CN105017346B

CN105017346B - 三六支化甘露五糖六糖对甲氧基苯基糖苷及其制备方法与应用

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Publication number: CN105017346B
Application number: CN201510381372.8A
Authority: CN
Inventors: 张建军; 姜锐; 梁晓梅; 王道全
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2015-07-02
Filing date: 2015-07-02
Publication date: 2017-09-12
Anticipated expiration: 2035-07-02
Also published as: CN105017346A

Abstract

本发明提供一种三六支化甘露五糖六糖对甲氧基苯基糖苷及其制备方法与应用。其结构式如式I或式Ⅱ所示：所述化合物在制备抗HIV药物和治疗艾滋病药物中的应用。本发明从甘露糖出发，采用合理的合成策略，首先合成双糖受体及四糖受体，然后采用Schmidt糖苷化方法缩合分别得到全保护的甘露五糖及甘露六糖，该甘露五糖及甘露六糖经脱保护后得到目标五糖及六糖化合物。反应设计中巧妙的引入适当的保护基团，使整个反应过程高效进行，且操作简便。药学研究表明：式Ⅰ或式Ⅱ所示化合物具有显著的抗HIV‑1活性，可用作潜在的治疗艾滋病药物。

Description

三六支化甘露五糖六糖对甲氧基苯基糖苷及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及三六支化甘露五糖六糖对甲氧基苯基糖苷及其制备方法与应用。

背景技术

艾滋病(AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(HIV)感染引起的严重疾病。HIV属于RNA逆转录病毒，它对细胞的感染过程包括与宿主细胞融合，遗传信息转录并整合进入宿主细胞基因组，然后进行蛋白质表达，最后组装新病毒释放出细胞。抗艾滋病毒药物可以通过抑制或阻断病毒复制过程中的任何一个阶段以达到治疗和缓解疾病的作用。目前抗HIV药物主要包括三大类：核苷类逆转录酶制剂、非核苷类逆转录酶制剂及蛋白酶抑制剂。核苷类似物是应用最早、种类最多的一类，包括齐多夫定(zidovudine，AZT)，司他夫定(stavudine，d4T)等。这些药物在抗HIV-1感染和治疗AIDS中取得了一定的效果，但也表现出一定的毒副作用，而且由于HIV的易变异性引发的耐药问题使其应用受到限制。因此发展新的治疗策略或新型抗HIV药物一直受到人们的广泛关注。

甘露糖是众多生物活性寡糖中的重要构成单元之一，研究表明甘露寡糖在生命活动中起着非常重要的作用，有关含有甘露寡糖单元的生物源分子结构与活性研究已有很多文献报道(J.Am.Chem.Soc.,2011,133,16495–16502；J.Am.Chem.Soc.,2010,132,16651–16656；Bioorg.Med.Chem.Lett.,2003,13,327–330；Tetrahedron Letters.,2003,44,1791–1793；J.Org.Chem.2007,72,8976-8979)，其中，N-连接甘露糖寡糖的糖蛋白在一些基本的生命活动如细胞的识别、病毒和细菌的侵染、病体的恶化中起着重要的作用(Glycobiology.,1993,3,97；Chem.Rev.,1996,96,683；Science.,2001,291,2370)。最近的研究表明，N-glycan中糖的部分对人体CD2粘附功能有着不可缺少的作用，而且研究还发现“高甘露糖型”N-glycan与艾滋病HIV感染有关(J.Am.Chem.Soc.,2001,123,3892；J.Virol.1991,65,6461；Alfred Benzon Symp.1994,36,297)，而人体具有抗病毒防卫作用的CD2蛋白含有与天冬酰胺链接的寡糖链，具有如下的结构：

