CN105030681A - 一种脂质体药物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种脂质体药物及其制备方法。本发明治疗脑肿瘤具有双重活性成分的脂质体药物，其活性成分由靶向脂质体包载脂溶性活性药物和水溶性活性药物组成；所述靶向脂质体为脂质体的表面上氨基被4-氨基苯-α-D-吡喃甘露糖苷修饰。所述靶向脂质体包载水溶性活性药物组成一种治疗脑肿瘤的载药脂质体。本发明采用修饰后的载药脂质体前体或靶向脂质体制备治疗脑肿瘤药物，具有靶向血脑屏障的功能，并能穿过血脑屏障的能力进而达到病灶部位；本发明将姜黄素和奎纳克林包载到靶向脂质体中，两药合用在提高抗肿瘤作用的同时，增强其对肿瘤细胞及其干细胞的促凋亡作用。

Description

一种脂质体药物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种脂质体药物及其制备方法，属于治疗脑肿瘤药物研究领域。

背景技术

脑胶质瘤作为恶性肿瘤，是中枢神经系统肿瘤中最为常见但也最致命的一种，已经成为癌症死亡的十大因素之一，患者的平均存活时间只有14.6个月，其中五年生存率不超过5％，严重危及人们的生命和健康。对于脑胶质瘤的治疗临床上通常采用手术治疗、放射治疗和化学药物治疗等方案，然而患者的预后效果普遍很差。脑胶质瘤具有强浸润性的特点，可以快速地浸润和破坏正常脑组织结构，手术不能完全切除肿瘤组织，因而无法完全治愈脑胶质瘤。放射治疗由于自身治疗精度的限制也不能完全清除脑胶质瘤细胞，并且该方法副作用大，对正常细胞的损伤明显。化学药物治疗效果不理想的主要原因在于大部分的化疗药物不能有效的透过血脑屏障——血脑屏障(BBB)是一种高度选择性渗透屏障，由大脑毛细血管内皮细胞的紧密连接形成，可以阻止溶质和化疗药物透过，因此临床上脑胶质瘤患者化疗预后效果极差。

在近年来的肿瘤相关研究和治疗中，越来越多的实验数据与临床资料表明很多肿瘤在肿瘤发生发展上起源于为数不多的一小群细胞——肿瘤干细胞。肿瘤干细胞，是肿瘤中一小部分具有自我更新、无限增殖及多向分化潜能的特殊细胞群体，通过不均一分裂能够产生与上一代完全相同的子代细胞及不同表型的肿瘤细胞，并在体内形成新的肿瘤，促成肿瘤的异质性和多样性。由于传统的抗肿瘤药物都是作用于肿瘤干细胞下游不同分化程度的肿瘤细胞，对于分化程度较低但具有无限增殖潜能的肿瘤干细胞非常不敏感，因而虽然大多数肿瘤患者都可以达到临床缓解，但不难想象由于缺乏有效的干细胞靶向药物而导致耐药和复发现象。因此，在肿瘤疾病的靶向治疗中，肿瘤干细胞已经成为备受关注的药物设计与筛选的靶点。

发明内容

本发明的目的是提供一种脂质体药物及其制备方法。本发明采用修饰后的载药脂质体前体或靶向脂质体制备治疗脑肿瘤药物，具有靶向血脑屏障的功能，并能穿过血脑屏障的能力进而达到病灶部位；本发明将姜黄素和奎纳克林包载到靶向脂质体中，两药合用在提高抗肿瘤作用的同时，增强其对肿瘤细胞及其干细胞的促凋亡作用。

本发明提供的治疗脑肿瘤具有双重活性成分的脂质体药物，该药物的活性成分由靶向脂质体包载脂溶性活性药物和水溶性活性药物组成；

所述靶向脂质体为脂质体的表面上氨基被4-氨基苯-α-D-吡喃甘露糖苷修饰。

上述脂质体药物中，所述脂溶性活性药物为姜黄素(Curcumin，CUR)；

所述姜黄素与所述脂质体的质量比可为1：35～45，具体可为1：40；

在所述靶向脂质体中，所述姜黄素的包封率可为94.22～96.28％；

所述水溶性活性药物为奎纳克林(Quinacrine，QC)；

所述奎纳克林与所述脂质体的质量比可为1：43～53，具体可为1：48；

在所述靶向脂质体中，所述奎纳克林的包封率可为93.28～93.54％；

所述脂质体药物的粒径可为119.53～119.87nm；

所述4-氨基苯-α-D-吡喃甘露糖苷与所述脂质体的质量比可为1：38.7～39.1；

所述脂质体由下述质量份的原料制成：卵磷脂108～109份、胆固醇27～28份、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺29.5～30.5份和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基2.5～3.5份。

