CN105037512B - 一种耐久肠球菌素突变体、制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种耐久肠球菌素突变体、制备方法及其应用，涉及食品领域。耐久肠球菌素突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明还要求保护所述耐久肠球菌素突变体的编码基因、制备方法及其应用。所述制备方法，包括如下步骤：将携带有耐久肠球菌素突变体编码基因的载体导入宿主菌，诱导所述宿主菌表达耐久肠球菌素突变体。本发明耐久肠球菌素突变体具有较高活性和稳定性，制备方法简单，有望应用于食品级防腐剂领域中。

Description

一种耐久肠球菌素突变体、制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及食品领域，具体涉及一种耐久肠球菌素突变体、制备方法及其应用。
背景技术
乳酸菌细菌素是一类乳酸菌代谢过程中由核糖体合成并分泌到环境中具有抑菌活性的蛋白质或多肽，在食品保藏中极具重要意义。自乳酸链球菌素Nisin商业应用以来，细菌素的研究开发一直是相关领域的热点。耐久肠球菌素Durancin GL(GenBank：HQ696461.1)是从西班牙干酪中分离的耐久肠球菌41D株所产生的新型细菌素，尤其对李斯特菌等食源性人体致病菌具有靶向抑制作用(Du,Lihui，Somkuti,George A.，Renye,JohnA.,Jr.，Huo,Guicheng.Journal of Food Safety,2012,32(1):74-83.)。但是，耐久肠球菌素Durancin GL活性较低。耐久肠球菌素Durancin GL的生物合成基因(GenBank登录号HQ696461.1)包括结构基因(durA)和免疫基因(durB)，其中结构基因编码耐久肠球菌素Durancin GL前体，免疫基因编码耐久肠球菌素Durancin GL的免疫蛋白以防止表达的细菌素对宿主的伤害。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有较高活性的耐久肠球菌素突变体。
本发明的另一目的在于提供耐久肠球菌素突变体的编码基因。
本发明的再一目的在于提供耐久肠球菌素突变体的制备方法及其在食品级防腐剂中的应用。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
耐久肠球菌素突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明还要求保护所述耐久肠球菌素突变体的编码基因。
优选的技术方案中，所述编码基因的序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明还要求保护含有所述编码基因的表达盒、重组载体、重组菌或细胞系。
本发明还要求保护制备所述耐久肠球菌素突变体的方法，包括如下步骤：将携带有耐久肠球菌素突变体编码基因的载体导入宿主菌，诱导所述宿主菌表达耐久肠球菌素突变体。
本发明还要求保护所述耐久肠球菌素突变体在制备食品级防腐剂方面的应用。
本发明耐久肠球菌素突变体具有较高活性和稳定性，制备方法简单，有望应用于食品级防腐剂领域中。
附图说明
图1突变质粒的PCR鉴定电泳结果，M为DS 5000 DNA Marker，1为突变质粒的PCR产物。
图2DE3-pGEX-durAB-K21A的PCR鉴定电泳分析，M为DS 5000 DNAMarker，1为DE3-pGEX-durAB-K21A的PCR产物。
图3耐久肠球菌素Durancin GL及其突变体K21A的抑菌活性，其中1是耐久肠球菌素Durancin GL抑菌圈，2为耐久肠球菌素突变体K21A抑菌圈。
图4耐久肠球菌素突变体K21A稳定性。
图5耐久肠球菌素Durancin GL的稳定性。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步阐述。
实施例1
耐久肠球菌素Durancin GL成熟肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。其前体带有信号肽，编码基因如SEQ ID NO:4所示。本实施例描述将SEQ ID NO:1中第21位的赖氨酸(K)采用丙氨酸(A)取代制备耐久肠球菌素突变体(命名为K21A)的具体方法。耐久肠球菌素突变体K21A的氨基酸序列如SEQ ID NO:2，编码基因的序列如SEQ ID NO:3所示。
1.扩增细菌素融合基因片段
为了便于纯化和表达，设计引物扩增制备由His标签、肠激酶酶切位点、耐久肠球菌素Durancin GL的成熟肽编码基因(SEQ ID NO:4去除信号肽后的第85-216位核苷酸片段)和免疫基因(durB，GenBank登录号HQ696461.1)组成的细菌素融合基因片段。
针对耐久肠球菌素Durancin GL的成熟肽编码基因和免疫基因，设计引物dur1(SEQ ID NO:5)和dur2(SEQ ID NO:6)，其中引物dur1带有His标签和肠激酶酶切位点。
dur1的序列为:5'-GTGGGATCCC ACCATCATCA TCATCATGAC GACGACGACAAGGCAACTTATTATGGAAAT GGTGTTTATT G-3'，
dur2的序列为:5'-AAACTCGAGT TTAACTCCAA ATACCGATAG ACGCCCATCCCC-3'。
以耐久肠球菌41D株新鲜过夜培养菌液为模板，以dur1和dur2为引物，扩增含有耐久肠球菌素Durancin GL的成熟肽编码基因和免疫基因的细菌素融合基因片段。将2.0μl耐久肠球菌41D株过夜培养的菌液与25.0μlHSTM Mix(购自TaKaRa)、1.0μl dur1、1.0μl dur2和21.0μl ddH2O混合后，在PCR仪(Applied Biosystems)中按照下列程序进行反应：升温至95℃维持30s；95℃变性15s，62℃退火20s，72℃延伸60S，反应30个循环；降温至72℃维持7min。
2.构建携带细菌素融合基因片段的重组载体
