProtoc)；2006；doi：10.1101/pdb.prot4666)

通过重组农杆菌进行的植物转化通常涉及该农杆菌与来自该植物的外植体的共培养，并且遵循本领域熟知的方法。在携带位于这些二元质粒T-DNA边界之间的抗生素或除草剂抗性标记的选择培养基上对转化的组织进行再生。

另一种用于转化植物、植物部分和/或植物细胞的方法涉及在植物组织和细胞上推进惰性或生物活性的粒子。参见，例如，美国专利号4,945,050；5,036,006以及5,100,792。通常，这种方法涉及在有效于穿透该细胞的外表面并提供在其内部中的合并的条件下在植物细胞处推进惰性或生物活性的粒子。当使用惰性粒子时，可以通过用含有感兴趣的核酸的载体包被这些粒子而将该载体引入该细胞中。可替代地，一个或多个细胞可以被该载体围绕使得该载体通过该粒子的激发而被带入该细胞中。也可以将生物活性粒子(例如，干燥的酵母细胞、干燥的细菌或噬菌体，各自含有一个或多个试图被引入的核酸)推进到植物组织中。

因此，在本发明的具体实施例中，植物细胞可以通过本领域内已知的或如在此描述的任何方法进行转化，并且可以使用多种已知技术中的任一种从这些转化的细胞再生完整的植物。在以下文献中描述了由植物细胞、植物组织培养物和/或培养的原生质体进行的植物再生：例如，埃文斯(Evans)等人(《植物细胞培养物手册》(HandbookofPlantCellCultures)，第1卷，麦克米兰出版公司，纽约(1983))；以及瓦西尔I.R.(VasilI.R.)(编辑)(《植物的细胞培养和体细胞遗传学》(CellCultureandSomaticCellGeneticsofPlants)，学术出版社，奥兰多(Orlando)，第I卷(1984)和第II卷(1986))。选择转化的转基因植物、植物细胞和/或植物组织培养物的方法在本领域中是常规的，并且可以用于在此提供的本发明的方法中。

同样地，工程化到以上所述的本发明的转基因种子和植物、植物部分和/或植物细胞中的遗传特性可以通过有性生殖或营养生长来传递，并且因此可以在子代植物中维持并传代。通常，维持和传代利用了被开发以适合特定目的(如收获、播种或耕作)的已知农业方法。

因此，可以按本领域熟知的任何数目的方法将一种核苷酸序列引入到该植物、植物部分和/或植物细胞中。本发明的这些方法并不取决于用于将一种或多种多核苷酸引入到植物中的具体方法，仅取决于它们可以获准进入该植物的至少一个细胞内部。在有待引入多于一个多核苷酸序列的情况下，它们可以作为单一核酸构建体的部分、或者作为分开的核酸构建体而进行组装，并且可以位于相同或不同的核酸构建体上。因此，可以在单一的转化事件中、在分开的转化事件中、或者例如作为育种方案的一部分在植物中，将这些核苷酸序列引入到感兴趣的细胞中。

在本发明的一些实施例中，本发明的保卫细胞特异性的或保卫细胞优先的转录调节多核苷酸可以被用于表达尤其是用于在保卫细胞中特异性表达的性状。

对于在保卫细胞中表达，设想很多性状都会是有用的。可以从疾病抗性基因获得待连接至本发明的一个转录调节多核苷酸的开放阅读框，这些疾病抗性基因例如是细菌疾病抗性基因、真菌疾病抗性基因、病毒疾病抗性基因、线虫疾病抗性中心、营养利用基因、可筛选标记基因、影响植物农艺学特征(即产量、站立能力(抗倒伏性)、等)的基因、或环境的或胁迫的抗性基因，即胁迫耐受性或抗性(如示例为对干旱、热、寒冷、冷冻、湿度过大、盐胁迫、或氧化胁迫的抗性或耐受性)、增加的产量、食物含量和组成、物理外观、干倒、站立能力、繁殖力、等。在一些实施例中，感兴趣的基因可以包括但不限于修饰的或未修饰的ABA受体。ABA受体使本领域已知的，并且包括但不限于PYR/PYL/RCAR蛋白家族(参见帕克(Park)等人，《科学》(Science)324:1068-1071(2009)；克莱恩(Kline)等人，《植物生理学》(PlantPhysiol)154:479-482(2010)；美国专利申请公开号20100216643)。

“抗性”是指由于药剂给予、病原体感染、或暴露于胁迫，展现出基本上没有表型改变的植物。“耐受性”是指虽然由于感染，植物会展现出一些表型改变，但是它不具有大幅降低的繁殖能力或大幅改变的代谢。

因此，对于表达包括改变代谢途径、赋予疾病抗性、等的那些的多种多样的基因而言，保卫细胞优先的或保卫细胞特异性的转录调节多核苷酸是有用的。

对于修饰植物的表型，本发明的转录调节多核苷酸是有用的。会希望转基因植物的表型方面的不同改变(即修饰植物的脂肪酸构成、改变植物的氨基酸含量、改变植物的病原体防御机制、等)。可以通过提供植物中异源产物的表达或内源产物的增加表达来实现这些结果。可替代地，可以通过提供植物中一种或多种内源产物，特别是酶或辅因子的表达的减少，来实现这些结果。因此，这些改变还会导致有益的植物表型。通常，在此描述的转录调节多核苷酸可以被用于表达可操作地连接至所述转录调节多核苷酸序列的核酸区段，例如像开放阅读框或其一部分、反义序列、编码双链RNA序列的序列、或转基因。