上述的脂质体药物的制备方法，包括如下步骤：1)将所述脂质体包载所述脂溶性活性药物；

2)将步骤1)得到的脂质体用4-氨基苯-α-D-吡喃甘露糖苷修饰；

3)将步骤2)得到的脂质体包载所述水溶性活性药物，即得到所述治疗脑肿瘤具有双重活性成分的脂质体药物。

本发明还提供了一种载药脂质体前体，该前体由靶向脂质体和其包载的脂溶性活性药物组成；

所述靶向脂质体为脂质体的表面上氨基被4-氨基苯-α-D-吡喃甘露糖苷修饰。

上述的前体中，所述4-氨基苯-α-D-吡喃甘露糖苷与所述脂质体的质量比为1：38.7～39.1；

所述脂质体由下述质量份的原料制成：卵磷脂108～109份、胆固醇27～28份、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺29.5～30.5份和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基2.5～3.5份；

所述脂溶性活性药物为姜黄素；

所述姜黄素与所述脂质体的质量比为1：35～45；

在所述靶向脂质体中，所述姜黄素的包封率为94.22～96.28％。

本发明所述载药脂质体前体应用于制备治疗脑肿瘤药物和/或脑肿瘤药物载体。

本发明还提供了一种靶向脂质体，它为所述脂质体的表面上氨基被4-氨基苯-α-D-吡喃甘露糖苷修饰。

上述靶向脂质体中，所述4-氨基苯-α-D-吡喃甘露糖苷与所述脂质体的质量比可为1：38.7～39.1；

所述脂质体由下述质量份的原料制成：卵磷脂108～109份、胆固醇27～28份、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺29.5～30.5份和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基2.5～3.5份。

本发明中，所述脂质体表面的氨基被4-氨基苯-α-D-吡喃甘露糖苷修饰，机理具体可为所述脂质体中氨基通过戊二醛与所述4-氨基苯-α-D-吡喃甘露糖苷发生化学反应连接，即所述脂质体中氨基与戊二醛中一个醛基发生反应，所述4-氨基苯-α-D-吡喃甘露糖苷中的氨基与戊二醛中的另一个醛基发生反应。

本发明所述靶向脂质体应用于制备治疗脑肿瘤药物载体。

本发明进一步提供了一种治疗脑肿瘤的载药脂质体，它由所述靶向脂质体包载水溶性活性药物组成。

上述载药脂质体中，所述水溶性活性药物为奎纳克林；

所述奎纳克林与所述脂质体的质量比可为1：43～53；

在所述靶向脂质体中，所述奎纳克林的包封率可为93.28～93.54％。

本发明中，所述载药脂质体或所述治疗脑肿瘤的药物能用于治疗脑肿瘤，可为用于治疗脑胶质瘤，具体可用于治疗C6胶质瘤；不仅能用于治疗脑肿瘤还能诱导脑肿瘤干细胞凋亡。

本发明具有以下优点：

本发明靶向脂质体的靶向能力更强，本发明载药脂质体的稳定性良好，达到靶向位置后释放缓慢。本发明MAN修饰到脂质体表面包载活性药物，靶向脂质体包载的用于治疗脑肿瘤的药物，能增强药物跨血脑屏障的能力，同时具有靶向肿瘤细胞的作用；将姜黄素和奎纳克林包载到脂质体中，得到多功能的靶向脑肿瘤干细胞复方脂质体，改变了奎纳克林生物利用度低的缺点，能够使药物在跨过BBB后，到达病灶部位，两药联合杀死肿瘤细胞并诱导肿瘤干细胞凋亡，大大提高化疗药物的效果，预期能有效防止肿瘤复发。

附图说明

图1为透射电镜下多功能靶向脂质体的形态。

图2为载药脂质体的药物释放曲线；其中图2A为姜黄素的释放曲线，图2B为奎纳克林的释放曲线。

图3为C6脑胶质瘤细胞及肿瘤干细胞球形态；其中图3A为C6胶质瘤细胞，图3B为C6胶质瘤干细胞球。

图4为C6脑胶质瘤干细胞鉴定结果；其中图4A为C6胶质瘤细胞，图4B为C6胶质瘤干细胞。

图5为不同载药脂质体对C6脑胶质瘤细胞的抑制作用，图中标记如下：1P<0.05，对游离奎纳克林；2P<0.05，对游离姜黄素；3P<0.05，对游离姜黄素和奎纳克林；4P<0.05，对姜黄素脂质体；5P<0.05，对包载姜黄素和奎纳克林脂质体。

图6为不同载药脂质体对C6脑胶质瘤干细胞的抑制作用，图中标记如下：1P<0.05，对游离奎纳克林；2P<0.05，对游离姜黄素；3P<0.05，对游离姜黄素和奎纳克林；4P<0.05，对姜黄素脂质体；5P<0.05，对包载姜黄素和奎纳克林脂质体。

