CN105025923A - 间皮瘤的治疗方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用结合神经节苷脂GM2抗原的抗体的治疗方法和诊断方法，以及包含结合神经节苷脂GM2抗原的抗体作为活性成分的治疗剂和诊断剂。

Description

间皮瘤的治疗方法
技术领域
本发明涉及使用结合神经节苷脂GM2抗原的抗体的治疗方法和诊断方法。本发明还涉及包含结合神经节苷脂GM2抗原的抗体作为活性成分的治疗剂和诊断剂。
背景技术
神经节苷脂是一种类型的糖脂，其由含有唾液酸的细胞外糖链组成部分和包埋在脂双层中的神经酰胺构成，并以随着细胞类型、器官和动物物种而变的各种模式表达(非专利文献1)。已揭示，神经节苷脂具有广泛的生物功能，包括细胞间识别，通过与细胞外基质的相互作用控制细胞增殖，以及细胞分化(非专利文献2和3)。
根据唾液酸结合的模式和数目以及结合于非还原末端的N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)和半乳糖(Gal)的存在或不存在来对神经节苷脂进行分类。GM2是具有GalNAcβ1-4(SAα2-3)Galβ1-4Glcβ1-1神经酰胺糖链结构的神经节苷脂的一个成员。
已报道，随着癌细胞的发展，神经节苷脂表达经历量变和质变(非专利文献4)。还已知道，在正常细胞中几乎不存在任何GM2表达，而在肿瘤例如肺癌、成神经细胞瘤和神经胶质瘤中观察到高的GM2表达(非专利文献4和5)。这使GM2成为抗体癌症治疗中有吸引力的靶抗原。
间皮瘤，也被称为包覆间皮肿瘤或间皮肿瘤，是从中胚层起源的间皮(例如胸膜、腹膜和心包膜)发展出来的肿瘤类型，并且被分类为局部良性肿瘤和弥散性恶性肿瘤。在胸膜中发生的一种形式的恶性间皮瘤是恶性胸膜间皮瘤(在后文中，在某些情况下缩写为MPM)。
MPM是从胸腔的间皮细胞发展出来的一种癌症形式，并以高生长速率为特征，通常伴有胸膜积液(非专利文献6)。呼吸困难、呼吸短促和胸痛是MPM的一些症状，并且患者的生活质量(QOL)降低。石棉、铁和猿猴病毒40(SV40)是MPM的致病物质的已知实例(非专利文献7和8)。
具体来说，暴露于石棉已被认为与MPM的发病高度相关，并且具有石棉暴露史的人处于MPM发病的显著提高的风险中。日本在1970至1980年间进口和使用了大量石棉(非专利文献9)。由于MPM的潜伏期据信为石棉暴露后30至40年，因此预计从2010至2020年，日本的MPM发病率极大增加。
尽管MPM的唯一治疗是在发病的早期阶段移除肿瘤，但在临床上该疾病被发现时通常处于高级阶段。此外，MPM对常用的化疗和放疗没有反应，并具有非常不良的预后，从发病起的平均存活时间约为1年。因此，对可以改善该疾病预后的治疗方法存在着需求。
引用文献名单
非专利文献
[非专利文献1]J.Neurochem.,10,613(1963)
[非专利文献2]Curr.Opin.Immunol.,3,646(1991)
[非专利文献3]Biochem.Biophys.Res.Commun.,192,214(1993)
[非专利文献4]Cancer Res.,45,2405(1985)
[非专利文献5]Cancer Res.,50,7444(1990)
[非专利文献6]Cancer Sci.,97,183(2006)
[非专利文献7]Cell Mol.Biol.,17,657(1997)
[非专利文献8]Am.J.Respir.Crit.Care Med.,153,711(1996)
[非专利文献9]Industrial Health,39,65(2001)
发明概述
发明解决的技术问题
通过在早期阶段移除肿瘤来治疗间皮瘤。然而，在临床上该疾病被发现时通常处于高级阶段，并且对常见的化疗和放疗反应不佳。因此，对用于改善该疾病预后的治疗方法、治疗剂和诊断方法，存在着需求。
因此，本发明的目的是提供有效用于间皮瘤的诊断和治疗，并且可以改善间皮瘤患者的预后的治疗方法、治疗剂和诊断方法。
解决技术问题的手段
本发明涉及下列(1)至(13)。
(1)一种用于间皮瘤的治疗剂或诊断剂，其包含结合神经节苷脂GM2的抗体或其片段作为活性成分。
(2)(1)中所描述的治疗剂或诊断剂，其中所述间皮瘤是选自胸膜间皮瘤、腹膜间皮瘤和心包间皮瘤中的一种。
(3)(2)中所描述的治疗剂或诊断剂，其中所述胸膜间皮瘤或所述腹膜间皮瘤是恶性胸膜间皮瘤或恶性腹膜间皮瘤。
(4)(1)至(3)任一项中所描述的治疗剂或诊断剂，其中所述抗体是与GM2的α2-3连接的唾液酸(SA)结合的抗体。
(5)(1)至(4)任一项中所描述的治疗剂或诊断剂，其中所述抗体是单克隆抗体。
(6)(1)至(5)任一项中所描述的治疗剂或诊断剂，其中所述抗体是重组抗体。
(7)(6)中所描述的治疗剂或诊断剂，其中所述重组抗体是选自嵌合抗体、人源化抗体和人类抗体中的一种。
(8)(1)至(7)任一项中所描述的治疗剂或诊断剂，其中所述抗体是包含分别具有SEQ ID NO：1至3的氨基酸序列的重链(后文中的“H链”)互补决定区(CDR；在后文中缩写成“CDR”)1至3和分别具有SEQ ID NO：4至6的氨基酸序列的轻链(后文中的“L链”)CDR1至3的抗体。
(9)(1)至(8)任一项中所描述的治疗剂或诊断剂，其中所述抗体是选自下列中的一种：
包含具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的H-链可变区(在后文中被称为“VH”)和具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的L-链可变区(在后文中称为“VL”)的抗体；
包含具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的VL的抗体；
包含具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的VL的抗体；和
包含具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的VL的抗体。
(10)(1)至(9)任一项中所描述的治疗剂或诊断剂，其包含使用至少一种合用药。
(11)(10)中所描述的治疗剂或诊断剂，其中所述合用药是选自化疗药剂和蛋白质药物中的至少一种。
(12)一种治疗方法或诊断方法，其使用结合神经节苷脂GM2的抗体或其片段作为活性成分。