因此，在一些实施例中，本发明提供了一种在植物的保卫细胞中表达感兴趣的多核苷酸的方法，该方法包括将与该感兴趣的多核苷酸可操作地连接的本发明的重组多核苷酸和/或将包括与该感兴趣的多核苷酸可操作地连接的本发明重组多核苷酸的本发明表达盒引入植物细胞，使植物细胞再生为用本发明的所述重组多核苷酸或表达盒稳定地转化的植物，其中在所述经稳定地转化的植物的保卫细胞中表达感兴趣的多核苷酸。在本发明的一些实施例中，该感兴趣的多核苷酸的表达是保卫细胞特异性的或保卫细胞优先的。

在一些实施例中，本发明的转录调节多核苷酸可以用于赋予反义构建体、RNAi、等的保卫细胞特异性的或保卫细胞优先的表达。

在其他实施例中，调节保卫细胞功能(例如气孔打开和关闭)的一种方法，该方法包括将与感兴趣的多核苷酸(它的表达调节保卫细胞功能)可操作地连接的本发明的重组多核苷酸和/或将包括与所述感兴趣的多核苷酸可操作地连接的本发明重组多核苷酸的本发明表达盒引入植物细胞，将植物细胞再生为用本发明的所述重组多核苷酸稳定地转化的植物，其中在所述稳定地转化的植物的保卫细胞中表达该感兴趣的多核苷酸，由此如与并不包括本发明的一个重组多核苷酸或表达盒(即并未用它们进行转化)的植物相比，来调节经稳定地转化的植物的保卫细胞的功能。

在本发明的一些实施例中，该感兴趣的多核苷酸的表达是保卫细胞特异性的或保卫细胞优先的。在代表性实施例中，该感兴趣的多核苷酸序列是修饰的或未修饰的ABA受体。

在另外的实施例中，提供了改进植物对水分亏缺的反应和植物水分利用效率的一种方法，该方法包括将与感兴趣的多核苷酸(它的表达可以改进植物对水分亏缺的反应和植物水分利用效率)可操作地连接的本发明的重组多核苷酸和/或将包括所述感兴趣的多核苷酸可操作地连接的本发明重组多核苷酸的本发明表达盒引入植物细胞，将植物细胞再生为用本发明的所述重组多核苷酸稳定地转化的植物，其中在所述稳定地转化的植物的保卫细胞中表达该感兴趣的多核苷酸，由此如与并不包括本发明的重组多核苷酸或表达盒(即并未用它们进行转化)的植物相比，在经稳定地转化的植物中改进植物对水分亏缺的反应和植物水分利用效率。在代表性实施例中，该感兴趣的多核苷酸序列是修饰的或未修饰的ABA受体。

仍在另外的实施例中，提供了调节光同化作用速率的一种方法，该方法包括将与感兴趣的多核苷酸(它的表达可以调节光同化作用速率)可操作地连接的本发明的重组多核苷酸和/或将包括与所述感兴趣的多核苷酸可操作地连接的本发明重组多核苷酸的本发明表达盒引入植物细胞，将植物细胞再生为用本发明的所述重组多核苷酸稳定地转化的植物，其中在所述稳定地转化的植物的保卫细胞中表达感兴趣的多核苷酸，由此如与并不包括本发明的重组多核苷酸或表达盒(即并未用它们进行转化)的植物相比，在经稳定地转化的植物中调节光同化作用速率。在代表性实施例中，该感兴趣的多核苷酸序列是修饰的或未修饰的ABA受体。

在另外的实施例中，调节植物蒸腾作用速率的一种方法，该方法包括将与感兴趣的多核苷酸(它的表达可以调节植物蒸腾作用速率)可操作地连接的本发明的重组多核苷酸和/或将包括与所述感兴趣的多核苷酸可操作地连接的本发明重组多核苷酸的本发明表达盒引入植物细胞，将植物细胞再生为用本发明的所述重组多核苷酸稳定地转化的植物，其中在所述稳定地转化的植物的保卫细胞中表达感兴趣的多核苷酸，由此如与并不包括本发明的重组多核苷酸或表达盒(即并未用它们进行转化)的植物相比，在经稳定地转化的植物中调节蒸腾作用速率。在代表性实施例中，该感兴趣的多核苷酸序列是修饰的或未修饰的ABA受体。

在本发明的另外的实施例中，提供了产生具有调节的保卫细胞功能的植物的一种方法，该方法包括将与感兴趣的多核苷酸(它的表达可以调节保卫细胞功能)可操作地连接的本发明的重组多核苷酸和/或将包括与所述感兴趣的多核苷酸可操作地连接的本发明重组多核苷酸的本发明表达盒引入植物细胞，将植物细胞再生为用本发明的所述重组多核苷酸稳定地转化的植物，由此如与并不包括本发明的重组多核苷酸或表达盒(即并未用它们进行转化)的植物相比，产生具有调节的保卫细胞功能的经稳定地转化的植物。