图7为不同载药脂质体对C6胶质瘤细胞的凋亡作用。

图8为不同载药脂质体对C6胶质瘤干细胞的凋亡作用。

图9为对C6胶质瘤细胞以及C6胶质瘤干细胞凋亡率对比。

图10为激光共聚焦法检测细胞对不同载药脂质体的摄取及其在细胞内的分布行为。

图11为C6胶质瘤细胞及其干细胞对不同载药脂质体的摄取能力，其中，a和1，P<0.05，对游离姜黄素；b和2，P<0.05，对游离姜黄素和奎纳克林；c和3，P<0.05，对姜黄素脂质体；d和4，P<0.05，对包载姜黄素和奎纳克林脂质。

图12为不同载药脂质体体外跨血脑屏障的转运率，其中，a，P<0.05，对游离姜黄素；b，P<0.05，对游离姜黄素和奎纳克林；c，P<0.05，对姜黄素脂质体；d，P<0.05，对包载姜黄素和奎纳克林脂质体。

图13为体外共培养实验中不同载药脂质体跨血脑屏障后对C6胶质瘤细胞及其干细胞的的抑制率，其中1为游离姜黄素，2为游离姜黄素和奎纳克林，3为姜黄素脂质体，4为奎纳克林脂质体，5为MAN修饰的姜黄素-奎纳克林脂质体；a为P<0.05，对游离姜黄素；b为P<0.05，对游离姜黄素和奎纳克林；c为P<0.05，对姜黄素脂质体；d为P<0.05，对包载姜黄素和奎纳克林脂质体。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中，1、实验试剂和细胞来源：

蛋黄卵磷脂(EPC)购自GermanyLipoidcompany,ShangHailocalagent,China；胆固醇(cholesterol)购自北京双旋微生物培养基制品厂；聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)购自日本油脂株式会社(日本NOF公司)；DSPE-PEG2000-NH2、p-aminophenyl-α-D-manno-pyranoside(MAN)、葡聚糖凝胶(shephedexG-50)、三硝基苯磺酸(TNBS)购自Sigma公司；碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)购自上海源叶生物科技有限公司；姜黄素、奎纳克林购自南京天尊泽众化学试剂公司；硫酸铵((NH4)2SO4)，分析纯，购自天津市福晨化学试剂厂；DMEM高糖培养基、DMEM/F12高糖培养基、0.25％胰酶购于Gibico公司；胎牛血清购自杭州四季青生物科技有限公司；青霉素-链霉素双抗试剂(100×)购于北京索莱宝生物科技有限公司；基本成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)购自美国PeproTech公司；B27购自美国Gibco公司；磺酰罗丹明B蛋白(SRB)购自美国Sigma公司；巢蛋白(Nestin)购自Sigma公司。

C6大鼠脑胶质瘤细胞购自中国科学院上海细胞所。

2、实验仪器：

聚碳酯过滤器(孔径为400、200nm)购自Millipore(Bedford,MA,USA)；岛津LC-15C高效液相色谱仪(日本岛津公司，紫外检测器)；UV-2401PC型紫外-可见分光光度计(日本岛津公司)；马尔文粒度测定仪(英国马尔文仪器公司)；SartoriusBP211D电子天平(德国赛多利斯集团)；超声波清洗器(天鹏电子新技术北京有限公司)；EYELA-1000S型旋转蒸发仪(日本EYELA东京理化器械株式会社)；JY92细胞超声破碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；恒温振荡器(江苏省金坛市医疗仪器厂)；透析袋(截留分子量8000-12000)；脂质体挤压器(德国赛多利斯集团)；流式细胞仪(美国BD公司)；CO2恒温培养箱(Thermo科技有限公司，美国)；酶标免疫测定仪(上海基因科技有限公司)。

实施例1、脂质体的制备

一、空白脂质体的制备

1、空白脂质体的制备

将卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(2000DSPE-PEG2000)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-氨基交连物(DSPE-PEG2000-NH₂)按质量比为108.4:27.6:30.2:3(摩尔比63:32:4:1)溶解在甲醇中，旋转蒸发除去甲醇，在茄形瓶中35℃、40rpm旋转蒸发成膜，加入250mM硫酸铵10ml，先在水浴中超声5min，然后转移到血清瓶中在JY92型超声波细胞粉碎机中进一步超声(超声工作时间为10s，间歇时间为30s，全程时间为10min，保护温度为35℃)，再使用脂质体挤压器分别过400nm和200nm聚碳脂膜各3次，采用透析法用PBS液(PH＝7.4)更换脂质体外相液；得到空白脂质体。

2、空白4-氨基苯-α-D-吡喃甘露糖苷修饰的脂质体(即靶向脂质体)的制备

通过戊二醛作连接剂将4-氨基苯-α-D-吡喃甘露糖苷(MAN)化学连接到空白脂质体上DSPE-PEG2000-NH₂的氨基上，具体步骤为：将2ml空白脂质体(磷脂和胆固醇质量之和÷脂质体体积浓度为13.6mg/ml)与2mgMAN(使用过量，过量的MAN经透析除去)混合，然后缓慢加入戊二醛，使戊二醛终浓度达到15mM，室温下孵育5min。未连接的MAN和戊二醛通过在PBS(pH7.4)中透析去除。得到MAN修饰的脂质体，即靶向脂质体。