(13)结合神经节苷脂GM2的抗体或其片段在制造间皮瘤治疗剂中的应用。
发明的效果
根据本发明，通过用包含抗神经节苷脂GM2抗体作为活性成分的诊断剂和治疗剂诊断和治疗间皮瘤，可以改善GM2阳性间皮瘤患者的预后。
附图简述
[图1]图1是示出了GM2在恶性间皮瘤细胞系中的表达的流式细胞术分析结果的柱状图。横轴表示GM2表达水平，纵轴表示细胞计数。实线柱状图和灰色柱状图分别表示与抗GM2抗体和阴性对照抗体的反应。
[图2]图2(a)和(b)示出了抗GM2抗体针对恶性间皮瘤细胞系MSTO-211H的ADCC活性的评估结果。纵轴表示细胞毒性(％)，横轴表示抗体浓度(μg/mL)。实心圆圈表示使用抗GM2抗体的活性，空心圆圈表示使用阴性对照抗体(抗DNP抗体)的活性。呈现了PBMC供体A[图2(a)]和供体B[图2(b)]的结果。
[图3]图3示出了在使用恶性间皮瘤细胞系MSTO-211H的SCID小鼠原位移植模型中抗GM2抗体的抗肿瘤效果的评估结果。纵轴轴表示胸部肿瘤质量(mg)，横轴表示给药样品的类型。实心圆圈表示单个胸部肿瘤质量(mg)，水平条表示平均值。通过进行Dunnett多重比较检验来确定统计学显著的差异。
[图4]图4示出了人类恶性间皮瘤组织供体信息，从左侧开始包括样品ID、年龄、性别、组织起源(或检测到的组织)、通过病理学分类的疾病类型、TNM(肿瘤-淋巴结-转移)分类、最低阶段分组、正常组织％、病变部位％、肿瘤组织％、肿瘤/细胞过多的基质％、肿瘤/细胞过少或无细胞的基质％和坏死％。
具体实施方式
本发明涉及包含抗神经节苷脂GM2抗体作为活性成分的治疗剂和诊断剂，包括向间皮瘤患者给药抗神经节苷脂GM2抗体的治疗方法，以及使用抗神经节苷脂GM2抗体诊断间皮瘤患者的方法。
在本发明中，“间皮瘤”也被称为包覆间皮肿瘤或间皮肿瘤，并且是指从中胚层起源的间皮(例如胸膜、腹膜和心包膜)发展出来的所有肿瘤。间皮瘤根据组织学类型被分类为局部良性肿瘤和弥散性恶性肿瘤，并且这些肿瘤被涵盖在本发明的间皮瘤的定义中。
胸膜起源的间皮瘤肿瘤被称为胸膜间皮瘤，恶性肿瘤被称为MPM。腹膜起源的间皮瘤肿瘤被称为腹膜间皮瘤。
在本发明中，“神经节苷脂GM2”是指具有GalNAcβ1-4(SAα2-3)Galβ1-4Glcβ1-1神经酰胺结构的葡萄糖神经酰胺，并且也将被简称为“GM2”。GalNAc、Gal、Glc和SA分别表示N-乙酰葡萄糖胺、半乳糖、葡萄糖和唾液酸。
本发明中使用的抗GM2抗体的实例可以包括结合包含GalNAcβ1-4(SAα2-3)Galβ1-4Glcβ1-1神经酰胺结构的α2-3连接的唾液酸(SA)的表位的抗GM2抗体，结合所述表位并显示出效应活性的抗GM2抗体，以及在间皮瘤患者中抑制胸膜积液产生的抗体。
其他实例包括与任何上述抗体竞争与GM2的结合的抗体，与上述抗体所结合的表位相同的表位结合的抗体，以及这些抗体的片段。
具体来说，在本发明中使用的抗体可以是下列任一抗体：
在JP-A-4-311385中描述的小鼠单克隆抗体KM750和小鼠单克隆抗体KM796；
在Cancer Res.,46,4116(1986)中描述的单克隆抗体MoAb5-3；
在Cancer Res.,48,6154(1988)中描述的单克隆抗体MK1-16和单克隆抗体MK2-34；
在J.Biol.Chem.,264,12122(1989)中描述的单克隆抗体DMAb-1；
在WO2003/049704和WO04/53102中描述的嵌合抗体DMF10.167.4抗体和嵌合抗体ChGM2；
在JP-A-10-257893中描述的由转化株KM8966(FERM BP-5105)产生的KM8966，由转化株KM8967(FERM BP-5106)产生的KM8967，由转化株KM8969(FERM BP-5527)产生的KM8969和由转化株KM8970(FERM BP-5528)产生的KM8970；
包含分别具有SEQ ID NO：1至3的氨基酸序列的H链CDR 1至3和分别具有SEQ ID NO：4至6的氨基酸序列的L链CDR 1至3的抗体；
包含具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的VL的抗体；
包含具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的VL的抗体；
包含具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的VL的抗体；以及
包含具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的VL的抗体。
与上面这些抗体竞争与GM2的结合的抗体以及与上述抗体所结合的表位相同的表位结合的抗体，也可用于本发明。
在本发明中使用的抗GM2抗体可以是单克隆抗体、寡克隆抗体和多克隆抗体中的任一种，并且优选结合单一表位的单克隆抗体。
在本发明中使用的单克隆抗体可以是由杂交瘤产生的单克隆抗体或使用基因重组技术产生的遗传重组抗体。为了降低在人类中的免疫原性，优选使用人类嵌合抗体(在后文中也简称为“嵌合抗体”)、人源化抗体[也称为人类互补决定区(CDR)移植抗体]和使用基因重组技术产生的人类抗体。
作为在本发明中使用的抗体，在上面提到的抗体中优选使用人源化抗体和人类抗体。
嵌合抗体是由非人类动物抗体的VH和VL以及人类抗体的重链恒定区(在后文中简称为“CH”)和轻链恒定区(在后文中简称为“CL”)构造而成的抗体。对于可变区来说，对动物的类型没有特别限制，只要使用能够产生杂交瘤的动物即可，例如小鼠、大鼠、仓鼠和兔。
人类嵌合抗体可以如下产生：获得特异性结合GM2的非人类动物抗体的VH和VL的编码cDNA，将所述cDNA插入到包含人类抗体的CH和CL的编码基因的表达载体中以构建用于人类嵌合抗体的表达载体，并将所述载体导入到用于表达的动物细胞中。对人类嵌合抗体的CH没有特别限制，只要它是人类免疫球蛋白(在后文中缩写为“hIg”)即可。优选地，CH是hIgG类型的。对人类嵌合抗体的CL没有特别限制，只要它属于hIgG即可。
人源化抗体是通过将非人类动物抗体的VH和VL的互补决定区(在后文中缩写为“CDR”)移植到人类抗体的VH和VL中的适合位置处而产生的抗体。人类CDR移植抗体可以如下生产：构建通过将GM2特异性非人类动物抗体的VH和VL的CDR移植到任何人类抗体的VH和VL骨架区(在后文中缩写为“FR”)而制备的V区的编码cDNA，将所述cDNA插入到包含人类抗体的CH和CL的编码DNA的表达载体中，以构建用于人源化抗体的表达载体，并将所述载体导入到用于表达的动物细胞中。对人类抗体的VH和VL的FR的氨基酸序列没有特别限制，只要它们是源自于人类抗体的氨基酸序列即可。