这两个N-链接寡糖分别由五个及六个甘露糖分子与两个乙酰氨基葡萄糖分子组成，研究表明此寡糖链对蛋白CD2的功能非常重要，去掉糖链的蛋白CD2不再具有能复合抗体的功能(J.Biol.Chem.1992,267,22428-22434；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1993,90,11613-11620)。在前期对甘露糖寡糖长期的结构设计、合成与活性研究中(Synthesis，2010,N0.10,1666-1672；Carbohydr.Res.,2007,342,2810-2817；Bioorg.Med.Chem.2003,11,4027-4037；Tetrahedron Lett.2003,44,1839-1842)，发明人积累了大量的研究数据，得出三糖以上寡糖是发挥生物活性的基本结构的结论，并获得具有潜在应用价值的寡糖分子(中国专利授权公告号：CN102617662B)。因此我们认为，对上述“高甘露糖型”N-glycan中特定糖基新颖结构的设计与研究，有可能发现潜在的新的抗病毒药物，但如何取舍其有效糖基单元，并在非还原端引入合适基团作为糖苷使整体结构具有很好的生物活性，始终是发明人的重点研究目标。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种糖苷类化合物及其制备方法。

本发明所提供的糖苷类化合物，其结构式如式I或式Ⅱ所示：

上述式I或式Ⅱ所示化合物是按照包括下述步骤的方法制备得到的：

1)在催化剂作用下，将式Ⅲ所示的双糖受体化合物或式Ⅴ所示的四糖受体化合物与式Ⅳ所示的单糖供体化合物进行缩合反应，得到式Ⅵ所示的全保护的甘露五糖化合物或式Ⅶ所示的全保护的甘露六糖化合物；

其中，Ac代表乙酰基，Bz代表苯甲酰基；

2)将式Ⅵ所示的全保护的甘露五糖化合物或式Ⅶ所示的全保护的甘露六糖化合物在饱和甲醇/氨溶液中进行保护基脱除反应，得到式Ⅰ或式Ⅱ所示化合物。

上述方法步骤1)中，式Ⅲ所示的双糖受体化合物与式Ⅳ所示单糖供体化合物的摩尔比可为1:3.3～4.0；

式Ⅴ所示的四糖受体化合物与式Ⅳ所示单糖供体化合物的摩尔比可为1:2.2～3.0；

所述催化剂可选自下述至少一种：N-碘代丁二酰亚胺/三氟甲磺酸(NIS/TfOH)、二甲基甲硫基硫鎓三氟甲磺酸盐(DMTST)和三甲硅基三氟甲磺酸(TMSOTf)，具体可为三甲硅基三氟甲磺酸(TMSOTf)。

所述催化剂为三甲硅基三氟甲磺酸(TMSOTf)时，三甲硅基三氟甲磺酸(TMSOTf)与式Ⅲ所示的双糖受体化合物或式Ⅴ所示的四糖受体化合物的摩尔比为0.01～0.5:1。

所述缩合反应的温度为-45℃～15℃，如-20～10℃。

所述缩合反应的时间可为2～4小时。

所述缩合反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂可选自下述至少一种：二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、甲苯、氯仿、乙腈、乙醚、DMF(N，N-二甲基甲酰胺)、THF(四氢呋喃)、DME(二甲氧基乙烷)等，具体可为二氯甲烷。

上述方法步骤1)中，式Ⅲ所示的双糖受体化合物可按照包括下述步骤的方法制备得到：

其中，Bz代表苯甲酰基；Alloc代表烯丙氧羰基；

以对甲氧基苯基甘露糖苷1作为起始原料，经过4,6-羟基的异丙叉基化得到化合物2、选择性烯丙氧羰基化、苯甲酰基化得到化合物3、解叉基保护得到化合物4，再进行选择性烯丙氧羰基化、苯甲酰基化得到全保护的甘露糖苷化合物5；

化合物5在钯盐、铵盐及硼氢化钠的作用下脱除烯丙氧羰基得到3,6-双羟基受体化合物6；

化合物5经过脱除1位对甲氧基苯基、三氯乙酰亚胺酯活化，得到甘露糖三氯乙酰亚胺酯7(糖基供体)；

以甘露糖三氯乙酰亚胺酯7作为糖基供体，以3,6-双羟基受体化合物6作为糖基受体进行缩合反应，得到1→6-α-连接双糖8，该双糖经过脱除烯丙氧羰基保护基得到式Ⅲ所示的双糖受体化合物。

上述方法步骤1)中，式Ⅴ所示的四糖受体化合物可按照包括下述步骤的方法制备得到：

以对甲氧基苯基甘露糖苷1作为起始原料，经过2,3-羟基的异丙叉基化得到化合物9，经苯甲酰基化、解叉基保护得到化合物10、经选择性乙酰化反应得到2位羟基裸露的糖基受体化合物11；