仍在另外的实施例中，本发明提供了通过提供的本发明的这些方法，由此产生的植物和植物部分，其中转化的植物和/或植物部分包括本发明的一种或多种重组多核苷酸(例如SEQIDNO:1、SEQIDNO:10-28)和/或包括本发明的所述一种或多种重组多核苷酸(例如SEQIDNO:1、SEQIDNO:10-28)的本发明的表达盒。在其他实施例中，本发明进一步提供了从本发明的植物中产生的种子，其中该种子在其基因组中包含本发明的重组多核苷酸和/或表达盒。

本发明还针对通过使包含本发明的多核苷酸的第一亲本植物与第二亲本植物杂交，来产生新植物的方法。另外，本发明可以用于品种发育过程，用来在繁育种群或杂交中衍生子代。另外，第一和第二亲本植物这二者都可以是或源自包含本发明的多核苷酸的植物。取决于繁殖模式、性状、种质的条件，可以选择多种繁育方法。因此，使用包含本发明的多核苷酸的植物的任何此类方法都是本发明的一部分：自交、回交、轮回选择、混合选择等。

本发明进一步提供了包括本发明的多种植物的作物、或其子代，其中所述子代是转基因植物，一起栽种在农田中。在一些实施例中，本发明提供了从本发明的植物或植物部分生产的产品。

本发明的另外的方面包括从本发明的这些转基因植物和/或其部分或作物中产生的收获产物以及从所述收获产物中产生的加工产物。收获产物可以是全株植物或任何植物部分，如在此描述的，其中所述收获产物包含本发明的一个重组核酸分子/构建体。因此，在一些实施例中，收获的产物的非限制性实例包括种子、果实、花或其部分(例如，花药、柱头等)、叶、茎等。在其他实施例中，加工产物包括但不限于由收获的本发明的种子产生的细粉、粗粉、油、淀粉、谷物等，其中所述种子包含发明的重组核酸分子/核苷酸序列。

术语“调节”(modulate、modulates、modulated或modulation)是指在指定活性方面(例如调节的蛋白生产)的增强(例如增加)或抑制(例如降低)。

如在此使用，术语“增加”(increase、increasing、increased)，“增强”(enhance、enhanced、enhancing和enhancement)(以及它们的语法变化)描述了在植物、植物部分或植物细胞中，例如在对水分亏缺的反应和/或植物水分利用效率方面的提高，和/或在光同化作用速率、等方面的提高。可以通过如与适当对照(例如缺乏所述重组多核苷酸或所述表达盒(即并未用它们进行转化)的相同植物、植物部分或植物细胞)相比，比较例如用与感兴趣的多核苷酸(当它表达时增加植物对水分亏缺的反应、水分利用效率和/或光同化作用速率)可操作地连接的本发明的重组多核苷酸或表达盒转化的植物、植物部分、或植物细胞中的增加，观察到这一增加。因此，如在此使用，术语“增加”(increase、increasing、increased)，“增强”(enhance、enhanced、enhancing和enhancement)(以及它们的语法变化)和类似术语指示如与对照相比，至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、150％、200％、300％、400％、500％或更多、或其中的任何范围的提高。

如在此使用，术语“减少”(reduce、reduced、reducing,、reduction)，“缩小”(diminish)，“抑制”(suppress)、和“降低”(decrease)(以及它们的语法变化)例如描述了如与如在此描述的对照相比，在植物、植物细胞和/或植物部分中，光同化作用速率和或蒸腾作用速率方面的降低。如在此使用，术语“减少”(reduce、reduced、reducing,、reduction)，“缩小”(diminish)，“抑制”(suppress)、和“降低”(decrease)和类似术语是指如与对照(例如缺乏所述重组多核苷酸或所述表达盒(即并未用它们进行转化)的相同植物、植物部分或植物细胞)相比，至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更多、或其中的任何范围的降低。

如在此使用，术语“改进”(improve、improved、improving、和improvement)(以及它们的语法变化)描述了例如，如与并未用本发明的所述重组多核苷酸或所述表达盒转化的相同植物(即对照)相比，已经用与感兴趣的多核苷酸(当它表达时调节植物对水分亏缺的反应和/或水分利用效率)可操作地连接的本发明的重组多核苷酸和/或表达盒转化的植物在例如对水分亏缺的反应和/或水分利用效率方面的改变。取决于希望的结果，相对于对照，“改进”可以是增加或降低。

在此引用的所有的公开、专利申请、专利以及其他参考文件对于引用中提及的有关句子和/或段落的传授内容通过引用以其全文结合在此。

现在将参考以下实例描述本发明。应了解，这些实例并不旨在将权利要求书的范围限于本发明，而是旨在成为某些实施例的示例。技术人员想到的所例举的方法中的任何变型旨在属于本发明的范围内。