对人源化抗体的CH没有特别限制，只要它是hIg即可。优选地，CH是hIgG类型的。对人源化抗体的CL没有特别限制，只要它属于hIg即可。
在本发明中使用的人源化抗体的具体实例可以包括这样的人源化抗体：其具有选自下列抗GM2抗体的抗体的CDR氨基酸序列或VH和VL氨基酸序列：
在JP-A-4-311385中描述的小鼠单克隆抗体KM750和小鼠单克隆抗体KM796；
在Cancer Res.,46,4116(1986)中描述的单克隆抗体MoAb5-3；
在Cancer Res.,48,6154(1988)中描述的单克隆抗体MK1-16和单克隆抗体MK2-34；
在J.Biol.Chem.,264,12122(1989)中描述的单克隆抗体DMAb-1；
在WO2003/049704和WO04/53102中描述的嵌合抗体DMF10.167.4抗体和嵌合抗体ChGM2；
在JP-A-10-257893中描述的由转化株KM8966(FERM BP-5105)产生的KM8966，由转化株KM8967(FERM BP-5106)产生的KM8967，由转化株KM8969(FERM BP-5527)产生的KM8969和由转化株KM8970(FERM BP-5528)产生的KM8970。
更具体的实例可以包括：
包含分别具有SEQ ID NO：1至3的氨基酸序列的H链CDR 1至3和分别具有SEQ ID NO：4至6的氨基酸序列的L链CDR 1至3的人源化抗体；
包含具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的VL的人源化抗体；
包含具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的VL的人源化抗体；
包含具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的VL的人源化抗体；以及
包含具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的VL的人源化抗体。
本发明的治疗剂中包含的抗GM2抗体片段可以是任何上述抗体的片段。对抗体片段的类型没有特别限制，并且可以是例如Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、双价抗体(diabody)、dsFv或包含CDR的肽。
Fab是在用木瓜蛋白酶(蛋白酶)处理IgG抗体所获得的片段中，具有约50,000的分子量并具有抗原结合活性的抗体片段。可以通过用木瓜蛋白酶处理抗GM2抗体，或通过将编码抗体的Fab的DNA插入到表达载体中，并将所述载体导入到原核或真核生物中并在其中表达，来产生抗GM2抗体的Fab。
F(ab’)2是在用胃蛋白酶(蛋白酶)处理IgG抗体所获得的片段中，具有约100,000的分子量并具有抗原结合活性的抗体片段。可以通过用胃蛋白酶处理抗GM2抗体，或通过用硫醚键或二硫键键合Fab'(在下文中描述)，来产生抗GM2抗体的F(ab')2。
F(ab’)是具有约50,000的分子量并具有抗原结合活性的抗体片段，其中上述F(ab’)2的铰链区的二硫键被切开。可以通过用二硫苏糖醇处理抗体的F(ab’)2，或通过将编码抗体的Fab’的DNA插入到表达载体中，并将该载体导入到原核或真核生物中进行表达，来产生F(ab’)。
scFv是一种具有抗原结合活性的抗体片段，其具有使用适合的肽接头连接的单个VH和单个VL。scFv可以如下制备：获得编码抗体的VH和VL的cDNA，构建编码scFv的DNA，将该DNA插入到表达载体中，并将该表达载体导入到原核或真核生物中进行表达。
双价抗体是作为由显示出相同或不同抗原结合特异性的scFv形成的二聚体的抗体片段，并且这种抗体片段具有针对相同抗原的二价抗原结合活性，或具有针对两种不同类型抗原的二价抗原结合活性。双价抗体可以如下产生：获得编码抗体的VH和VL的cDNA，构建编码双价抗体的DNA，将该DNA插入到表达载体中，并将该表达载体导入到原核或真核生物中进行表达。
dsFv是一种抗体片段，其中将VH和VL的每一个中的1个氨基酸残基用半胱氨酸残基置换，并将多肽通过这些半胱氨酸残基之间的二硫键相连。dsFv可以如下制备：获得编码抗体的VH和VL的cDNA，构建编码dsFv的DNA，将该DNA插入到表达载体中，并将该表达载体导入到原核或真核生物中进行表达。
包含CDR的肽是包含VH或VL的CDR的至少一个或多个区域的肽。包含抗体的CDR的肽可以如下产生：构建编码抗体的VH和VL的CDR的DNA，将该DNA插入到表达载体中，并将该表达载体导入到原核或真核生物中进行表达。
包含CDR的肽也可以通过化学合成方法例如Fmoc方法(芴甲氧羰基方法)或tBoc方法(叔丁氧羰基方法)来生产。
在本发明中使用的抗GM2抗体具有效应活性。在本发明中，“效应活性”是指通过抗体的Fc区诱导的活性。其已知实例包括抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC活性)、补体依赖性细胞毒性(CDC活性)、由吞噬细胞例如巨噬细胞和树突状细胞产生的抗体依赖性吞噬作用(ADP活性)。
作为控制效应活性的方法，已知的是控制通过复合型N-连接糖链的还原末端中的α-1,6键结合到N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)的岩藻糖(也称为核心岩藻糖)的量的方法，所述糖链结合抗体的Fc区的根据EU索引(Kabat等，《免疫学重要的蛋白质的序列》(Sequence of Proteins ofImmunological Interests)，第5版，1991)的297位处的天冬酰胺(Asn)(WO 2005/035586，WO 2002/31140，WO 00/61739)，以及通过替换抗体的Fc区的氨基酸残基来控制活性的方法等。
通过控制结合于抗体的Fc区的复合型N-连接糖链的核心岩藻糖的含量，可以提高或降低抗体的效应活性。降低待与结合于抗体的Fc区的复合型N-连接糖链结合的岩藻糖的含量的方法，是通过使用缺失了α1,6-岩藻糖转移酶基因(岩藻糖转移酶-8，FUT8)的CHO细胞来表达抗体，获得结合于所述抗体的Fc区的复合型N-连接糖链未结合有核心岩藻糖的抗体(在后文中被称为“非岩藻糖基化抗体”)。因此，优选地，在本发明中使用的抗GM2抗体不具有低的核心岩藻糖含量，或者没有结合于它的岩藻糖。