将糖基受体化合物11与式Ⅳ所示的单糖供体化合物进行缩合反应，得到1→2-α-连接双糖12，该化合物经过脱除1位对甲氧基苯基、三氯乙酰亚胺酯活化，得到甘露双糖三氯乙酰亚胺酯双糖供体13；

以甘露双糖三氯乙酰亚胺酯13作为糖基供体，以甘露双糖8作为糖基受体进行缩合反应，得到1→3-α-连接双糖14，该双糖经过脱除烯丙氧羰基保护剂得到式Ⅴ所示的四糖受体化合物。

上述方法步骤1)中，式Ⅳ所示的单糖供体化合物可按照包括下述步骤的方法制备得到：

以甘露糖为起始原料，经全苯甲酰化、选择性脱除1位苯甲酰基、1位三氯乙酰亚胺酯活化，即可得到式Ⅳ所示的单糖供体化合物。

上述方法步骤2)中，所述保护基脱除反应的反应温度为20～30℃，时间为4～8天。

本发明的再一个目的是提供式I或式Ⅱ所示化合物的应用。

本发明所提供的式I或式Ⅱ所示化合物是其在下述方面的应用：

1)在制备抗HIV药物中的应用；

2)在制备治疗艾滋病药物中的应用。

以式I或式Ⅱ所示化合物为活性成分制备的抗HIV药物或治疗艾滋病药物也属于本发明的保护范围。

所述抗HIV药物或治疗艾滋病药物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。

需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。

以式I所示或式Ⅱ所示化合物为活性成分制备的抗HIV药物或治疗艾滋病药物可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

本发明从甘露糖出发，采用合理的合成策略，首先合成双糖受体及四糖受体，然后采用Schmidt糖苷化方法缩合分别得到全保护的甘露五糖及甘露六糖，该甘露五糖及甘露六糖经脱保护后得到目标五糖及六糖化合物。反应设计中巧妙的引入适当的保护基团，使整个反应过程高效进行，且操作简便。

本发明制备得到的三六支化的对甲氧基苯基甘露糖五糖和六糖具有抗艾滋病活性，目前尚未见该结构及其应用的文献报道，同时，为了高效率合成目标分子，本发明实现了目标分子的高效简明制备方法，其特点是采用部分保护的糖作为受体，通过高区域选择性糖基化方法来制备。

药学研究表明：本发明制备得到的式Ⅰ或式Ⅱ所示化合物对C8166细胞的毒性小，对HIV-1诱导C8166细胞形成合胞体抑制的EC₅₀值分别为11.31μg/mL、15.08μg/mL，治疗指数(TI值)分别为99.91、67.63，表明本发明制备得到的式Ⅰ或式Ⅱ所示化合物具有显著的抗HIV-1活性，可用作潜在的治疗艾滋病药物。