二、载药脂质体的制备

药脂比＝姜黄素或奎纳克林的质量：脂质体中卵磷脂和胆固醇的质量之和。

将姜黄素(CUR)以1：40的药脂比与卵磷脂、胆固醇等溶解在甲醇中，具体制备方法同上述空白脂质体的制备方法中1，得到载有CUR的脂质体(CUR-脂质体)。然后将奎纳克林(QC)以1：48的药脂比分别与空白脂质体和CUR-脂质体混合，60℃水浴中振摇20min，即得到包载奎纳克林的脂质体(QC-脂质体)，包载姜黄素和奎纳克林的脂质体(CUR-QC-脂质体)。

上述的方法得到的CUR-脂质体，按照上述空白脂质体的制备方法中2制得MAN修饰的CUR-脂质体(MAN-CUR-脂质体)。将奎纳克林(QC)以1：48的药脂比与MAN-CUR-脂质体混合，60℃水浴中振摇20min，得到MAN修饰的载姜黄素和奎纳克林的脂质体(MAN-CUR-QC-脂质体，即本发明靶向载药脂质体)。

实施例2、脂质体的性能测定

一、MAN修饰率测定

脂质体上PEG2000-DSPE-NH₂的氨基与三硝基苯硫酸反应，分别检测MAN-CUR-QC-脂质体可与三硝基苯硫酸反应的氨基数量。MAN-CUR-QC-脂质体的MAN修饰率为：[1-(MAN-CUR-QC-脂质体)上可与三硝基苯硫酸反应的氨基数量÷空白脂质体上可与三硝基苯硫酸反应的氨基数量]×100％。测得MAN-CUR-QC-脂质体表面MAN的连接效率为34.95±0.15％。根据MAN的连接效率换算得到MAN与脂质体的质量比为1：38.7～39.1。

二、包封率的测定

采用葡聚糖凝胶G-50柱层析法除去未包载到脂质体内的姜黄素，取适量柱层析(简称过柱)前CUR-QC-脂质体和MAN-CUR-QC-脂质体甲醇消解测定总姜黄素含量；另取过柱后的脂质体溶液用甲醇消解，测定脂质体中姜黄素含量。采用透析法去除未包载到脂质体内的奎纳克林，取适量透析前CUR-QC-脂质体和MAN-CUR-QC-脂质体乙腈消解测定总奎纳克林含量；另取透析后的脂质体溶液用乙腈消解，测定脂质体中奎纳克林含量。采用用公式(1)计算包封率：

包封率(％)＝W_包/W_总×100％(1)

其中W_包和W_总分别表示脂质体包载的药量和总投料量。

在所制备的载药脂质体中，姜黄素的包封率达95.25±1.03％，奎纳克林的包封率达93.41±0.13％，结果见表1。

表1不同载药脂质体的包封率(n＝3)

三、粒径和电位测定

分别将1ml新制得的空白脂质体、CUR-QC-脂质体和MAN-CUR-QC-脂质体用PBS稀释，使用NanoSeriesZen4003ZetaSizer(Malverninstruments,Ltd,UK)测定脂质体的粒径、多分散系数和Zeta电位。不同脂质体的粒径、多分散系数(PDI)和Zeta电位的测定结果见表2。脂质体粒径分布均匀，粒径大小在115nm～120nm之间。各载药脂质体都略带负电，说明脂质体囊泡之间具有适量的静电排斥力，贮存稳定性更好，不易发生聚沉。

表2不同脂质体粒径、多分散系数及Zeta电位(n＝3)

四、透射电镜(TEM)

采用透射电镜对实施例1制备的多功能MAN-CUR-QC-脂质体进行形态学观察。具体方法为使用去离子水作为分散介质稀释上述脂质体，用0.2μm微孔滤膜过滤后，将铺有碳膜的铜网漂放在脂质体溶液上，1min后取出，滤纸吸干；将俘获有脂质体粒子的铜网漂放在1％醋酸双氧铀水溶液上，1min后取出，滤纸吸干，使用透射电镜仪进行观察测定结果见图1，可见脂质体形态较为圆整，大小均一。

五、载药脂质体的释放

分别精密量取2.00mLCUR-QC-脂质体和MAN-CUR-QC-脂质体混悬液转入经处理的透析袋中，系紧透析袋两端，悬置在盛有50倍释放介质(PBS，pH＝7.4)的锥形瓶中，置于恒温振荡器中，于37±0.5℃中恒温振荡48h，在设定的取样时间取样，并立即补入等体积透析介质(PBS，pH＝7.4)，过0.45μm微孔滤膜，进样20μL，HPLC分析测定。根据公式2计算CUR、QC释放百分率：