实例

除非另外指明，出于本发明的目的进行重组DNA步骤，例如像限制性内切核酸酶处理、琼脂糖凝胶电泳、DNA片段的纯化、将核酸转移至硝酸纤维素和尼龙膜上、连接DNA片段、转化大肠杆菌细胞、使细菌生长、繁殖噬菌体和DNA序列分析，这些都是如萨姆布鲁克(Sambrook)(《分子克隆实验指南》(MolecularCloning:ALaboratoryManual)(第二版，冷泉港实验室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress)，普莱恩维尤(Plainview)，纽约(1989))所述进行的。遵循桑格(Sanger)的方法(桑格(Sanger)，《美国国家科学院院刊》(PNAS)：74(12)5463-5467(1977))，使用ABI激光荧光DNA测序仪来进行DNA分子的测序。

实例1.材料和一般方法

(A)针对以下鉴定保卫细胞特异性的或优先的转录调节多核苷酸：

(1)鉴定拟南芥At1G22960mRNA

进行序列垒积(sequencepile-up)来限定At1G22960的mRNA。将这一序列用于不同数据库的BLASTN查询，用来在两个方向上延伸转录物。此外，鉴定转录起始和终止密码子，用来说明基因的开放阅读框。通过若干同源cDNA的组装，限定了保卫细胞基因(At1G22960)的全长mRNA。

(2)保卫细胞转录调节多核苷酸的构建

将来自以上比对的基因组序列数据用于构建新颖的保卫细胞表达盒。SEQIDNO:1表示用于植物保卫细胞转录的最小转录调节核酸。SEQIDNO:10-16表示最小转录调节核酸加内含子。SEQIDNO:17、18、19、20、21、22、23表示进一步包括内含子和来自拟南芥属At1G22960的外显子的部分序列的最小转录调节核酸。SEQIDNO:24表示包括内含子、来自拟南芥属At1G22960的外显子的部分序列、烟草花叶病毒翻译增强子和Kozak序列的最小转录调节核酸。SEQIDNO:25和SEQIDNO:27表示包括内含子、来自拟南芥属At1G22960的外显子的部分序列、和Kozak序列的最小转录调节核酸。SEQIDNO:26表示进一步包括Kozak序列的最小转录调节核酸。

如以上所述，基于cDNA/gDNA比对进行核酸取代，以便去除任何翻译起始密码子并且以便在关键位置在工程化的翻译起始密码子上游插入翻译终止密码子。特异性核酸取代包括用脱氧腺嘌呤(A)取代脱氧胞嘧啶(C)，例如在SEQIDNO:1的位置765和位置770。可替代地，在此也可以使用dCTP和dATP。

实例2.载体构建

这些表达盒进一步包括编码受体基因β-葡萄糖醛酸酶(GUS)的感兴趣的多核苷酸和转录终止子序列(SEQIDNO:30)。

代表本发明的表达盒可以由连接至感兴趣多核苷酸的转录调节多核苷酸和终止子组成。通过用适当限制性内切核酸酶位点置于这些组分侧翼来制备表达盒，以便协助使用标准重组DNA方法来进行构建。例如，可以在5’末端上将限制性内切核酸酶位点XhoI和SanDI以及在3’末端上将NcoI置于启动子侧翼，可以在5’末端上将NcoI和在3’末端上将SacI置于感兴趣的基因的侧翼，并且可以在5’末端上将SacI和在3’末端上将RsrII/XmaI置于终止子的侧翼。可以将启动子和终止子合成为单个DNA产物并且将它们插入适当的细菌载体(例如pBlueScript^TM)，以便在大肠杆菌中繁殖。可以将感兴趣的多核苷酸作为NcoI/SacI片段插入进启动子和末端之间。可以用适当SanDI或RsrII位点，将完整表达盒作为SanDI或RsrII片段移动至适当的农杆菌二元载体。

实例3.转基因玉蜀黍植物的产生

将融合至植物受体基因β-葡萄糖醛酸酶(GUS)的包括保卫细胞表达盒(包括本发明的保卫细胞特异性的或优先的转录调节核酸(例如EQIDNO:1和/或SEQIDNO:10-28)的表达盒)的农杆菌二元载体转化进玉蜀黍。

未成熟的玉蜀黍胚的转化基本上如在内格罗托(Negrotto)等人,2000,《植物细胞报告》(PlantCellReports)19:798-803(2000)中所说明进行。可以将那里描述的不同的培养基组分替换掉。

使包含该植物转化质粒的农杆菌菌株LBA4404(Invitrogen)在YEP(酵母提取物(5g/L)、蛋白胨(10g/L)、NaCl(5g/L)、15g/l琼脂，pH6.8)固体培养基上、在28℃生长2至4天。将大约0.8X109个农杆菌悬浮于补充有100μM乙酰丁香酮(As)的LS-inf培养基中(LSAs培养基)(内格罗托(Negrotto)等人，《植物细胞报告》(PlantCellRep)19:798-803(2000))。在这个培养基中对细菌预诱导30至60分钟。