未结合有岩藻糖的抗体具有较高的ADCC活性。另一方面，作为提高与结合于抗体的Fc的复合型N-连接糖链结合的岩藻糖的含量的方法，使用已导入α1,6-岩藻糖转移酶基因的宿主细胞来表达抗体，由此可以获得结合有岩藻糖的抗体。结合有岩藻糖的抗体的ADCC活性比未结合有岩藻糖的抗体低。
通过修饰抗体的Fc区中的氨基酸残基，可以提高或降低ADCC活性或CDC活性。修饰Fc区中的氨基酸残基提高或降低了与FcγR的结合活性，并使得ADCC活性能够被调节。Fc区中氨基酸残基的修饰也提高或降低补体结合活性，并使得CDC活性能够被调节。
例如，通过使用在美国专利申请公布号2007-0148165和2012-0010387的说明书中所描述的Fc区或CH的氨基酸序列，可以提高抗体的CDC活性。通过如美国专利号6,737,056、7,297,775、7,317,091和WO2005/070963的说明书中所述修饰氨基酸残基，可以提高或降低ADCC活性或CDC活性。
本发明的治疗剂可以通过给药于间皮瘤患者来治疗间皮瘤患者。在给药后，作为活性成分被包含的抗GM2抗体与在间皮瘤细胞上表达的GM2特异性结合，并表现出各种抗肿瘤效应，包括间皮瘤细胞生长的抑制效应、胸膜积液的产生的抑制效应和由效应细胞例如自然杀伤细胞(NK细胞)引起的ADCC活性的诱导。因此，作为本发明的治疗剂，可以示例的是包含抗GM2抗体作为活性成分的间皮瘤治疗剂。
本发明的间皮瘤治疗剂可以是任何治疗剂，只要它包含抗GM2抗体作为活性成分即可。通常，本发明的间皮瘤治疗剂优选地被提供成通过使用制药学领域中公知的方法而生产的、作为与一种或多种可药用载体的混合物的药物制剂。
优选地，使用通过将抗体溶解在水性载体例如水性溶液(例如水、盐水、甘氨酸、葡萄糖、人类白蛋白等)中而制备的无菌溶液。此外，可以向制剂溶液添加可药用添加剂例如缓冲剂或等渗剂(例如乙酸钠、氯化钠、乳酸钠、氯化钾、柠檬酸钠等)，以接近生理条件。此外，可以将它冷冻干燥然后储存。如果需要，可以在使用时将它溶解在适合的溶剂中。
优选地，本发明的治疗剂通过对治疗最有效的途径给药。其实例可以包括口服给药和肠胃外给药例如口腔、气管、直肠内、皮下、肌肉内、脊柱内或静脉内给药。其中，脊柱内或静脉内给药是优选的。
适用于口服给药的制剂的实例可以包括乳液、糖浆、囊剂、片剂、粉剂、颗粒剂等。液体制剂例如乳液和糖浆，可以使用水，糖类例如蔗糖、山梨糖醇、果糖等，二醇类例如聚乙二醇、丙二醇等，油类例如芝麻油、橄榄油、大豆油等，防腐剂例如对羟基苯甲酸酯等，调味剂例如草莓调味剂、胡椒薄荷等作为添加剂来生产。囊剂、片剂、粉剂、颗粒剂等，可以使用赋形剂例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇等，崩解剂例如淀粉、藻酸钠等，润滑剂例如硬脂酸镁、滑石等，粘合剂例如聚乙烯醇、羟丙基纤维素、明胶等，表面活性剂例如脂肪酸酯等，增塑剂例如甘油等作为添加剂来生产。
适用于肠胃外给药的制剂的实例可以包括注射剂、栓剂、喷雾剂等。注射剂可以使用载体例如盐溶液、葡萄糖溶液和其两者的混合物来制备。栓剂可以使用载体例如可可脂、氢化脂肪、羧酸等来制备。
喷雾剂可以使用原样的抗体或将它与不刺激接受者的口腔或气道粘膜并且可以通过将所述抗体分散成细小粒子等来促进其吸收的载体一起使用来制备。载体的具体实例可以包括乳糖、甘油等。取决于抗体和使用的载体的性质，可以生产诸如气溶胶和干粉的制剂。此外，作为用于口服制剂的添加剂而示例的组分，也可以被添加到肠胃外制剂。
本发明的治疗剂的给药剂量或频率将随着所需治疗效果、给药途径、治疗时间长度、年龄、体重等而变。成年人的给药剂量通常为每日1μg/kg至10mg/kg。
本发明的治疗剂涵盖了包含本发明中使用的抗GM2抗体和至少一种合用药的治疗剂。
合用药的实例可以包括化疗药剂和蛋白质药物。
化疗药剂的实例可以包括多柔比星、脂质体多柔滨、顺铂、卡铂、长春新碱、氟达拉滨、吉西他滨、培美曲塞、沙利度胺、来那度胺和泊马度胺。优选的是顺铂和培美曲塞。
此外，例如，抑制与血管发生相关的酪氨酸激酶的E7080，也可以用作合用药。
蛋白质药物的实例可以包括细胞因子和抗体。
例如，细胞因子可以是激活免疫活性细胞例如NK细胞、巨噬细胞、单核细胞、粒细胞的效应细胞的细胞因子，以及这样的细胞因子的衍生物。
细胞因子的具体实例可以包括白介素-2(IL-2)、干扰素(IFN)-α、IFN-γ、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、分形趋化因子(fractalkine)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、GM-CSF、G-CSF和肿瘤坏死因子(TNF)-α、TNF-β、IL-1α和IL-1β，优选的实例是IFN-γ。
所述抗体的实例可以包括针对本发明中使用的特异性结合GM2的重组抗体所靶向的间皮瘤的治疗性抗体、抑制血管生成的抗体、激活免疫活性的抗体、这些抗体的片段或融合抗体。
具体实例可以包括抗CD40抗体(例如SGN-40和HCD122)、抗VEGF抗体(例如贝伐单抗)、抗IL-6R抗体(日本专利号651541的说明书)、抗IL-6抗体(CNTO328)、抗CTLA4抗体(例如易普利单抗)和抗CCR4抗体(例如莫格利珠单抗(mogamulizumab))等。
本发明的抗体或抗体片段的实例可以包括结合于可以同时使用的药物的抗体或抗体片段。
本发明的治疗剂可用于治疗已发展出间皮瘤的组织，只要所述间皮瘤表达GM2即可，而不论是良性还是恶性的。本发明还包括组合疗法，其中将包含抗GM2抗体作为活性成分的用于间皮瘤的治疗剂与合用药同时或分开地给药。
本发明还包括治疗间皮瘤患者的方法，所述方法包括给药作为活性成分的抗GM2抗体。本发明的用于治疗间皮瘤患者的方法还包括用于治疗间皮瘤患者的组合疗法，其中将至少一种合用药与活性成分抗GM2抗体的给药同时或分开地给药于间皮瘤患者。在所述组合疗法中，抗GM2抗体和合用药可以以任何顺序给药，并且可以按照间皮瘤患者的阶段和状况恰当地决定。
作为抗GM2抗体特异性结合表达GM2的间皮瘤细胞的结果，本发明的间皮瘤治疗方法可以抑制间皮瘤细胞的增殖和胸膜积液的产生。