F(％)＝(Ct/C_总)×100％(2)

Ct/C_总为各时间点实测浓度与按标示量计算得到的溶出介质中浓度之比，由此求得不同时间的释放百分率F(％)，绘制释放曲线。

由图2-A可知，姜黄素游离药释放速度较快，在48h时达到50％，48h时MAN-姜黄素-奎纳克林脂质体以及姜黄素-奎纳克林脂质体中姜黄素释放率为20％左右，释放缓慢，无突释现象。由图2-B可知，奎纳克林游离药释放速度较快，在48h时达到50％以上，48h时MAN-姜黄素-奎纳克林脂质体以及姜黄素-奎纳克林脂质体中奎纳克林释放率为20％左右，释放缓慢，无突释现象。表明，本发明姜黄素和奎纳克林以脂质体为载体时稳定性良好，释放缓慢。

实施例3、载药脂质体体外对C6脑胶质瘤细胞及C6脑胶质瘤干细胞的抑制作用研究

一、培养条件

1、C6脑胶质瘤细胞培养条件

将C6胶质瘤细胞培养于含10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM高糖培养基中，37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱孵育，C6胶质瘤细胞贴壁生长，细胞形态呈梭形，胞浆伸展，胞间有突起互相连接(图3-A所示)，取对数生长期细胞进行实验。

2、C6脑胶质瘤干细胞培养条件

取处于对数生长期的C6细胞，用PBS清洗，0.25％胰酶消化，吹打成单细胞悬液，重悬于无血清培养基(含有DMEM/F12，bFGF、EGF，B27)，4～5天后细胞增殖可形成悬浮生长的肿瘤干细胞球，呈球形，细胞连接紧密，形态如图3-B所示。干细胞球的传代方法具体为：将悬浮生长的肿瘤干细胞球连同培养基一起转移至试管内，以1000r/min离心5min，弃上清，无血清培养基重悬细胞，反复吹打，使细胞团分解成单细胞，按1:2或者1:3的比例接种于25cm²底面积培养瓶，添加无血清培养基至6mL/瓶，继续在37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养，取培养14天的C6胶质瘤干细胞球进行实验。

3、干细胞的鉴别

由于巢蛋白(Nestin)在干细胞表面高表达，故用来鉴定C6胶质瘤干细胞。分别取对数生长期的C6细胞壁和培养14天后的C6胶质瘤干细胞球，胰酶消化分离，PBS(pH7.4，具体配比为137mMNaCl，2.7mMKCl，8mMNa₂HPO₄和2mMKH₂PO₄)洗涤后，4％多聚甲醛固定10min。0.1％的皂苷破膜，与Nestin巢蛋白抗体以及其同型对照一起避光孵化30分钟，用PBS洗涤三次后重悬，使用流式细胞仪进行测定分析。中Nestin表达量为19.84％，C6胶质瘤干细胞中Nestin表达量为83.22％，如图4：A为C6胶质瘤细胞，B为C6胶质瘤干细胞。从结果中可以看出Nestin在所培养的C6胶质瘤干细胞球中高表达，说明上述培养条件适合干细胞的生长和增殖。

二、配制不同浓度的载药脂质体

用PBS配制系列浓度的游离CUR、游离QC、游离CUR-QC、CUR-QC脂质体和MAN-CUR-QC脂质体，使得取10μL上述药物溶液分别加入细胞培养孔中后，姜黄素的最终浓度依次为0，0.5，1，5，10，25，50，100μM，奎纳克林最终浓度依次为0，0.01，0.05，0.1，0.5，1，10，50μM。

三、载药脂质体对C6胶质瘤细胞及C6胶质瘤干细胞的抗增殖作用

取对数生长期的8000个/孔C6胶质瘤细胞190μL/孔接种于96孔板中，37℃，5％CO₂条件下培养24h；取培养14天后的C6胶质瘤干细胞球，以1000r/min离心5min，弃上清，C6胶质瘤细胞完全培养基重悬细胞，反复吹打，使细胞团分解成单细胞，计数后以8000个/孔C6胶质瘤细胞190μL/孔接种于96孔板中，37℃，5％CO₂条件下培养24h。将用PBS配制系列浓度的游离CUR、游离QC、游离CUR-QC、CUR-QC脂质体和MAN-CUR-QC脂质体各取10μL分别加入细胞培养孔中，每个浓度设四个复孔。给药后继续培养48h，经SRB方法获得每孔吸收度OD值(540nm)，计算不同载药脂质体对C6细胞及其干细胞的抑制作用，见图5、6。从图5中可以看出，游离QC对C6细胞的抑制作用较弱，但与姜黄素联用后，可明显增强二者对C6细胞的生长抑制，表现出协同作用；MAN-CUR-QC脂质体对C6的抗增殖作用优于其他载药脂质体组。从图6中可以看出，游离QC对C6脑胶质瘤干细胞具有较强的抗增殖效果，发挥了其作为干细胞凋亡诱导剂的作用；姜黄素与奎纳克林联合后，对C6脑胶质瘤干细胞表现出更强的抗增殖作用；CUR-QC脂质体经MAN修饰后，可能增强C6干细胞对其的亲和力和摄取能力，对C6干细胞的抑制作用明显优于其他各组。