将来自玉蜀黍系A188或其他适合的玉蜀黍基因型的未成熟胚从8至12天大的穗中切除放到液体LS-inf+100μMAs(LSAs)中。将胚涡流搅拌5秒并用新鲜的感染培养基漂洗一次。除去感染培养基并然后添加农杆菌溶液，并将胚涡流搅拌30秒并允许其与细菌一起沉降5分钟。然后将这些胚盾片向上地转移到LSA培养基中，并且在暗处培养两到三天。随后，将每佩特里细菌培养皿20和25之间的胚转移至补充有头孢噻肟(250mg/l)以及硝酸银(1.6mg/l)(内格罗托(Negrotto)等人，《植物细胞报告》(PlantCellRep)19:798-803(2000))的LSDc培养基中并在黑暗中在28℃下培养10天。

将产生胚胎发生的愈伤组织的未成熟胚转移至LSD1M0.5S培养基(具有0.5mg/l2,4-D代替麦草畏的LSDc，10g/l甘露糖、5g/l蔗糖，并且没有硝酸银)中。在大约3周采用的传代培养的步骤在这种培养基上对培养物进行选择，持续大约6周。将残存的愈伤组织或者转移到LSD1M0.5S培养基中以大量生产或转移到Reg1培养基(如内格罗托(Negrotto)等人，《植物细胞报告》(PlantCellRep)19:798-803(2000)中所描述的)中。在光照中(16小时光照/8小时黑暗控制)进行培养之后，然后将绿色组织转移至没有生长调节剂的Reg2培养基(如内格罗托(Negrotto)等人，《植物细胞报告》(PlantCellRep)19:798-803(2000)中所描述的)，并孵育大约1至2周。将这些小植株转移至包含Reg3培养基(如内格罗托(Negrotto)等人，(2000)中描述的)的MagentaGA-7盒(MagentaCorp公司，芝加哥Ill.)中并使其在光照中生长。将对PMI是PCR阳性并且对大观霉素是阴性的植物转移至土壤中并使其在温室中生长。收集选择事件的植物样品以用于GUS组织化学分析。

实例4.GUS分析

使用被转化为MU(甲基伞形酮)和葡萄糖醛酸的MUG(甲基伞形基葡糖苷酸)作为底物，来进行定量GUS分析(或酶活性分析)，以便证明并且分析表达盒的转录调节特性。在碱性条件下，可以如在(比斯托(Bustos)1989)或类似文献中描述，荧光地定量监测这一转化(在365nm激发，在455nm测量；分光荧光计，赛默生命科学荧光扫描(ThermoLifeSciencesFluoroscan))。

确切地说，用于GUS酶活性的组织化学定位的方法如下：(1)取在第21天最新完全扩展的叶子；在R1阶段的穗叶作为样品；(2)在真空下浸透组织化学试剂持续30min，并且重复直至组织沉没；(3)在37℃，在黑暗中，在组织化学试剂中孵育组织48hr；(4)在70％乙醇中褪色至少48hr，直至背景澄清；并且(5)对组织拍照。

实例5.用于过表达和基因“敲除”实验的载体构建

设计用于在植物中表达感兴趣的全长“候选基因”的载体，以产生感兴趣的蛋白，并且这些载体具有两种一般类型，基因枪的(biolistic)和/或二元的，取决于待使用的植物转化方法。

对于基因枪转化(基因枪载体)，要求如下：

(A)具有细菌选择性标记(典型地，抗生素抗性基因)和在大肠杆菌(E.coli；例如ColE1)中功能性的复制起点的一个骨架，以及

(B)由以下项组成的植物特异性部分：

(1)表达盒，由以下项组成：本发明的转录调节核酸(例如SEQIDNO:1和/或SEQIDNO:10-28)，感兴趣的多核苷酸和转录终止子(例如根癌农杆菌nos终止子或优选地由SEQIDNO:30的核酸编码的终止子)；

(2)植物选择性标记盒，由以下各项组成：适合的启动子、选择性标记基因(例如D-氨基酸氧化酶；dao1)和转录终止子(例如nos终止子)。

被设计用于通过根癌农杆菌(A.tumefaciens)进行转化的载体(二元载体)由以下各项组成：

(A)一个骨架，该骨架具有在大肠杆菌和根癌农杆菌中功能性的细菌选择性标记(例如由aadA基因介导的大观霉素抗性)和在上述细菌宿主中的每一个中功能性的两个复制起点，加上根癌农杆菌virG基因；

(B)如对以上基因枪载体描述的一个植物特异性部分，除了在此实例中，这一部分的侧翼为根癌农杆菌右和左T-DNA边界序列，这些边界序列介导侧翼为这两个序列的DNA转移至植物基因组。

基因沉默载体

被设计用于降低或消除单个基因或一个家族的相关基因的表达的载体(基因沉默载体)也具有对应于用于下调基因表达的方法的两个一般类型：反义的或双链的RNA干扰(RNAi)。

(A)反义的

对于反义载体，一个全长的或部分的基因片段(典型地，一部分cDNA)可以作为基因表达盒的一部分，在针对全长表达所描述的相同载体中使用。对于基因表达的反义介导的下调，该基因或基因片段的编码区将处于相对于本发明的转录调节多核苷酸的相反取向；因此，在植物中(inplanta)，mRNA将由非编码的(反义的)链制成。