通过抗GM2抗体与表达GM2的间皮瘤细胞的特异性结合，本发明的间皮瘤治疗方法还可以表现出针对间皮瘤细胞的细胞毒性以及由患者身体中存在的效应细胞例如自然杀伤细胞(NK细胞)所介导的ADCC活性，抑制间皮瘤细胞增殖和胸膜积液产生。
因此，本发明还包括用于抑制间皮瘤细胞增殖的方法、用于在间皮瘤细胞中诱导细胞毒性的方法和使用抗GM2抗体抑制胸膜积液产生的方法。
本发明的治疗方法和治疗剂的有效性可以使用动物模型，通过体内抗肿瘤活性测定法来检查。
动物模型的实例可以包括通过将源自于人类癌组织的培养的细胞系移植到小鼠中而制备的异种移植模型。可以通过将人类癌细胞系移植到免疫缺陷小鼠例如SCID小鼠的各种不同位点，例如皮下、真皮内、胸内、心包内、腹膜内或静脉内，来产生所述异种移植模型。
动物模型可用于评估本发明的治疗剂的有效性，包括抗体的单独给药的有效性和与合用药组合给药的有效性。
本发明还包括用抗GM2抗体诊断间皮瘤的方法。通过用抗GM2抗体或其片段检测或测定GM2或表达GM2的细胞和/或组织，可以诊断患有涉及GM2的间皮瘤的患者。
首先，使用从健康个体的身体收集的生物样品，使用免疫学技术(在下文中描述)，利用抗GM2抗体或其片段或衍生物来检测或测定GM2，并确定来自于这些健康个体的生物样品中GM2的量。
还确定对象的生物样品的GM2水平，并与健康个体的水平进行比较。当对象的GM2水平高于健康个体的水平时，对象被诊断为患有间皮瘤。
免疫学技术是指使用标记的抗原或抗体检测或测定抗体或抗原水平的技术。例如，使用放射免疫测定法、酶免疫测定法、荧光免疫测定法、发光免疫测定法、蛋白质印迹、生理化学技术等。
在放射免疫测定法中，例如，将抗GM2抗体或其片段与抗原或抗原表达细胞反应，并进一步与放射性标记的抗免疫球蛋白抗体或结合片段反应。然后，使用闪烁计数器等进行测量。
在酶免疫测定法中，例如，将抗GM2抗体或其片段与抗原或抗原表达细胞反应，并进一步与标记的抗免疫球蛋白抗体或结合片段反应。然后，使用吸收分光计测量生成的颜色。例如，可以使用夹心ELISA。
作为在酶免疫测定法中使用的标记物，可以使用任何已知的酶标记物[酶免疫测定法(Enzyme Immunoassay),IGAKU-SHOIN Ltd.(1987)]。其实例包括碱性磷酸酶标记、过氧化物酶标记、萤光素酶标记、生物素标记等。夹心ELISA是将抗体结合于固相，捕获待检测或测量的抗原，并允许另一种抗体与被捕获的抗原反应的方法。
在ELISA中，制备抗原识别位点不同的两种识别待检测或测量抗原的抗体或其抗体片段，将一种抗体或抗体片段先行吸附在板(例如96孔板)上，并将另一种抗体或抗体片段用荧光物质例如FITC、酶例如过氧化物酶或生物素等标记。
允许吸附有上述抗体的板与从活体分离的细胞或其裂解液、组织或其破碎溶液、细胞培养上清液、血浆、胸膜积液、腹水、眼液等反应，然后允许与标记的单克隆抗体或抗体片段反应，并根据被标记的物质进行检测反应。试验样品中的抗原浓度，可以从通过已知浓度的抗原的逐步稀释制备的校准曲线来计算。
例如，用于GM2的ELISA可以以下列方式进行。将GM2溶解在含有磷脂酰胆碱和胆甾醇的乙醇溶液中。然后将溶液分发到微量滴定板的每个孔中，并在空气干燥后用含有牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)(在后文中缩写为“BSA-PBS”)进行阻断。然后将GM2抗体与其反应，并进一步将用适合的酶标记的第二抗体与其反应，由此测定GM2水平。
作为用于夹心ELISA的抗体，可以使用任何多克隆抗体和单克隆抗体，或者可以使用抗体片段例如Fab、Fab’和F(ab)2。
作为在夹心ELISA中使用的两种抗体的组合，可以使用识别不同表位的单克隆抗体或抗体片段的组合，或者可以使用多克隆抗体与单克隆抗体或抗体片段的组合。
荧光免疫测定法包括在文献[《单克隆抗体——原理与实践》(Monoclonal Antibodies-Principles and practice)，第三版，AcademicPress(1996)；《单克隆抗体实验手册》(Manual for MonoclonalAntibody Experiments)，Kodansha Scientific(1987)]中描述的方法等。作为用于荧光免疫测定法的标记物，可以示例的是任何已知的荧光标记物[荧光免疫测定法(Fluorescent Immunoassay),Soft Science,(1983)]。例如，使用荧光异硫氰酸酯(FITC)、RITC、Cy3、Cy5、Alexa等。
发光免疫测定法使用在文献[生物发光和化学发光(Bioluminescence and Chemical Luminescence),临床试验(clinicaltest),42,Hirokawa Shoten(1998)]中描述的方法等来进行。作为用于发光免疫测定法的标记物，可以示例的是任何已知的发光标记物。其实例可以包括吖啶酯、洛芬碱等。
蛋白质印迹如下进行。通过SDS(十二烷基硫酸钠)-PAGE将抗原或表达抗原的细胞分离[《抗体实验指南》(Antibodies-A LaboratoryManual)，Cold Spring Harbor Laboratory,(1988)]。然后，将凝胶转印到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜或硝酸纤维素膜上，并允许膜与识别抗原的抗体或抗体片段反应。允许它进一步与用荧光物质例如FITC、酶标记物例如过氧化物酶、生物素标记物等标记的抗小鼠IgG抗体或抗体片段反应。在反应后，将标记物可视化以进行测量。其实例在下文中描述。
将表达GM2的细胞或组织裂解，并使用SDS-PAGE在还原条件下以每道0.1至30μg的蛋白量进行电泳。将电泳过的蛋白转移到PVDF膜，然后将其在室温下，在含有1至10％BSA的PBS(在后文中称为“BSA-PBS”)中放置30分钟进行阻断。
然后允许本发明的单克隆抗体与其反应。在用含有0.05至0.1％的Tween-20的PBS(在后文中称为“Tween-PBS”)清洗后，将与过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG的反应在室温下进行2小时。
将它用Tween-PBS清洗，并使用例如蛋白质印迹检测试剂(由Amersham制造)检测结合于单克隆抗体的带，由此检测GM2。使用可以结合GM2的抗体进行蛋白质印迹检测。