计算抑制率(抑制率＝给药组细胞吸光度/对照组细胞吸光度)，并使用SPSS计算50％抑制浓度(IC50)，IC50计算结果见表5。游离QC对C6细胞的IC50为21.72μM，抗增殖作用较弱，而对C6干细胞的IC50为1.06μM，抗增殖作用较强，说明QC作为干细胞的凋亡诱导剂，主要针对C6干细胞发挥作用。游离CUR对C6细胞的IC50为1.57μM，抗增殖作用较强，而对C6干细胞的IC50为4.89μM，抗增殖作用稍弱，不及对C6细胞的抗增殖作用，说明CUR作为新型高效抗肿瘤药物，主要抑制肿瘤细胞的生长，同时能对干细胞有一定的抑制作用。从表中显示的IC50的值可以看出，两药联合后，既可增强CUR对C6的抑制作用，又能增强QC对C6干细胞的抑制作用，表现为协同增效。从表5结果中可知，两药联合又经配体MAN修饰后，即本发明MAN-CUR-QC脂质体的IC50明显低于其他组，对C6胶质瘤细胞及其干细胞的抗增殖作用大大提高，明显高于游离药组和其他载药脂质体。

表5不同载药脂质体的IC50值

实施例4、载药脂质体体外对C6脑胶质瘤细胞及干细胞的凋亡作用研究

取对数生长期的C6脑胶质瘤细胞及培养14天后的C6胶质瘤干细胞，以2×10⁵个/孔接种于6孔板中，37℃，5％CO₂培养箱中培养。细胞生长24h后，加入游离CUR、游离CUR-QC、CUR-脂质体、QC-脂质体、CUR-QC-脂质体、MAN-CUR-QC脂质体(CUR和QC的终浓度分别为8μM和5μM)，每个药物设三个复孔。置培养箱中继续培养48h后，用冷PBS漂洗3遍，不含EDTA的胰酶消化，离心(1000rpm离心3min)后用PBS洗涤细胞两次，300μL回流的PBS将离心的下沉细胞吹匀。之后依次加入500μL的BindingBuffer、5μLAnnexinV-APC、5μL7-AAD，混匀后于室温避光的条件下反应10min，经流式细胞仪检测。

实验结果如图7所示，对C6胶质瘤细胞：游离CUR(A)、游离CUR-QC(B)、CUR-脂质体(C)、QC-脂质体(D)、CUR-QC-脂质体(E)、MAN-CUR-QC脂质体(F)的凋亡率分别为6.28％，29.80％，37.25％，53.40％，56.93％，59.19％。如图8所示，对C6胶质瘤干细胞：游离CUR(A)、游离CUR-QC(B)、CUR-脂质体(C)、QC-脂质体(D)、CUR-QC-脂质体(E)和MAN-CUR-QC脂质体(F)的凋亡率分别为10.01％、14.82％、18.87％、21.57％、24.48％和31.56％。由结果可以看出，本发明不同载药脂质体对C6胶质瘤细胞的促凋亡作用强于对C6胶质瘤干细胞的促凋亡作用。姜黄素本身对C6胶质瘤细胞以及C6胶质瘤干细胞都有促凋亡作用，但是作用较弱，加入奎纳克林后对C6胶质瘤细胞促凋亡作用增加幅度较大，增大了22％，对C6胶质瘤干细胞促凋亡作用也增强了4％；姜黄素以脂质体为载体后对C6胶质瘤细胞的促凋亡作用提高了31％，对C6胶质瘤细胞的促凋亡作用提高了8％，同时在脂质体中包载姜黄素以及奎纳克林后对C6胶质瘤细胞以及C6胶质瘤干细胞的促凋亡作用分别增高到56％和24％。多功能靶向MAN-CUR-QC脂质体对C6胶质瘤细胞以及C6胶质瘤干细胞的凋亡百分率最高分别为59％和31％，经统计学分析，与其他各组相比具有显著性差异(见图9)，说明本发明靶向载药脂质体促凋亡作用明显强于其他各组。