附图说明

图1为式Ⅲ所示的双糖受体化合物的合成流程图。

图2为式Ⅴ所示的四糖受体化合物的合成流程图。

图3为式Ⅰ所示的目标五糖化合物的合成流程图。

图4为式Ⅱ所示的目标六糖化合物的合成流程图。

图5为式Ⅵ所示的五糖化合物的合成共振氢谱图。

图6为式Ⅵ所示的五糖化合物的合成共振碳谱图。

图7为式Ⅰ所示的目标五糖的合成共振氢谱图。

图8为式Ⅰ所示的目标五糖的合成共振碳谱图。

图9为式Ⅶ所示的五糖化合物的合成共振氢谱图。

图10为式Ⅶ所示的五糖化合物的合成共振碳谱图。

图11为式Ⅱ所示的目标六糖的合成共振氢谱图。

图12为式Ⅱ所示的目标六糖的合成共振碳谱图。

图13式Ⅰ所示化合物对C8166细胞的毒性作用实验数据。

图14式Ⅱ所示化合物对C8166细胞的毒性作用实验数据。

图15AZT对C8166细胞的毒性作用实验数据。

图16式Ⅰ所示化合物对HIV-1ⅢB诱导C8166细胞病变(CPE)的抑制作用。

图17式Ⅱ所示化合物对HIV-1ⅢB诱导C8166细胞病变(CPE)的抑制作用。

图18AZT化合物对HIV-1ⅢB诱导C8166细胞病变(CPE)的抑制作用。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所使用的对甲氧基苯基甘露糖苷(化合物1)是按照包括下述步骤的方法制备得到的：100ml圆底瓶中加入乙酸酐40ml，高氯酸0.2ml，冰盐浴下慢慢加入甘露糖10g，加入完毕后移至室温下反应2小时，检测反应完全后向体系中加入1ml吡啶终止反应，直接浓缩，除去溶剂后在氮气保护下加入对甲氧基苯酚10g，适量二氯甲烷溶解，冰盐浴下加入三氟化硼乙醚络合物，半小时后移至室温下反应10小时，TLC检测反应完全，向体系中加入氢氧化钠溶液调体系pH至中性，然后用二氯甲烷、水洗涤，有机相干燥浓缩。所得粗产物溶于适量甲醇，滴加新制甲醇钠溶液调pH至10左右，室温反应2小时，TLC检测反应完全。酸性树脂中和后抽滤，滤液浓缩，乙酸乙酯重结晶，析出白色固体8.6g。

下述实施例中所使用的式Ⅳ所示化合物是按照包括下述步骤的方法制备得到的：

100ml三口瓶中,将D-甘露糖(1.8g,10mol)悬浮在25mL干燥的甲苯中,搅拌下加入Py(4.8mL,0.06mol),15分钟内滴加BzCl(6.4mL,0.055mol)的20mL甲苯溶液.滴加完毕加热至回流,TLC(3:1石油醚-乙酸乙酯)检测反应完全.冷却到0℃,过滤除去吡啶盐酸盐,向滤液向体系中加入100mL饱和甲醇氨溶液,室温下搅拌反应,及时监测至反应结束.过滤除去不溶物,低温浓缩除去溶剂,真空干燥2小时,氮气保护下加50mL无水CH₂Cl₂,CCl₃CN 1.5mL(0.015mol)、K₂CO₃ 6.9g(0.05mmol),室温反应过夜,TLC(3:1石油醚-乙酸乙酯)检测反应完全.抽滤除去不溶物后浓缩,柱层析纯化得到式Ⅳ所示化合物(6.2g,收率84％)。

¹H NMR(300MHz,CDCl₃):δ8.87(s,1H,NH),8.11-7.83(m,8H,OBz),7.61-7.29(m,12H,OBz),6.58(d,J_1,2＝1.6Hz,1H,H-1),6.25(t,J_3,4＝J_4,5＝10.0Hz,1H,H-4),6.00-5.94(m,2H,H-2,H-3),4.76(m,1H,H-6a),4.67(m,1H,H-5),4.53(m,H,H-6b).

实施例1、式Ⅲ所示的双糖受体化合物的合成

根据图1所示的合成流程图合成式Ⅲ所示的双糖受体化合物

1)化合物2的合成

将化合物1(28.6g，0.1mol)溶解在300mL无水DMF中，搅拌下加入一水合对甲苯磺酸(0.38g，2mmol)和2-甲氧基丙烯(10.5mL，0.11mol)。室温下2小时后，反应完全，反应体系用乙酸乙酯和水萃取，有机相干燥，浓缩后柱层析分离，得到白色粉末状化合物2(24.1g，74％)。

结构确证数据如下：¹H NMR(300MHz,CDCl₃):δ6.99-6.94(m,2H,MpH),6.85-6.80(m,2H,MpH),5.46(d,1H,J_1,2＝1.4Hz,H-1),4.22(m,1H,H-2),4.12(dd,1H,J_2,3＝3.3Hz,J_3,4＝9.4Hz,H-3),4.04-3.98(m,1H),3.82-3.78(m,3H),3.77(s,3H,OMe),2.87,2.81(bs,2H,OH),1.53,1.42(2s,6H,Me₂C).