在生理化学技术中，例如，通过抗原GM2和抗GM2抗体或其片段的结合形成凝集物，并检测凝集物。生理化学技术也可以使用诸如毛细管技术、单向免疫扩散、免疫比浊法和乳胶增强免疫比浊法[《临床检验方法概述》(An Outline of Clinical Test Methods)，Kanehara&Co.,Ltd.(1998)]的方法来进行。
在乳胶免疫比浊法中，可以使用载体例如用抗体或抗原敏化的粒子尺寸为0.1至1μm的聚苯乙烯乳胶，并且当使用相应的抗原或抗体进行抗原-抗体反应时，反应溶液中的散射光增加，同时透射光减少。通过检测诸如吸光度或积分球浊度的变化，可以测量试验样品中的抗原浓度等。
可以使用已知的免疫检测技术来检测或测定表达GM2的细胞。优选使用免疫沉淀、免疫细胞化学、免疫组织染色、荧光抗体染色等。
在免疫沉淀中，将表达GM2的细胞或含有GM2的组织提取物与抗GM2抗体或其片段反应，并加入能够特异性结合免疫球蛋白的载体例如蛋白G-琼脂糖凝胶，以沉淀抗原-抗体复合物。它也可以以下述方式进行。
将本发明的单克隆抗体或其片段固定在ELISA 96孔板上，并用BSA-PBS进行阻断。当抗体处于未纯化状态下，例如在杂交瘤培养物上清液中时，在将例如抗小鼠免疫球蛋白、抗大鼠免疫球蛋白、蛋白A或蛋白G固定在ELISA 96孔板上并用BSA-PBS阻断后，分发杂交瘤培养物上清液进行结合。
在弃去BSA-PBS后，将它用PBS充分清洗，并与表达GM2的细胞或组织的裂解液反应。在将板充分清洗后，使用SDS-PAGE样品缓冲液提取免疫沉淀物，并通过蛋白质印迹进行检测。
在免疫细胞化学和免疫组织染色中，将表达抗原的细胞或组织在任选地用表面活性剂或甲醇处理以提高抗体渗透性后，与抗GM2抗体反应。在与用荧光标记物例如FITC、酶标记物例如过氧化物酶、生物素等标记的抗免疫球蛋白抗体或其结合片段进一步反应后，将标记物可视化，并使用显微镜观察。
检测也可以使用涉及荧光标记的抗体与细胞的反应的荧光抗体染色以及流式细胞仪分析来进行[《单克隆抗体——原理与实践》(Monoclonal Antibodies-Principles and practice)，第三版，AcademicPress(1996)，和《单克隆抗体实验手册》(Monoclonal AntibodyExperiment Manual)，Kodansha Scientific(1987)]。具体来说，使用荧光抗体染色，在本发明中使用的抗GM2抗体或其片段可用于检测表达在细胞膜上的GM2。
此外，当将FMAT 8100 HTS系统(Applied Biosystems)用于荧光抗体染色时，可以测量抗原或抗体水平而不需将不参与抗体-抗原复合物形成的游离抗体或抗原与所述抗原-抗体复合物分离开。
实施例
下面使用实施例对本发明进行描述。然而，本发明不受下面的实施例限制。
[实施例1]通过流式细胞术(FCM)分析恶性间皮瘤细胞系中GM2的表达
恶性间皮瘤细胞系NCI-H226(CRL-5826)、MSTO-211H(CRL-2081)和NCI-H2452(CRL-5946)从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)获得。恶性间皮瘤细胞系ACC-MESO-1(RCB-2292)从Riken细胞库获得。它们被用于实验(Cancer Sci 2006；97:387-394)。
将四种恶性间皮瘤细胞系用0.02％EDTA溶液释放，并将细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗，悬浮在通过向含有1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS(在后文中缩写为“BSA-PBS”)添加0.05％NaN3和0.02％EDTA而制备的缓冲液(在后文中缩写为“FCM缓冲液”)中。
使用α1,6-岩藻糖基转移酶(FUT8)基因组基因敲除的CHO细胞(WO2005/035586)，从VH和VL分别具有SEQ ID NO：10和11的氨基酸序列的抗GM2人源化抗体(日本专利号4550947和美国专利号6,872,392的说明书)产生抗GM2抗体，并使用所述抗GM2抗体。
将细胞悬液分发在U形底96孔板中(2×105个细胞/50μL/孔)。通过向板以50μL/孔的量添加10μg/mL的用FCM缓冲液稀释后的抗GM2人源化抗体或抗二硝基苯肼(DNP)抗体(阴性对照；Motoki等，Clin.Cancer Res.,11,3126-3135,2005)来制备试验样品。然后，允许混合物在冰上反应1小时。
将细胞用PBS清洗三次，并以50μL/孔的量添加稀释300倍后的作为第二抗体的Alexa Fluor488山羊抗人IgG(H+L)抗体(MolecularProbes)。然后，允许混合物在暗处在冰上反应30分钟。在用PBS再次清洗三次后，将细胞悬浮在PBS中。使用流式细胞仪(Cytomics Fc500MPL/Beckman Coulter)测量被488-nm氩离子激光器激发的510至530nm的荧光强度。结果示出在图1中。
结果，抗GM2抗体显示出与所有恶性间皮瘤细胞系具有反应性。抗GM2抗体和抗DNP抗体与每个孔反应的平均荧光强度(MFI)值为NCI-H226(33，1.5)、MSTO-211H(18.8，1.03)、ACC-MESO-1(298，1.17)和NCI-H2452(57.9，1.24)。因此在所有四种恶性间皮瘤中发现了GM2表达。
这些结果表明，在临床上GM2也表达在恶性间皮瘤中，并且证明抗GM2抗体可实际用于恶性间皮瘤的治疗或诊断。
[实施例2]抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC活性)测定
2.1 靶细胞悬液的制备
收集恶性间皮瘤细胞系MSTO-211H，并用含有5％胎牛血清(FBS)的无酚红的RPMI-1640培养基(由WAKO制造；在后文中缩写为“ADCC测定培养基”)清洗。使用相同培养基制备细胞悬液(1×104个细胞/50μL)。
2.2 效应细胞悬液的制备
将从AllCells Corporation购买的冷冻的人外周血单核细胞(MNC)用作效应细胞。将冷冻的MNC融化，并悬浮在通过向20mL含有10％胎牛血清(FCS)、青霉素、链霉素、谷氨酰胺、非必需氨基酸(NEAA)、丙酮酸和Hepes的RPMI1640培养基(均从Invitrogen获得)添加50μLDNase I(重组DNase I，无RNase，由Roche制造)而制备的培养基中(在后文中缩写为“恢复培养基”)。
