CN105044270A

CN105044270A - 呼吸衰竭外周血单个核细胞蛋白质图谱模型的构建方法

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Publication number: CN105044270A
Application number: CN201510431772.5A
Authority: CN
Inventors: 孙国平; 戴勇; 朱鹏
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-07-21
Filing date: 2015-07-21
Publication date: 2015-11-11
Anticipated expiration: 2035-07-21
Also published as: CN105044270B

Abstract

一种呼吸衰竭外周血单个核细胞蛋白质图谱模型的构建方法，其包括如下步骤：设置疾病组与健康对照组，每组包括若干份相异人体的已经脱离人体的外周血单个核细胞标本；分别根据外周血单个核细胞标本获取细胞总蛋白；将细胞总蛋白经蛋白质酶解后，用相对和绝对定量的等量异位标签标记，得到具有相对和绝对定量的等量异位标签多重标记的多肽；将得到的多肽经强阳离子交换和反相液相色谱分离，再进行串联质谱分析和相对定量分析，选择超过预设阈值的表达显著差异蛋白，得到所述呼吸衰竭外周血单个核细胞蛋白质图谱模型。上述构建方法，为呼吸衰竭的诊断和治疗提供新的方法和依据，有助于开发临床诊断试剂盒和临床治疗药物。

Description

呼吸衰竭外周血单个核细胞蛋白质图谱模型的构建方法

技术领域

本发明涉及疾病研究领域，特别是涉及一种呼吸衰竭外周血单个核细胞蛋白质图谱模型的构建方法。

背景技术

呼吸衰竭(Respiratoryfailure,RF)是气体交换功能严重障碍导致的呼吸系统紊乱的临床综合征。通常情况下，呼吸衰竭的临床评估指标是指在海平大气压下，动脉血氧分压(PaO₂)＜8kPa(60mmHg)，或伴有二氧化碳分压(PaCO₂)＞6.0kPa(45mmHg)。呼吸系统包括肺和呼吸泵。由肺部引起的各种疾病导致的肺功能障碍会造成低血氧症(I型呼吸衰竭)，而呼吸泵功能障碍会导致高碳酸血症(Ⅱ型呼吸衰竭)。

有必要对呼吸衰竭的致病机理进行研究，以寻找新的分子靶点和治疗方法。

发明内容

基于此，有必要针对上述问题，提供一种呼吸衰竭外周血单个核细胞蛋白质图谱模型的构建方法。

一种呼吸衰竭外周血单个核细胞蛋白质图谱模型的构建方法，包括如下步骤：

设置疾病组与健康对照组，每组包括若干份相异人体的已经脱离人体的外周血单个核细胞标本；

分别根据外周血单个核细胞标本获取细胞总蛋白；

将所述细胞总蛋白经蛋白质酶解后，用相对和绝对定量的等量异位标签标记，得到具有相对和绝对定量的等量异位标签多重标记的多肽；

将得到的多肽经强阳离子交换和反相液相色谱分离，再进行串联质谱分析和相对定量分析，选择超过预设阈值的表达显著差异蛋白，得到所述呼吸衰竭外周血单个核细胞蛋白质图谱模型。

在其中一个实施例中，采用二级串联质谱进行质谱分析。

在其中一个实施例中，所述质谱分析的电离源为电喷雾电离源。

在其中一个实施例中，将所述细胞总蛋白经蛋白质酶解前，还包括：将所述细胞总蛋白进行SDS电泳。

在其中一个实施例中，采用浓度为12％的SDS聚丙烯酰胺凝胶进行SDS电泳。

在其中一个实施例中，加入胰蛋白裂解酶将所述细胞总蛋白酶解。

在其中一个实施例中，所述细胞总蛋白与胰蛋白裂解酶的质量比20：1。

在其中一个实施例中，所述细胞总蛋白与胰蛋白裂解酶的质量比22：1。

在其中一个实施例中，所述预设阈值为超过一个预设正常范围的最大值、以及小于所述预设正常范围的最小值。

在其中一个实施例中，进行串联质谱分析和相对定量分析之后，还选取超过0.67至1.50范围的结果进行报告。

上述构建方法应用iTRAQ联合LC-MS/MS技术能较好的进行呼吸衰竭的差异蛋白组学分析，能够一次性筛选出824种与呼吸衰竭相关的差异蛋白，并能对其进行定性及相对定量，对筛选出的差异蛋白进行生物信息学分析，还能了解其参与的生物学过程及代谢通路，为呼吸衰竭的发病机制提供新的线索，且筛选得到的显著表达差异的蛋白有望成为潜在的呼吸衰竭生物标志物。