实施例5、共聚焦显微镜研究不同载药脂质体在C6胶质瘤干细胞内的分布

取C6胶质瘤干细胞球，收集离心后接种在含有载玻片的12孔板上，含血清培养基培养，2万/孔，于37℃二氧化碳培养箱中，相对湿度95％的条件下孵育24h。分别给予游离CUR(A)，游离CUR-QC(B)，CUR-脂质体(C)，CUR-QC脂质体(D)，MAN-CUR-QC-脂质体(E)，(CUR和QC的终浓度分别为8μM)，置培养箱中继续培养2h后，依次用冷PBS漂洗三次，4％多聚甲醛固定10min，Hoechst33258进行细胞核染色5min，30％甘油封片。用激光共聚焦显微镜(LSM510，Zeiss，Germany)以488nm波长的激光束激发姜黄素(激发波长488nm，发射波长550nm)，显示绿色荧光；以346nm波长的激光束激发Hoechst33258(激发波长346nm，发射波长460nm)，显示蓝色荧光，然后用AimImageExaminer软件进行图像分析，结果见图10。

图10中，A为游离CUR，B为游离CUR-QC，C为CUR-脂质体，D为CUR-QC脂质体，E为MAN-CUR-QC-脂质体；A1-E1：绿色表示应用载药脂质体或游离CUR后，药物在C6胶质瘤细胞内的分布；A2-E2：蓝色表示经Hochest33258染色后的C6细胞的核；A3-E3：A1-E1和A2-E2的叠加图像，显示应用载药脂质体和游离CUR后，药物在C6胶质瘤细胞的细胞核、细胞质均有分布。结果表明，药物经C6胶质瘤细胞内吞后主要分布在细胞核中，本发明MAN-CUR-QC-脂质体组细胞内姜黄素的分布量最多。

实施例6、C6胶质瘤细胞及其干细胞对不同载药脂质体的摄取能力

取对数生长期的C6脑胶质瘤细胞及培养14天后的C6胶质瘤干细胞，收集离心后，以20万/孔的密度接种于6孔板，含血清培养基培养，于37℃二氧化碳培养箱中，相对湿度95％的条件下孵育24h后，给药：游离CUR(1)，游离CUR-QC(2)，CUR-脂质体(3)，CUR-QC脂质体(4)，MAN-CUR-QC-脂质体(5)(CUR和QC的终浓度分别为8μM和5μM)，培养箱中孵育2h。孵育完毕后，用冷的PBS洗涤细胞三次，经0.25％胰酶消化收集，再用PBS吹打成细胞悬液，经流式细胞仪检测。结果见图11，在C6胶质瘤细胞及其干细胞的摄取实验中，与游离药和其他各组载药脂质体相比，MAN-CUR-QC-脂质体显示出最强的C6胶质瘤细胞及其干细胞的摄取能力。

实施例7脂质体体外靶向作用研究

一、体外血脑屏障模型的建立及评价

将bEnd.3细胞接种在细胞插入器上，细胞接种密度为5×10⁴个/孔，培养4天。上层加培养液500μl，下层加培养液1350μl，每两天更换一次培养液。

实验前，单层细胞的紧密程度用跨膜电阻仪来测定它的转移上皮电阻(TEER)。TEER值>150Ωcm2(扣底后)方可用于实验。同时用辣根过氧化物酶(HRP)(RZ＝3.0-3.5，酶活性>265U/mg，Mw＝44kDa)作为一个血脑屏障渗透性的评价指标。

二、不同载药脂质体透过血脑屏障的能力测定

待血脑屏障模型建立以后，将游离CUR、游离CUR-QC、CUR-脂质体、CUR-QC脂质体、MAN-CUR-QC-脂质体分别以含有10μg的姜黄素浓度加入模型上层，以PBS缓冲液作为转运媒介分别在2h，4h，8h，24h时间点从下层接收液中取样200μl，并且补加等量的新鲜缓冲液。样品中药物含量用HPLC法测定。

建立的血脑屏障模型，跨膜电阻扣底后可高达180Ωcm2，同时用HRP透过率验证了模型的致密性，符合实验要求。由图12可以看出，经MAN修饰的CUR-QC-脂质体在体外血脑屏障模型上的转运率高于其他各组(P<0.05)，并且随着时间的延长，优势愈加明显。

三、经MAN修饰的CUR-QC-脂质体透过血脑屏障后对C6细胞及其干细胞的抑制作用研究

成功建立bEnd.3/C6脑胶质瘤细胞共培养模型和bEnd.3/C6脑胶质瘤干细胞共培养模型，培养方法为：bEnd.3细胞种入细胞插入器上池中，接种密度为5×104/孔；然后于第三天在下池中种入1×105个/孔C6脑胶质瘤细胞或C6脑胶质瘤干细胞共培养，其培养液是两种细胞培养液各一半，共培养24h。