在离心(450×g，10分钟)后，将细胞重悬浮在20mL恢复培养基中，并允许其在37℃和5％CO2条件下静置2小时。将得到的外周血单核细胞(PBMC)用ADCC测定培养基清洗两次，并使用相同培养基制备浓度为1×106个细胞/50μL的效应细胞悬液。
2.3 ADCC活性测定
将所需浓度的抗GM2抗体或抗DNP抗体(阴性对照)溶液分发在U形底96孔板的每个孔中(50μL/孔)，并以100的效应细胞(E)比靶细胞(T)比率(E/T比率)加入在上面2.1中制备的靶细胞悬液(50μL)和在上面2.2中制备的效应细胞悬液(50μL)。通过加入ADCC测定培养基将总体积调整到150μL。
在离心(50×g，3分钟)后，允许在37℃反应4小时。在反应后，将细胞再次离心(50×g，5分钟)，并使用CytoTox 96非放射活性细胞毒性测定(Promega)，按照制造商的流程测量上清液中的乳酸脱氢酶(LDH)活性。
ADCC活性从下列方程确定。
细胞毒性(％)＝([样品的吸光值]-([效应细胞自发释放的吸光值]+[靶细胞自发释放的吸光值]))/([总靶细胞释放的吸光值]-[靶细胞自发释放的吸光值])×100
这里，通过测量通过添加靶细胞溶液(50μL)和培养基(100μL)而制备的每个孔的吸光值，来获得靶细胞自发释放值。通过测量通过添加靶细胞溶液、效应细胞溶液和培养基(各50μL)而制备的每个孔的吸光值，来获得靶细胞和效应细胞自发释放值。
总靶细胞释放值以类似的方式，在添加靶细胞溶液(50μL)和培养基(85μL)后进行的反应结束前45分钟向孔添加试剂盒随附的裂解溶液(15μL)，从所述孔获得。结果示出在图2(a)和(b)中。
结果，恶性间皮瘤细胞系MSTO-211H以依赖于抗GM2抗体浓度的方式受损。因此证实了抗GM2抗体表现出针对恶性间皮瘤细胞的ADCC活性。
这些结果表明，给药于恶性间皮瘤患者的抗GM2抗体，可以通过患者体内存在的效应细胞表现出对癌细胞的细胞毒性。
[实施例3]在SCID小鼠中使用恶性间皮瘤细胞系MSTO-211H原位移植模型进行的抗GM2抗体的效能评估
在移植癌细胞前2天，将抗TM-β1抗体(300μg；抗小鼠IL-2受体β链抗体)[J.Immunol.,147,2222(1991)]给药于SCID小鼠(CLEA Japan)。在癌细胞移植当天，将每只小鼠用乙醚麻醉，并从右胸壁剃除毛发。将皮肤和皮下组织切开以暴露出胸膜壁层。然后使用27G注射器将MSTO-211H细胞悬液(1×106个细胞/100μL)穿过胸膜壁层给药到胸腔中，并将切口缝合。
为了评估抗GM2抗体的间皮瘤治疗效果，在癌细胞移植后第7日和14日静脉内给药抗GM2人类抗体(10μg)。
此外，为了评估人类免疫细胞的贡献，在癌细胞移植后第7日和14日，静脉内给药使用淋巴细胞分离培养基(LSM)从健康个体的外周血分离的人类单核细胞(MNC；1×106个细胞)。在移植后第21日将小鼠杀死，并检查胸部肿瘤的存在或不存在、肿瘤尺寸、胸膜积液的存在或不存在以及胸膜积液的量。通过进行Dunnett多重比较检验来确定统计学显著的差异。结果示出在图3和表1中。
[表1]
结果，在给药抗GM2抗体的小鼠中，与未给药抗体的小鼠和给药人类MNC的小鼠中相比，胸部肿瘤的发生率和平均肿瘤质量明显更小。胸膜积液积累的发生率也降低。
用抗GM2抗体和人类MNC两者给药的小鼠，与用人类MNC或抗GM2抗体给药的小鼠相比，具有更低的胸部肿瘤发生率和更小的平均肿瘤质量。在人类MNC的单独给药中没有观察到抗肿瘤效果这一结果，表明人类MNC提高抗GM2抗体的抗肿瘤效果并改进效能。
这些结果表明了抗GM2抗体对恶性间皮瘤患者的潜在有效性。
[实施例4]在SCID小鼠恶性间皮瘤细胞系MSTO-211H原位移植模型中GM2的表达
从移植了人类恶性间皮瘤细胞系MSTO-211H的小鼠的胸部区域取出肿瘤块，并包埋在OCT化合物中。将包埋的块切成约6-μm切片，并产生冷冻组织切片。然后如下进行免疫组织化学染色。
(1)将组织切片在无水丙酮中，在室温下固定5分钟，并空气干燥30分钟。
(2)将组织切片在流水中清洗5分钟。
(3)将组织切片在1:10的稀浓度的MORPHOSAVE中，在室温下固定15分钟，并用PBS清洗两次，每次5分钟。
(4)允许组织切片在内源过氧化物酶阻断溶液(2U/mL葡萄糖氧化酶，10mmol/L葡萄糖，1mmol/L叠氮化钠)中，在37℃下反应60分钟，并用PBS清洗两次，每次5分钟。
(5)允许组织切片在BSA-PBS(PBS中的1w/v％BSA)中，在室温下反应10分钟。
(6)将抗GM2抗体(第一抗体)与等量的以第一抗体的浓度的1.5倍使用的第二抗体[过氧化物酶偶联的亲和纯(affinipure)的驴抗人IgG(H+L)抗体](Jackson Immuno Research Laboratories)混合，并将混合物与组织切片在4℃反应过夜。
随后，加入浓度为第二抗体浓度的100倍的来自于人类血清的IgG(由Sigma-Aldrich制造)，并允许反应在溶液中，在4℃进行2小时，以产生前复合物(precomplex)混合物。允许组织切片在前复合物混合物中在室温下反应2小时，并用PBS清洗三次，每次5分钟。
(7)允许组织切片在通过将15mg DAB片溶解在PBS(100mL)中并加入33.3μL 30％过氧化氢溶液而制备的溶液(DAB底物色原)中，在室温下反应2分钟，并用PBS清洗三次，每次5分钟。
(8)将组织切片在苏木精中反应，并在流水中清洗10分钟。
(9)将组织切片用乙醇溶液脱水，并用二甲苯密封。染色的切片使用显微镜进行观察，并按照下述判据进行分类。染色位点(细胞质、细胞膜)也得到证实。结果示出在表2中。
[表2]
位点和染色的定义：M，细胞膜；C，细胞质
染色强度的判据：Neg，阴性；1+，微弱；2+，浅；3+，中等；4+，深
染色频率的判据：Neg，(未标记的细胞“阴性”)；1：<25％，2：>＝25％，<50％，
3：>＝50％，<75％，4：>＝75％
S：位点；I：强度；F：频率
结果，在原位移植到小鼠胸腔中的人类恶性间皮瘤细胞系MSTO-211H的肿瘤中，证实了细胞膜和细胞质的染色，表明GM2在原位移植的间皮瘤细胞的细胞膜和细胞质中表达。
[实施例5]使用人类恶性间皮瘤冷冻组织通过荧光免疫组织化学染色进行的GM2表达分析