附图说明

图1为呼吸衰竭外周血单个核细胞蛋白质图谱模型的构建方法流程图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

本实施例提供了一种呼吸衰竭外周血单个核细胞蛋白质图谱模型的构建方法，其具体包括如下步骤：

设置疾病组与健康对照组，每组包括若干份相异人体的已经脱离人体的外周血单个核细胞标本；分别对各所述外周血单个核细胞标本进行细胞总蛋白抽提和蛋白浓度测定；将所述细胞总蛋白经蛋白质酶解后，用相对和绝对定量的等量异位标签标记，得到具有相对和绝对定量的等量异位标签多重标记的多肽；将得到的多肽经强阳离子交换和反相液相色谱分离，再进行串联质谱分析和相对定量分析，选择超过预设阈值的表达显著差异蛋白，得到所述呼吸衰竭外周血单个核细胞蛋白质图谱模型。例如，所述呼吸衰竭单个核细胞蛋白质图谱模型，包括分类号为gi|58257696、gi|182443、gi|193244949、gi|62088878、gi|229959、gi|284521122及gi|28332的表达上调蛋白及分类号为gi|809369、gi|431896311、gi|406717976、gi|206581665及gi|122939159的表达下调蛋白。

下面主要结合附图及具体实施例对呼吸衰竭外周血单个核细胞蛋白质图谱模型的构建方法作进一步的说明。

例如，采用如下主要试剂：TritonX-100(AmershamBiosciences)，Strata-X33u(Phenomenex)，BCA蛋白试剂盒(Pierce)，三乙基碳酸氢铵缓冲液(Sig-ma-Aldrich)，ZipTip枪头和超纯水(Millipore)，8种不同同位素标记的iTRAQ试剂(AppliedBiosystems)，质谱级胰蛋白酶胶体金(Promega)。其中，iTRAQ(IsobaricTagsforRelativeandAbsoluteQuantitation)，同位素标记的相对与绝对定量技术)试剂及使用是ABI公司的一项新的体外同位素标记技术，使用该技术可以对一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂的混合体系中的所有蛋白质进行精确定量和鉴定。

下面，采用两组全血标本对本方法进行说明，全血标本包括5名呼吸衰竭患者(疾病组)和5名健康人群(健康对照组)，标本均来自深圳市人民医院，标本采集时间为2013年4月至2013年10月。RF组呼吸衰竭患者均是通过病理诊断及临床标准确诊的Ⅱ型呼吸衰竭，包括4名女性和1名男性，平均年龄为35.22岁(28-45岁)，而健康对照组在种族、年龄和性别上均与RF组相匹配，见表1。标本收集的方案与执行均获得深圳市人民医院伦理委员会的批准。

表1呼吸衰竭标本特征(n＝5)

操作流程如图1所示，具体说明如下。

首先准备样品，将人体外周血单个核细胞分离，例如采用密度梯度离心法或细胞比重法等分离人体外周血单个核细胞，例如采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离人体外周血单个核细胞；又如采低渗盐水法、氯化铵溶红细胞法等分离人体外周血单个核细胞。下面示例说明分离步骤如下：

(1)、收集肝素抗凝全血约5mL，用等量的PBS(Phosphatebuffersaline，磷酸盐缓冲液)稀释，将稀释后的血液轻置于分离液的上层，并于22℃、14,000rpm条件下离心10min；