2)化合物3的合成

将化合物2(9.8g,30.0mmol)溶解在200mL干燥的CH₂Cl₂中，加入Py(12mL,150.0mmol)，冰浴冷却至–10℃，30分钟内滴加AllocCl(3.55mL,33mmol)的40mLCH₂Cl₂溶液，滴加完毕撤去冰浴，室温搅拌2h，TLC(3:1石油醚-乙酸乙酯)检测反应完全。直接向体系中加入40mL干燥吡啶,冰浴下滴加BzCl(5.2mL,45mmol),滴加完毕后冰浴下搅拌30分钟,然后将体系移置室温下反应2小时,TLC(3:1石油醚-乙酸乙酯)检测反应完全。将反应体系依次用1M盐酸、饱和NaHCO₃溶液、饱和食盐水洗涤,CH₂Cl₂萃取、无水Na₂SO₄干燥、浓缩柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝4/1)分离得浅黄色粘稠状液体化合物3(14.2g,92％)。

结构确证数据如下：¹H NMR(300MHz,CDCl₃):6.99-6.95(m,2H,HMp),6.83-6.80(m,2H,HMp),6.01-5.91(m,1H,CH₂CHCH₂O),5.45(d,J_1,2＝1.6Hz,1H,H-1),5.43-5.28(m,2H,CH₂CHCH₂O),5.22(dd,J_2,3＝1.8Hz,J_3,4＝10.0Hz,1H,H-3),4.68(dt,2H,CH₂CHCH₂O),4.38(m,1H,H-2),4.24(t,J_3,4＝J_4,5＝9.6Hz,1H,H-4),3.91-3.78(m,3H,H-5,2×H-6),3.76(s,3H,OCH₃),2.56(d,J＝3.3Hz,OH),1.50,1.39(2s,6H,CMe₂).

3)化合物4的合成

将化合物3(10.3g，20mmol)溶解在含70％的乙酸水溶液(300mL)中，于75摄氏度下搅拌反应。2小时后反应完全，反应液冷却后减压浓缩，用甲苯(3×80mL)共沸旋蒸，浓缩物柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝4/1)得到浅黄色粘稠状化合物4(8.3g，88％)。

结构确证数据如下：¹H NMR(300MHz,CDCl3):δ8.06-8.00(m,2H,OBz),7.55-7.38(m,3H,OBz),7.01(d,J＝9.0Hz,2H,HMp),6.79(d,J＝9.0Hz,2H,HMp),5.95-5.82(m,1H,CH₂CHCH₂O),5.72(m,1H,H-2),5.53(d,J_1,2＝1.4Hz,1H,H-1),5.38-5.20(m,3H,H-3,CH₂CHCH₂O),4.64-4.58(m,2H,CH₂CHCH₂O),4.35(t,J_3,4＝J_4,5＝9.7Hz,1H,H-4,1H),3.98～3.82(m,3H,H-5,2×H-6),3.74(s,3H,OCH₃),3.7-2.2(bs,2H,OH).

4)化合物5的合成

将化合物4(7.1g,15.0mmol)溶解在200mL干燥的CH₂Cl₂中，加入Py(6mL,75.0mmol)，冰浴冷却至–10℃，30分钟内滴加AllocCl(1.7mL,16.5mmol)的30mLCH₂Cl₂溶液，滴加完毕撤去冰浴，室温搅拌2h，TLC(3:1石油醚-乙酸乙酯)检测反应完全。直接向体系中加入20mL干燥吡啶,冰浴下滴加BzCl(2.6mL,22mmol),滴加完毕后冰浴下搅拌30分钟,然后将体系移置室温下反应2小时,TLC(3:1石油醚-乙酸乙酯)检测反应完全。将反应体系依次用1M盐酸、饱和NaHCO₃溶液、饱和食盐水洗涤,CH₂Cl₂萃取、无水Na₂SO₄干燥、浓缩柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝5/1)分离得浅黄色粘稠状液体化合物5(8.7g,88％)。

结构确证数据如下：¹H NMR(300MHz,CDCl3):δ8.15-8.03(m,4H,OBz),7.59-7.41(m,6H,OBz),7.11(d,J＝9.0Hz,2H,HMp),6.85(d,J＝9.0Hz,2H,HMp),5.91-5.63(m,6H),5.33-5.02(m,4H),4.57～4.33(m,7H),3.75(s,3H,OCH₃).