采用多功能DNA纯化回收试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)将细菌素融合基因片段回收，然后与pEASY-Blunt Simple Cloning Vector(购自北京全式金生物技术有限公司)按照插入片段与线性载体物质的量之比约为7:1混匀，置于25℃下反应约10min，获得重组质粒pEASY/durAB。
将重组质粒pEASY/durAB转化到Trans1-T1 Competent E.coli(Trans1-T1感受态E.coli，购自北京全式金生物技术有限公司)细胞中，大量培养后提取重组质粒进行序列鉴定。从序列鉴定正确的菌株中扩增细菌素融合基因片段，并经BamH I和Xho I双酶切，回收酶切片段。采用BamH I和Xho I双酶切pGEX-6P-1质粒(Invitrogen)，回收载体片段。将细菌素融合基因片段和载体的双酶切片段进行连接，构建重组质粒pGEX-durAB。
3.构建表达耐久肠球菌素突变体的重组菌
设计突变引物K21A-F(SEQ ID NO:7)和K21A-R(SEQ ID NO:8)，具体序列如下：
K21A-F:5′-GATTGGAATGCAGCTTCAAAAGAAATAGGAAAAATTATTG-3′，
K21A-R:5′-TTTTGAAGCTGCATTCCAATCTACCCAACATTCTTGTTTA-3′。
以重组质粒pGEX-durAB为模板，以K21A-F和K21A-R为突变引物，采用MutExpressTM II Fast Mutagenesis Kit(南京诺唯赞生物技术有限公司)，将重组质粒pGEX-durAB中耐久肠球菌素Durancin GL成熟肽编码基因替换为突变体的编码基因(SEQ ID NO:3)，得到突变质粒，命名为pGEX-durAB-K21A，其PCR鉴定结果如图1。将突变质粒pGEX-durAB-K21A转入大肠杆菌Rosetta(DE3)，获得表达菌株DE3-pGEX-durAB-K21A，PCR鉴定电泳分析如图2。菌株DE3-pGEX-durAB-K21A表达耐久肠球菌素突变体K21A。
另外，将重组质粒pGEX-durAB转入大肠杆菌Rosetta(DE3)，获得表达耐久肠球菌素Durancin GL的菌株DE3-pGEX-durAB。
实施例2制备突变体
以1％接种量将表达菌株DE3-pGEX-durAB-K21A接入含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200r/min条件下振荡培养至OD600为0.6～0.8，向培养液中加入终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导，继续培养5～6h。将发酵液在8000g条件下离心5min收集菌泥，用生理盐水清洗菌泥2次。用1％初始培养基体积的结合缓冲液(含有140mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4和1.8mM KH2PO4的水溶液，pH 7.4)悬浮菌体，置于冰水混合物中超声破碎菌体细胞至溶液澄清，超声参数为：400W超声2s间隙9s。将菌体裂解液在4℃、15000r/min条件下离心30min，上清液经0.22μm滤膜过滤，得到细菌素融合蛋白粗提液。将细菌素融合蛋白粗提液采用HisTrap HP柱(购自GE公司)进行纯化，洗脱缓冲液是含有500mM NaCl、20mMNa3PO4和500mM咪唑的水溶液(pH 7.4)，收集洗脱峰，然后采用HiTrapTMDesalting 5ml柱(购自GE公司)脱盐。按照生工生物工程(上海)股份有限公司肠激酶(Cat.No.RP005)操作说明书对上述分离纯化的融合蛋白做酶切处理，采用HisTrap HP柱除去His标签，获得耐久肠球菌素突变体K21A。
按照上述相同方法制备耐久肠球菌素Durancin GL。
实施例3突变体的性质
考察实施例2制备的突变体性质，其中耐久肠球菌素Durancin GL由实施例2中方法制备。
(1)活性
以单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)为指示菌检测耐久肠球菌素突变体K21A的抑菌活性，具体方法见参考文献(Lihui Du,George A.Somkuti,John A.RenyeJr.Guicheng Huo.2012.Properties of Durancin GL,a new antilisterialbacteriocin produced by Enterococcus Durans 41D.Journal offood safety,32:74-83.)。其中，耐久肠球菌素Durancin GL、突变体的浓度相同(均为20μg/mL)，滴加的体积均为5μl。从图3可以看出，突变体K21A对单增李斯特菌的抑菌活性约为耐久肠球菌素Durancin GL的2倍(如图3)。
(2)稳定性
以单增李斯特菌为指示菌对突变体K21A和耐久肠球菌素Durancin GL的温度和pH 稳定性进行检测，具体方法见参考文献(Meizhong；H,Haizhen；Z,Chong；Z,et al.Purification and Characterization of Plantaricin 163,a Novel Bacteriocin Produced by Lactobacillus plantarum 163Isolated from Traditional Chinese Fermented Vegetables[J].Journal ofAgricultural and Food Chemistry,2013,61 (47):11676-82.)。
温度稳定性检测中，将耐久肠球菌素Durancin GL和突变体K21A分别在4℃～121℃范围内处理30min后检测抑制单增李斯特菌活性，计算突变体K21A相对活力：处理后的突变体K21A与25℃条件下未经处理的突变体K21A对单增李斯特菌抑菌活性之比。耐久肠球菌素Durancin GL相对活力的计算方法同突变体K21A。