(2)、弃掉上层血浆，吸取中间层的单个核细胞置于另一试管中，加入5mlPBS，混匀，洗涤，然后于22℃、14,000rpm条件下离心5min；

(3)、弃掉上清液，重复步骤(2)一次；

(4)、弃上清液，将管底的细胞沉淀悬浮于100μL的PBS中，用血球计数板在显微镜下进行细胞计数后转入1.5mL的EP管中备用，并置于-80℃保存。

然后测定细胞总蛋白抽提和蛋白浓度，下面给出一个具体的实例。

(1)、加入适量蛋白裂解液溶解，例如，按1×10⁶个细胞加入约100μL蛋白裂解液的比例加入，然后分别加入1mmolPMSF(苯甲基磺酰氟)和2mmol的EDTA(乙二胺四乙酸二钠)，反应5分钟后加入10mmol的DTT(二巯基苏糖醇)，接着进行15min的超声，然后在25,000rpm条件下离心20min，取上清液。上清液中加入5倍体积的预冷丙酮，即预冷丙酮的体积为上清液的5倍，例如将丙酮预冷至-20至-5摄氏度，转移至-20℃静置沉淀2h，然后在16,000rpm条件下离心20min，弃上清。取适量沉淀重复以上步骤后，将沉淀在200μL0.5mol的TEAB(四乙基溴化铵)中超声溶解15min，然后在25,000rpm的条件下离心20min后，取上清液用于定量。

(2)、采用BCA蛋白定量试剂盒，以BSA(BovineSerumAlbumin，牛血清白蛋白)为标准品，制定BSA标准品的标准曲线，准备0、2、4、6、8、10、12、14、16、18μL的标准品量(0.2μg/μLBSA)，然后添加纯水至最终体积为20μL。将0μL作为空白对照，然后把样品的上清液稀释一定倍数至测量范围内，每个样品各取20μL至管中，再分别加入180μL的蛋白测试试剂，混匀后置于室温10min。然后在595nm下用酶标仪测定其吸光度，根据标准曲线得出样品浓度。

然后进行SDS电泳，例如，配置12％的SDS聚丙烯酰胺凝胶，将样品分别与4倍体积的loadingbuffer混匀，然后置于95℃下加热5min，分别吸取30μg的样品以及10μg的Marker在浓度为12％的SDS聚丙烯酰胺凝胶下电泳120min，电泳结束后，用考马斯亮蓝染液染色2h，再置于脱色液中脱色3-5次。优选的，电泳结束后，在30至36摄氏度环境下，用考马斯亮蓝染液染色2h。例如，通过水浴方式，在30至36摄氏度环境下，用考马斯亮蓝染液染色2h。这样，在染色时，可以保持考马斯亮蓝染液染色的效率，提高染色效果，理想情况下可检出1～0.1μg蛋白。优选的，在染色之前，还包括步骤：过滤所述考马斯亮蓝染液；又如，在染色之前，预先将考马斯亮蓝染液升温至25至30摄氏度。这样，可以获得较好的染色效果。优选的，在脱色液中脱色3次，第一次脱色的时间大于第三次脱色的时间，第三次脱色的时间大于第二次脱色的时间；优选的，第一次脱色之前，将脱色液的温度预热至染色的环境温度，并且，脱色液的温度不高于36摄氏度；优选的，第二次脱色之前，将脱色液的温度预热至33～36摄氏度。优选的，脱色液中的甲醇与冰醋酸的摩尔比为4～4.5:1。这样，可以获得较好的脱色效果。

然后进行蛋白质酶解，例如，每组精确取出100μg蛋白，蛋白：酶按质量比为20：1的比例加入Trypsin(胰蛋白)裂解酶，置于37℃下酶解4h，再按照相同的比例加入Trypsin裂解酶，置于37℃下酶解8h。又如，按照细胞总蛋白与胰蛋白裂解酶的质量比为22：1加入胰蛋白裂解酶，并置于37℃酶解6h，再按照细胞总蛋白与胰蛋白酶的质量比为18：1加入胰蛋白酶裂解酶，并置于37℃酶解8h。

然后进行iTRAQ标记，例如，待胰蛋白裂解酶消化后，用真空离心泵抽干肽段，接着用0.5mol的TEAB复溶肽段，然后按照iTRAQ操作手册对肽段进行iTRAQ标记，置于室温下培养2h后，将所有标记样品进行混合，真空干燥。