上述共培养模型共分成六组；其中一组上池培养基做空白对照，剩下五组上池中分别加入含有10μg的姜黄素浓度的游离CUR、游离CUR-QC、CUR-脂质体、CUR-QC脂质体、MAN-CUR-QC-脂质体。继续培养48h之后，吸弃下池中培养液，采用SRB法测定计算抑制率(抑制率＝给药组细胞吸光度/对照组细胞吸光度)。结果见图13，不同给药组对C6脑胶质瘤细胞的抑制率分别为：MAN-CUR-QC-脂质体(55.24±0.97)>CUR-QC脂质体(23.74±0.88)>CUR-脂质体(18.63±0.75)>游离CUR-QC(15.73±0.72)>游离CUR(12.22±0.67)；不同给药组对C6脑胶质瘤干细胞的抑制率分别为：MAN-CUR-QC-脂质体(59.05±0.93)>CUR-QC脂质体(24.73±0.84)>CUR-脂质体(11.52±0.69)>游离CUR-QC(12.07±0.47)>游离CUR(9.61±0.37)。结果表明，经MAN修饰的CUR-QC-脂质体显示出“靶向作用”，能够介导载药脂质体跨过血脑屏障，进而作用于C6脑胶质瘤细胞及其干细胞，抑制C6细胞及C6干细胞的增殖，并具有一定的杀伤作用。

综上所述，本发明构建的治疗脑肿瘤的载药脂质体，粒径大小均一，药物释放稳定；对C6脑胶质瘤细胞及其干细胞具有很强的抗增殖作用；显著增加C6脑胶质瘤干细胞对药物的摄取；可诱导C6脑胶质瘤细胞及C6脑胶质瘤干细胞的凋亡；可明显提高载体跨越血脑屏障的能力，进而将药物输送至肿瘤部位，杀死C6脑胶质瘤细胞，并诱导C6脑胶质瘤细胞干细胞的凋亡，预防肿瘤复发。

Claims (10)

1.一种治疗脑肿瘤具有双重活性成分的脂质体药物，该药物的活性成分由靶向脂质体包载脂溶性活性药物和水溶性活性药物组成；

所述靶向脂质体为脂质体的表面上氨基被4-氨基苯-α-D-吡喃甘露糖苷修饰。

2.根据权利要求1所述脂质体药物，其特征在于：所述脂溶性活性药物为姜黄素；

所述姜黄素与所述脂质体的质量比为1：35～45；

在所述靶向脂质体中，所述姜黄素的包封率为94.22～96.28％；

所述水溶性活性药物为奎纳克林；

所述奎纳克林与所述脂质体的质量比为1：43～53；

在所述靶向脂质体中，所述奎纳克林的包封率为93.28～93.54％；

所述脂质体药物的粒径为119.53～119.87nm；

所述4-氨基苯-α-D-吡喃甘露糖苷与所述脂质体的质量比为1：38.7～39.1；

所述脂质体由下述质量份的原料制成：卵磷脂108～109份、胆固醇27～28份、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺29.5～30.5份和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基2.5～3.5份。

3.权利要求1或2所述的脂质体药物的制备方法，包括如下步骤：1)将所述脂质体包载所述脂溶性活性药物；

2)将步骤1)得到的脂质体用4-氨基苯-α-D-吡喃甘露糖苷修饰；

3)将步骤2)得到的脂质体包载所述水溶性活性药物，即得到所述治疗脑肿瘤具有双重活性成分的脂质体药物。

4.一种载药脂质体前体，其特征在于：该前体由靶向脂质体和其包载的脂溶性活性药物组成；

所述靶向脂质体为脂质体的表面上氨基被4-氨基苯-α-D-吡喃甘露糖苷修饰。

5.根据权利要求4所述的前体，其特征在于：所述4-氨基苯-α-D-吡喃甘露糖苷与所述脂质体的质量比为1：38.7～39.1；

所述脂质体由下述质量份的原料制成：卵磷脂108～109份、胆固醇27～28份、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺29.5～30.5份和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基2.5～3.5份；

所述脂溶性活性药物为姜黄素；

所述姜黄素与所述脂质体的质量比为1：35～45；

在所述靶向脂质体中，所述姜黄素的包封率为94.22～96.28％。

6.一种靶向脂质体，其特征在于：它为所述脂质体的表面上氨基被4-氨基苯-α-D-吡喃甘露糖苷修饰。

7.根据权利要求6所述靶向脂质体，其特征在于：所述4-氨基苯-α-D-吡喃甘露糖苷与所述脂质体的质量比为1：38.7～39.1；

所述脂质体由下述质量份的原料制成：卵磷脂108～109份、胆固醇27～28份、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺29.5～30.5份和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基2.5～3.5份。

8.权利要求6或7所述靶向脂质体在制备治疗脑肿瘤药物载体中的应用。

9.一种治疗脑肿瘤的载药脂质体，它由权利要求6或7所述靶向脂质体包载水溶性活性药物组成。

10.根据权利要求9所述载药脂质体，其特征在于：所述水溶性活性药物为奎纳克林；

所述奎纳克林与所述脂质体的质量比为1：43～53；

在所述靶向脂质体中，所述奎纳克林的包封率为93.28～93.54％。