(B)RNAi

对于RNAi载体，一部分基因片段(典型地，300至500个碱基对长)被用于该基因表达盒，并且在正义和反义两个取向表达，由间隔子区(例如植物内含子，例如OsSH1内含子1或例如赋予卡那霉素抗性的可选择标记)隔开。设计这一类型的载体来形成双链mRNA茎，在植物中(inplanta)导致两个互补基因片段的碱基配对。

实例6.实验设计

表1中提供了实验设计。

表1.用于F1表征的实验设计和程序

选择每个构建体的三个代表性F1事件用于测试。

构建体：

(1)构建体18620(SEQIDNO:24)5’非转录序列、第1外显子、第1内含子、第2外显子的部分；TMV翻译增强子。

(2)构建体19678(SEQIDNO:25)5’非转录序列、第1外显子、第1内含子、第2外显子的部分(无eTMVΩ转录增强子)。

(3)构建体19710(SEQIDNO:26)5’非转录序列、第1外显子(无eTMVΩ转录增强子)。

(4)构建体19738(SEQIDNO:27)5’非转录序列、第1外显子、用iUbi1-13内含子替代的iAt1G22690、第二外显子的部分(无eTMVΩ转录增强子)。

(5)构建体19711(SEQIDNO:28)，对比实例1(国际专利公开案WO2008/134571A1的SEQIDNO:11)

实例7.载体构建体18620(SEQIDNO:24)的结果

测定使用构建体18620(SEQIDNO:24)制成的转基因植物的GUS表达。在V8或VT对T0植物进行取样。使用ELISA和qRT-PCR这二者来评估表达盒性能。数据汇总在表2中。

使若干事件的回交种子发芽并且通过接合性TaqMan确定性状基因的存在。保持若干性状阳性的姊妹株并且在不同发育阶段测定GUS活性(参见表1)。表2和4中示出的数据指示，在叶子样品中，一些GUS转录物和蛋白的存在。如通过qRT-PCR进行测量，与PMI转录物丰度相比，GUS转录物丰度非常低。这提示，与用于产生植物选择性标记蛋白的玉蜀黍泛素1盒相比，保卫细胞表达盒在远远更少的细胞中具有活性。

组织化学定位数据指示，GUS蛋白在保卫细胞中累积。组织化学沉淀物难以检测到(未示出)，提示非常低的蛋白表达。我们检查了其他植物部分的GUS累积，并且发现，该蛋白还出现在正发育的谷粒中。该数据提示，存在适度的GUS酶活性，所以我们在谷粒与穗叶中量化了蛋白累积。数据汇总在表3和表5中。

表2.在选择的18620植物中，在V8和VT阶段，在T0叶子样品中GUS表达的概述。

表3.在从18620植物中在R3取样的T1谷粒中的GUS蛋白。

表5.在选择的18620植物中，在R1取样的T1穗叶中，GUS表达的概述。

总之，18620表达盒(SEQIDNO:13)驱动GUS蛋白在叶子保卫细胞中特异性地累积，然而，组织化学定位数据指示，GUS蛋白并不是存在于每一个保卫细胞中。在不同的T1组织，例如苞叶、穗轴、茎、根、穗和谷粒中，研究了在其他组织中的表达。在穗轴和谷粒中检测到GUS蛋白。

实例8.载体构建体19678(SEQIDNO:25)的结果

测定使用构建体19678(SEQIDNO:25)制成的转基因植物的GUS表达。在V3或R1对T0植物进行取样。使用ELISA和qRT-PCR这二者来评估表达盒性能。数据汇总在表6和7中。

使若干事件的回交种子发芽并且通过接合性TaqMan确定性状基因的存在。保持若干性状阳性的姊妹株并且在不同发育阶段测定GUS活性(参见表1)。表8和9中示出的数据指示，在叶子样品中，一些GUS转录物和蛋白的存在。如通过qRT-PCR进行测量，与PMI转录物丰度相比，GUS转录物丰度非常低。这提示，与用于产生植物选择性标记蛋白的玉蜀黍泛素1盒相比，保卫细胞表达盒在远远更少的细胞中具有活性。

我们的组织化学定位数据指示，GUS蛋白在保卫细胞中累积。组织化学沉淀物难以检测到(未示出)，提示非常低的蛋白表达。我们检查了其他植物部分的GUS累积，并且发现，该蛋白还出现在正发育的谷粒中。

表6.在选择的19678植物中，在V3取样的T0叶子中，GUS表达的概述。

表7.在选择的19678植物中，在R1取样的T0穗叶中，GUS表达的概述。

表9.在选择的19678中，在R1取样的T1穗叶中，GUS表达的概述。

总之，19678构建体(SEQIDNO:25)驱动GUS蛋白在叶子保卫细胞中特异性累积，然而，组织化学定位数据指示，GUS蛋白并不是存在于每一个保卫细胞中。表达谱类似于构建体18620(SEQIDNO:25)。定量证据提示，消除烟草花叶病毒Ω翻译增强子增加了GUS蛋白积累2-3倍。在不同的T1组织，例如苞叶、穗轴、茎、根、穗和谷粒中，研究了在其他组织中的表达。在穗轴和谷粒中检测到GUS蛋白。