然后进行强阳离子交换，例如，用4mL上样缓冲液A(25mMKH₂PO₄，pH2.7)复溶iTRAQ标记后抽干的混合肽段，然后将肽段装入强阳离子交换预装柱(4.6×250mm，UltremexSCX)，进行自动梯度洗脱，流速设定为1mL/min。优选的，在5至10摄氏度下进行自动梯度洗脱。例如，采用上样缓冲溶液A洗脱10min，再逐渐混入5％～35％的上样缓冲液B(25mMKH₂PO₄，1mmol/LKCl，pH2.7)洗脱11min，最后逐渐混入35％～80％的上样缓冲液B洗脱1min。又如，经过强阳离子交换后，进行冷冻抽干。

然后进行反相液相色谱分离及质谱分析，例如，用bufferA(5％乙腈，0.1％甲酸)将抽干的每个组分复溶至浓度约为0.5μg/μL，在20,000rpm的条件下离心10min，除去不溶物质。每个组分上样5μL(约2.5μg蛋白)，通过岛津公司纳升液相色谱仪(LC-20AD)分离。分离程序如下：先将样品装载到Trap柱上，流速控制在8μL/min，然后将样品带入分析柱，总流速控制在300nL/min，接着分离后传输到质谱系统。

样品先用浓度为5％bufferB(95％乙腈，0.1％甲酸)进行5min的洗脱，然后进行35min的线性梯度，将bufferB的比例上升到35％的浓度，并且逐渐让bufferB浓度提高到60％，最后将其浓度提高到80％并且保持2min，接着在1min的时间内慢慢的将bufferB浓度恢复到5％并且保持10min。然后将以上被液相分离后的肽段转移到串联ESI质谱仪：Q-EXACTIVE(ThermoFisherScientific,SanJose,CA)。质谱分辨率设置为：一级分别率70000，二级分辨率17500。例如，质谱检测时，仪器的参数设置如下：离子源喷雾电压2.5kV，氮气压力为30psi，喷雾气压为15psi，喷雾接口处温度为150℃，扫描模式为反射模式。

然后进行数据库检索。例如，首先，通过Mascotversion2.3.02(MatrixScience,London,UK)软件对质谱分析后的原始文件，进行峰识别，整理获得所需的峰列表。其次，将峰列表中对应的肽段通过NCBI数据库搜索，建立起参考数据库，进行肽段及蛋白质的鉴定。最后比较各蛋白在各样品之间的相对含量的关系，以报告基团为参照，选择超过预设阈值的表达显著差异蛋白，例如，所述预设阈值为超过一个预设正常范围的最大值、以及小于所述预设正常范围的最小值。例如，所述预设阈值为90％或者95％，又如，所述预设阈值为0.67～1.50；例如，所述预设阈值为95％，如选择差异显著(P≤0.05)，对阈值＞1.50或＜0.67的结果进行报告，即得到差异蛋白。然后用基因本体论(GeneOntology,GO)阐明差异表达蛋白的分子功能(molecularfunction,MF)、生物过程(biologicalprocess,BP)和细胞组件(cellularcomponent,CC)。

通过质谱鉴定，鉴定到特有肽段序列数量为19771，蛋白质数量为4795，请参见表2。

表2质谱鉴定结果统计

将鉴定到的蛋白质作进一步的分析，得出呼吸衰竭(RF)组和健康对照组之间的差异蛋白有824种，其中表达上调的差异蛋白有403种，表达下调的差异蛋白有421种。

优选的，所述构建方法，所述预设正常范围为0.13至18，即以阈值＞18或＜0.13的结果作为表达显著差异蛋白，得出表达上调的差异蛋白中阈值＞18的有7个蛋白，表达下调的差异蛋白中阈值＜0.13的有5个蛋白，并且对它们进行GO分析，得到如下结果：

表3表达上调的差异蛋白中阈值＞18的蛋白及GO分析

表4表达下调的差异蛋白中阈值＜0.13的蛋白及GO分析

通过对呼吸衰竭患者即疾病组和健康对照组比较鉴定到的4795总蛋白进行GO分析，可以得到这些蛋白质的功能分布图，其中，这些蛋白在分子功能(MF)中，起结合活性作用占48.71％，起催化活性作用的占28.68％。