包埋在OCT化合物中的人类恶性间皮瘤冷冻切片或人类恶性间皮瘤冷冻块从Origene获得，并被用于荧光免疫组织化学染色。供体信息示出在图4中。
此外，为了比较，从用人类恶性间皮瘤细胞系MSTO-211H原位移植的SCID小鼠的胸部区域取出肿瘤块，并包埋在OCT化合物中以制备冷冻组织块。将冷冻组织块切片，并用于按照下面的程序进行的染色。
(1)将冷冻切片在无水丙酮中，在室温下固定5分钟，并空气干燥30分钟。
(2)将冷冻切片用PBS清洗5分钟。
(3)允许冷冻切片在使用ddH2O制备的1μg/mL DAPI中，在室温下反应20分钟。
(4)将冷冻切片用PBS清洗5分钟。
(5)将冷冻切片在5％FBS-PBS中，在室温下反应10分钟。
(6)将冷冻切片在用PBS制备的30μg/mL第一抗体(Alexa 488标记的BIW-8962或Alexa 488标记的抗DNP抗体)中，在4℃下反应6小时。
(7)将冷冻切片用H2O清洗三次，每次1分钟。
(8)将盖玻片置于冷冻切片上，使用荧光显微镜观察切片并按照下面的判据进行分类。结果示出在表3中。
在表3中，染色强度从0至3分级。
0：无染色
1：非常弱的染色
2：明显的染色
3：强染色
[表3]
样品 频率(％) 染色强度 基质染色 组织学类型
FR0001D4BA 0 0 B
FR00020029 30 2 B
FR0002081F 0 0 Meso
FR000265FD 0 0 Meso
FR0002731F 30 3 Meso
FR00026B23 0 0 B
FR000265A2 0 0 B
FR0002939E 80 2 B
FR00035469 30 1 强 Meso
FR000011E5 0 0 Meso
FR00002E6B 0 0 中等 促结缔组织增生
FR00006328 50 3 Meso
FR00006A38 0 0 Meso
FR00018ABD 100 2 强 促结缔组织增生
FR00016972 0 0 促结缔组织增生
SX00002843 90 1 强 E
FR00005932 10 1 强 Meso
FR00004AF8 40 3 强 B
FR00005E39 80 3 促结缔组织增生
FR00017430 100 3 Meso
FR0001A6C1 100 1 强 B+促结缔组织增生
FR0001CA2A 100 3 NR
FR0001742F 50 3 Meso
FR000265FE 20 2 Meso
FR000293A0 0 0 B
FR00002E64 0 0 E
阳性对照
MSTO-211H 90 3
注)组织学类型：B，双相；E，上皮；Meso，没有亚型的间皮肿瘤；促结缔组织增生，纤维状；NR，未报道
结果，在26个样品中的15个中，证实了GM2在肿瘤细胞中的表达，强度范围为1至3。与作为阳性对照的源自于人类恶性间皮瘤细胞系MSTO-211H原位移植小鼠的肿瘤组织切片相比，在7个样品(27％)中证实了相同或更高的反应性。
这些结果表明神经节苷脂GM2在人类临床恶性间皮瘤中的高表达。
尽管已结合具体实施方式对本发明进行了描述，但对于本领域技术人员来说，显然可以对其做出各种不同修改和改变，而不背离本发明的范围和精神。本申请是基于2012年12月6日提交的美国临时申请号61/734087，其全部内容通过参考并入本文。
SEQ ID NO：1：HCDR1的氨基酸序列
SEQ ID NO：2：HCDR2的氨基酸序列
SEQ ID NO：3：HCDR3的氨基酸序列
SEQ ID NO：4：LCDR1的氨基酸序列
SEQ ID NO：5：LCDR2的氨基酸序列
SEQ ID NO：6：LCDR3的氨基酸序列
SEQ ID NO：7：人源化的VH的氨基酸序列
SEQ ID NO：8：人源化的VL的氨基酸序列
SEQ ID NO：9：人源化的VL的氨基酸序列
SEQ ID NO：10：人源化的VH的氨基酸序列
SEQ ID NO：11：人源化的VL的氨基酸序列

Claims (13)

1.一种用于间皮瘤的治疗剂或诊断剂，其包含结合神经节苷脂GM2的抗体或其片段作为活性成分。
2.权利要求1的治疗剂或诊断剂，其中所述间皮瘤是选自胸膜间皮瘤、腹膜间皮瘤和心包间皮瘤中的一种。
3.权利要求2的治疗剂或诊断剂，其中所述胸膜间皮瘤或所述腹膜间皮瘤是恶性胸膜间皮瘤或恶性腹膜间皮瘤。
4.权利要求1至3任一项的治疗剂或诊断剂，其中所述抗体是与GM2的α2-3连接的唾液酸(SA)结合的抗体。
5.权利要求1至4任一项的治疗剂或诊断剂，其中所述抗体是单克隆抗体。
6.权利要求1至5任一项的治疗剂或诊断剂，其中所述抗体是重组抗体。
7.权利要求6的治疗剂或诊断剂，其中所述重组抗体是选自嵌合抗体、人源化抗体和人类抗体中的一种。
8.权利要求1至7任一项的治疗剂或诊断剂，其中所述抗体是包含分别具有SEQ ID NO：1至3的氨基酸序列的重链(后文中的“H链”)互补决定区(CDR；在后文中缩写成“CDR”)1至3和分别具有SEQ IDNO：4至6的氨基酸序列的轻链(后文中的“L链”)CDR 1至3的抗体。
9.权利要求1至8任一项的治疗剂或诊断剂，其中所述抗体是选自下列中的一种：
包含具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的H-链可变区(在后文中被称为“VH”)和具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的L-链可变区(在后文中称为“VL”)的抗体；
包含具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的VL的抗体；
包含具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的VL的抗体；和
包含具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的VL的抗体。
10.权利要求1至9任一项的治疗剂或诊断剂，其包含至少一种合用药。
11.权利要求10的治疗剂或诊断剂，其中所述合用药是选自化疗药剂和蛋白质药物中的至少一种。
12.一种用于间皮瘤的治疗方法或诊断方法，其使用结合神经节苷脂GM2的抗体或其片段作为活性成分。
13.结合神经节苷脂GM2的抗体或其片段在制造间皮瘤治疗剂中的应用。
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