pH稳定性检测中，将耐久肠球菌素Durancin GL和突变体K21A分别在pH2～14条件下处理30min后检测抑制单增李斯特菌活性。计算突变体K21A相对活力：处理后的突变体K21A与pH7条件下未经处理的突变体K21A对单增李斯特菌抑菌活性之比。耐久肠球菌素Durancin GL相对活力的计算方法同突变体K21A。
结果如图4和5所示。耐久肠球菌素Durancin GL和突变体K21A均具有较好的温度稳定性，尤其值得注意的是突变体K21A在121℃条件下处理半小时后相对活力仍然达到0.88，显示了非常好的温度稳定性。突变体K21A的pH稳定性显著高于耐久肠球菌素Durancin GL。耐久肠球菌素Durancin GL在pH 7.0条件下活力最大，在pH 14条件下处理半小时后相对活力仅为0.6，其他pH条件下处理半小时后相对活力约为0.81；突变体K21A在pH4～10范围内处理后，相对活力大于1.0，在pH 14条件下处理半小时后相对活力仍然达到0.9。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京财经大学
南京禾舜诚生物技术有限公司
<120> 一种耐久肠球菌素突变体、制备方法及其应用
<130> 201507082
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 43
<212> PRT
<213> 耐久肠球菌41D株
<400> 1
Ala Thr Tyr Tyr Gly Asn Gly Val Tyr Cys Asn Lys Gln Glu Cys Trp
1 5 10 15
Val Asp Trp Asn Lys Ala Ser Lys Glu Ile Gly Lys Ile Ile Val Asn
20 25 30
Gly Trp Val Gln His Gly Pro Trp Ala Pro Arg
35 40
<210> 2
<211> 43
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 突变体K21A的氨基酸序列
<400> 2
Ala Thr Tyr Tyr Gly Asn Gly Val Tyr Cys Asn Lys Gln Glu Cys Trp
1 5 10 15
Val Asp Trp Asn Ala Ala Ser Lys Glu Ile Gly Lys Ile Ile Val Asn
20 25 30
Gly Trp Val Gln His Gly Pro Trp Ala Pro Arg
35 40
<210> 3
<211> 129
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 突变体K21A的编码基因
<400> 3
gcaacttatt atggaaatgg tgtttattgt aataaacaag aatgttgggt agattggaat 60
gcagcttcaa aagaaatagg aaaaattatt gttaatggtt gggtgcaaca tggaccttgg 120
gctcctaga 129
<210> 4
<211> 216
<212> DNA
<213> 耐久肠球菌41D株
<400> 4
atgaagaaaa aatttgttag tatttttatg attttaggaa ttgttttatt gagtgtatct 60
actttaggaa ttacagtaga tgctgcaact tattatggaa atggtgttta ttgtaataaa 120
caagaatgtt gggtagattg gaataaagct tcaaaagaaa taggaaaaat tattgttaat 180
ggttgggtgc aacatggacc ttgggctcct agatag 216
<210> 5
<211> 71
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> dur1
<400> 5
gtgggatccc accatcatca tcatcatgac gacgacgaca aggcaactta ttatggaaat 60
ggtgtttatt g 71
<210> 6
<211> 42
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> dur2
<400> 6
aaactcgagt ttaactccaa ataccgatag acgcccatcc cc 42
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> K21A-F
<400> 7
gattggaatg cagcttcaaa agaaatagga aaaattattg 40
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> K21A-R
<400> 8
ttttgaagct gcattccaat ctacccaaca ttcttgttta 40

Claims (6)

1.耐久肠球菌素突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.权利要求1所述耐久肠球菌素突变体的编码基因。
3. 根据权利要求2所述编码基因，其特征在于所述编码基因的序列如SEQ ID NO:3所示。
4.含有权利要求2或3所述编码基因的表达盒、重组载体、重组菌或细胞系。
5.制备权利要求1所述耐久肠球菌素突变体的方法，包括如下步骤：将携带有耐久肠球菌素突变体编码基因的载体导入宿主菌，诱导所述宿主菌表达耐久肠球菌素突变体。
6.权利要求1所述耐久肠球菌素突变体在制备食品级防腐剂方面的应用。
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肠球菌素的分离提取及其在牛乳杀菌中的应用;都立辉，等;《食品科学》;20140815;第35卷(第15期);第2页左栏第1段,第3页左栏第3段第4-10行 *
高等植物光系统II大量捕光天线中螺旋E的丙氨酸扫描突变研究;刘成，等;《中国会议》;20131013;第7-12行 *

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