由上述结果各组对照实验中表达上调蛋白和表达下调蛋白，即构成了呼吸衰竭外周血单个核细胞蛋白质表达差异图谱模型。该模型包括403个蛋白表达上调和421个蛋白下调。进一步地，根据差异显著性，呼吸衰竭患者组与健康对照组的阶段性蛋白表达差异图谱，由分类号为其包括分类号为gi|58257696、gi|182443、gi|193244949、gi|62088878、gi|229959、gi|284521122及gi|28332的表达上调蛋白及分类号为gi|809369、gi|431896311、gi|406717976、gi|206581665及gi|122939159的表达下调蛋白组成。进一步地，呼吸衰竭患者组与健康对照组的阶段性蛋白表达差异图谱，由分类号为其包括分类号为gi|58257696及gi|182443的表达上调蛋白及分类号为gi|809369及gi|431896311的表达下调蛋白组成。

其中，各所述分类号为InternationalProteinIndexhumanV3.62蛋白数据库中的蛋白分类号。或者，各所述分类号在上述数据库中所分别对应的蛋白，为后续蛋白数据库中的分类号相对应的蛋白。

通过采用iTRAQ标记联合LC-MS/MS相关技术对呼吸衰竭患者外周血单个核细胞总蛋白进行鉴定和比较蛋白组学相对定量分析，共鉴定了824个蛋白，其中有4个蛋白显著差异表达，表明将iTRAQ标记串联质谱技术用于呼吸衰竭患者外周血单个核细胞的比较蛋白组学分析是一种行之有效的方法。

综上所述，上述构建方法应用iTRAQ联合LC-MS/MS技术能进行呼吸衰竭的差异蛋白组学分析，能够一次性筛选出824种与呼吸衰竭相关的差异蛋白，并能对其进行定性及相对定量，对筛选出的差异蛋白进行生物信息学分析，还能了解其参与的生物学过程及代谢通路，为呼吸衰竭的发病机制提供新的线索，且筛选得到的显著表达差异的蛋白有望成为潜在的呼吸衰竭生物标志物。

采用上述呼吸衰竭外周血单个核细胞蛋白表达差异图谱的构建方法，在“整体”蛋白组范围内对呼吸衰竭患者外周血单个核细胞的“全组”蛋白进行鉴定、比较和相对定量分析，建立呼吸衰竭患者外周血单个核细胞蛋白的“全组信息”，并绘制出呼吸衰竭特异性蛋白图谱，构建图谱模型，为进一步阐明呼吸衰竭的发病机制，为呼吸衰竭的诊断和治疗提供新的方法和依据，并有助于作为新靶点开发临床诊断试剂盒和临床治疗药物。

需要补充的是，本发明的直接目的不是获得诊断结果或健康状况，而只是对已经脱离人体的体液，即外周血，进行处理或检测以获取作为中间结果的信息的方法，或处理该信息的方法，根据目前的医学知识和本发明所公开的内容，从所获得的信息本身不能够直接得出疾病的诊断结果。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种呼吸衰竭外周血单个核细胞蛋白质图谱模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

分别根据外周血单个核细胞标本获取细胞总蛋白；

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，采用二级串联质谱进行质谱分析。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述质谱分析的电离源为电喷雾电离源。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，将所述细胞总蛋白经蛋白质酶解前，还包括：将所述细胞总蛋白进行SDS电泳。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，采用浓度为12％的SDS聚丙烯酰胺凝胶进行SDS电泳。

6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，加入胰蛋白裂解酶将所述细胞总蛋白酶解。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述细胞总蛋白与胰蛋白裂解酶的质量比20：1。

8.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述细胞总蛋白与胰蛋白裂解酶的质量比22：1。

9.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述预设阈值为超过一个预设正常范围的最大值、以及小于所述预设正常范围的最小值。

10.根据权利要求9所述的构建方法，其特征在于，进行串联质谱分析和相对定量分析之后，还选取超过0.67至1.50范围的结果进行报告。