实例9.载体构建体19738(SEQIDNO:27)的结果

测定使用构建体19738(SEQIDNO:27)制成的转基因植物的GUS表达。在V3或R1对T0植物进行取样。使用ELISA和qRT-PCR这二者来评估表达盒性能。数据汇总在表10和表11中。

使若干事件的回交种子发芽并且通过接合性TaqMan确定性状基因的存在。保持若干性状阳性的姊妹株并且在不同发育阶段测定GUS活性(参见表1)。表12和表13中示出的数据指示，在叶子样品中，一些GUS转录物和蛋白的存在。如通过qRT-PCR进行测量，与PMI转录物丰度相比，GUS转录物丰度低。这提示，与用于产生植物选择性标记蛋白的玉蜀黍泛素1盒相比，保卫细胞表达盒在更少的细胞中具有活性。

组织化学定位数据指示，GUS蛋白在保卫细胞连同其他细胞中累积。组织化学沉淀物易于检测到(未示出)，提示适度的蛋白表达。我们检查了其他植物部分的GUS累积，并且发现，该蛋白还出现在其他组织，包括苞叶、穗轴、茎、根、穗和谷粒中。

表10.在选择的19738植物中，在V3取样的T0叶子中，GUS表达的概述。

表11.在选择的19738植物中，在R1取样的T0穗叶中，GUS表达的概述。

表13.在选择的19738植物中，在R1取样的T1穗叶中，GUS表达的概述

总之，19738表达盒(SEQIDNO:27)驱动GUS蛋白在叶子保卫细胞连同其他细胞中累积。组织化学定位数据指示，GUS蛋白几乎存在于每一个保卫细胞中(未示出)。定量证据提示，用玉蜀黍泛素1内含子取代At1G22690内含子增加了GUS蛋白累积若干倍。它还增加了在其他组织中的表达。在不同T1组织，例如苞叶、穗轴、茎、根、穗和谷粒中，研究了这一点。在所有检查的组织中检测到GUS蛋白。

实例10.载体构建体19710(SEQIDNO:26)的结果

测定使用构建体19710(SEQIDNO:26)制成的转基因植物的GUS表达。在V3或R1对T0植物进行取样。使用ELISA和qRT-PCR这二者来评估表达盒性能。数据汇总在表14和表15中。

使若干事件的回交种子发芽并且通过接合性TaqMan确定性状基因的存在。保持若干性状阳性的姊妹株并且在不同发育阶段测定GUS活性(参见表1)。表16中示出的数据指示，在叶子样品中，几乎没有GUS转录物和蛋白存在。如通过qRT-PCR进行测量，与PMI转录物丰度相比，GUS转录物丰度极其低。这提示，与用于产生植物选择性标记蛋白的玉蜀黍泛素1盒相比，保卫细胞表达盒在更少的细胞中具有活性。

组织化学定位数据指示，在保卫细胞或其他细胞中，没有可检测的GUS蛋白累积(未示出)。我们检查了其他植物部分的GUS累积，并且发现，没有该蛋白出现在其他组织(包括苞叶、穗轴、茎、根、穗和谷粒)中的证据。

表14.在选择的19710植物中，在V3取样的T0叶子中，GUS和PMI表达的概述。

表15.在选择的19710植物中，在R1取样的T0穗叶中，GUS表达的概述

表16.在选择的19710植物中，在V3取样的T1叶子中，GUS和PMI表达的概述

总之，19710表达盒(SEQIDNO:26)在玉蜀黍中是基本上灭活的。证据提示，从该表达盒消除At1G22690内含子，使得该构建体在玉蜀黍中是非功能性的。并未超越V3进行表达分析。

实例11.对比实例1-载体构建体19711(SEQIDNO:28)

测定使用构建体19711(SEQIDNO:28)制成的转基因植物的GUS表达。在V3或R1对T0植物进行取样。使用ELISA和qRT-PCR这二者来评估表达盒性能。数据汇总在表17和表18中。

使若干事件的回交种子发芽并且通过接合性TaqMan确定性状基因的存在。保持若干性状阳性的姊妹株并且在不同发育阶段测定GUS活性(参见表1)。表19和表20中示出的数据指示，在叶子样品中，几乎没有GUS转录物和蛋白存在。如通过qRT-PCR进行测量，与PMI转录物丰度相比，GUS转录物丰度极其低。这提示，与用于产生植物选择性标记蛋白的玉蜀黍泛素1盒相比，保卫细胞表达盒在更少的细胞中具有活性。

表17.在选择的19711植物中，在V3取样的T0叶子中，GUS和PMI表达的概述

表18.在选择的19711植物中，在R1取样的T0穗叶中，GUS表达的概述

表20.在R1阶段的穗叶GUSELISA

总之，19711表达盒(SEQIDNO:28)在叶子保卫细胞中不产生GUS累积。定量证据提示，在拟南芥属和烟草中工作的这一启动子的原初型式在玉蜀黍中并不发挥功能。在不同的T1组织，例如苞叶、穗轴、茎、根、穗和谷粒中，研究了在其他组织中的表达。在茎、穗轴和谷粒中检测到GUS蛋白。

以上所述情形是用作说明本发明的，并且不应当解释为本发明的限制。本发明是由以下权利要求书所定义的，这些权利要求的等效物被包括在其中。

Claims

1.一种重组多核苷酸，该重组多核苷酸包括一种选自下组的核酸，该组由以下各项组成

(a)SEQIDNO:1的核酸；以及

(b)与(a)的核酸的全长相比，至少约95％一致的核酸。

2.如权利要求1所述的重组多核苷酸，其中该重组多核苷酸被可操作地连接至一个感兴趣的多核苷酸。

3.一种重组多核苷酸，该重组多核苷酸包括一种以下核酸，该核酸与SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28的全长上具有至少90％一致性。

4.一种重组多核苷酸，该重组多核苷酸包括一种选自下组的核酸，该组由以下各项组成：SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、和SEQIDNO:28。

5.一种表达盒，该表达盒包括选自下组的一种重组多核苷酸，该组由以下各项组成：如权利要求1所述的重组多核苷酸、如权利要求3所述的重组多核苷酸、和如权利要求4所述的重组多核苷酸。

6.一种表达盒，该表达盒包括如权利要求1所述的重组多核苷酸。

7.如权利要求6所述的表达盒，其中该重组多核苷酸被可操作地连接到至少一个内含子。

8.如权利要求7所述的表达盒，其中该内含子是选自下组，该组由以下各项组成：SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8的核酸。

9.如权利要求6所述的表达盒，其中该重组多核苷酸被可操作地连接到至少一个内含子和至少一个外显子。

10.如权利要求6所述的表达盒，其中该重组多核苷酸被可操作地连接到至少一个内含子、至少一个外显子、和至少一个增强子。

11.如权利要求6所述的表达盒，其中该重组多核苷酸被可操作地连接至一个感兴趣的多核苷酸。

12.如权利要求11所述的表达盒，其中该感兴趣的多核苷酸编码一种脱落酸受体或一种修饰的脱落酸受体。

13.如权利要求6所述的表达盒，进一步包括选自下组的一个增强子，该组由以下各项组成：一个Kozak序列和一个TMVΩ翻译增强子。

14.一种细胞，该细胞包含一种选自下组的重组多核苷酸，该组由以下各项组成：如权利要求1所述的重组多核苷酸、如权利要求3所述的重组多核苷酸、和如权利要求4所述的重组多核苷酸。

15.如权利要求14所述的细胞，其中该细胞是一种植物细胞或一种细菌细胞。

16.一种植物或植物部分，该植物或植物部分包含一种选自下组的重组多核苷酸，该组由以下各项组成：如权利要求1所述的重组多核苷酸、如权利要求3所述的重组多核苷酸、和如权利要求4所述的重组多核苷酸。

17.一种在植物的保卫细胞中表达感兴趣的多核苷酸的方法，该方法包括

将一种选自下组的重组多核苷酸引入一种植物中，该组由以下各项组成：如权利要求1所述的重组多核苷酸、如权利要求3所述的重组多核苷酸、和如权利要求4所述的重组多核苷酸；并且

表达该感兴趣的多核苷酸。

18.如权利要求17所述的方法，其中在该保卫细胞中的该感兴趣的多核苷酸的表达是特异性的或优先的。

19.如权利要求17所述的方法，其中该感兴趣的多核苷酸编码一种脱落酸受体或一种修饰的脱落酸受体。

20.一种在植物的保卫细胞中表达感兴趣的多核苷酸的方法，该方法包括

将一种选自下组的重组多核苷酸转化进一种植物细胞中，该组由以下各项组成：如权利要求1所述的重组多核苷酸、如权利要求3所述的重组多核苷酸、和如权利要求4所述的重组多核苷酸，并且

使该植物细胞再生为用所述重组多核苷酸稳定地转化的一种植物和/或植物部分，其中在所述经稳定地转化的植物和/或植物部分的保卫细胞中表达该感兴趣的多核苷酸。

21.一种通过如权利要求17所述的方法产生的植物和/或植物部分。

22.一种通过如权利要求20所述的方法产生的植物和/或植物部分。

23.一种种子，该种子包含一种选自下组的重组多核苷酸，该组由以下各项组成：如权利要求1所述的重组多核苷酸、如权利要求3所述的重组多核苷酸、和如权利要求4所述的重组多核苷酸。

24.一种作物，该作物包括多种植物或其子代，这些植物包含一种选自下组的重组多核苷酸，该组由以下各项组成：如权利要求1所述的重组多核苷酸、如权利要求3所述的重组多核苷酸、和如权利要求4所述的重组多核苷酸，其中所述子代是一种转基因植物，一起栽种在农田中。

25.一种产生自如权利要求21所述的植物的产物。

26.一种产生自如权利要求22所述的植物的产物。

27.一种重组多核苷酸，该重组多核苷酸包括一种选自下组的核酸，该组由以下各项组成

SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8的核酸。