5)化合物6的合成

于250mL圆底烧瓶中，将化合物5(6.6g,10mmol)溶于200mL甲醇-四氢呋喃(v/v,1/1)溶液中,向体系中加入CH₃COONH₄(23.1g,300mmol),冰浴冷却至–10℃,向体系中快速加入Pd[PPh₃]₄(0.46g,0.4mmol)、NaBH₄(0.76g,20mmol).TLC(2:1石油醚-乙酸乙酯)检测至反应完全.将反应液减压浓缩,除去甲醇、四氢呋喃.将反应体系用CH₂Cl₂稀释,饱和食盐水萃取、无水Na₂SO₄干燥、浓缩柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝4/1)分离得浅黄色粘稠状液体化合物6(4.0g,82％)。

结构确证数据如下：¹H NMR(300MHz,CDCl₃):δ8.13-8.06(m,4H,OBz),7.63-7.59(m,2H,OBz),7.51-7.44(m,4H,OBz),7.06-7.02(m,2H,HMp),6.86-6.83(m,2H,HMp),5.67(d,J_1,2＝1.7Hz,1H,H1),5.64-5.57(m,2H,H-2,H-4),4.66(d,J＝9Hz,1H,H-3),4.13-4.08(m,1H,H-5),3.81-3.74(m,5H,OCH₃,2×H-6),2.58,2.38(2br,2H,2×OH).

6)化合物7的合成

将化合物5(4.0g，6mmol)溶解于100mL 80％的乙腈水溶液中，30摄氏度下加入硝酸铈铵(CAN)(16.4g，30mmol)，维持该温度40分钟后反应完全。将反应液在低于50摄氏度下减压浓缩，二氯甲烷溶解浓缩物，水洗，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩后柱层析分离，得到1位为羟基的化合物。将此化合物溶解在100mL干燥二氯甲烷中，氮气保护下加入三氯乙腈(9mL，9mmol)和DBU(0.01mL，0.001当量)，于室温搅拌下反应，2小时后反应完全。将反应液减压浓缩，浓缩物柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝4/1)得到粘稠状液体7(3.2g,77％)。

结构确证数据如下：¹H NMR(300MHz,CDCl₃):δ8.88(s,1H,NH),8.14(d,J＝7.3Hz,2H,OBz),8.02(d,J＝7.3Hz,2H,OBz),7.63-7.56(m,2H,OBz),7.50-7.42(m,4H,OBz),6.51(d,J_1,2＝1.8Hz,1H,H-1),5.90-5.84(m,3H,H-2,H-4,CH₂CHCH₂O),5.71-5.58(m,2H,H-3,CH₂CHCH₂O),5.35-5.03(m,4H,2×CH₂CHCH₂O),4.60,4.51(2d,J＝5.6Hz,4H,2×CH₂CHCH₂O),4.51-4.34(m,3H,H-5,2×H-6).

7)化合物8的合成

将化合物6(2.1g，4.2mmol)、化合物7(3.1g，4.4mmol)和干燥分子筛(3g)溶解于100mL二氯甲烷中，冰盐浴冷却至-10摄氏度，氮气保护下搅拌0.5小时，加入三甲硅基三氟甲磺酸酯54μL(0.3mmol)，保持-10摄氏度反应0.5小时，撤去冰盐浴使反应体系自然升温到室温，2小时后加入100μL三乙胺终止反应。抽滤反应液，滤液减压下浓缩，柱层析分离(石油醚：甲苯：乙酸乙酯＝6/4/1)得到白色泡沫状固体双糖化合物8(3.1g,70％)。

结构确证数据如下：¹H NMR(300MHz,CDCl₃):δ8.20-8.05(m,8H,OBz),7.60-7.31(m,12H,OBz),7.13(d,J＝9.1Hz,2H,HMp),6.88(d,J＝9.1Hz,2H,HMp),5.79-5.59(m,8H),5.30-5.18(m,3H),5.08-5.04(m,2H),4.52-4.48(m,7H),4.07-3.99(m,4H),3.71(s,3H,OCH₃),2.58(d,J＝8.7Hz,1H,OH).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃):δ166.71,166.03,165.30,155.48,154.54,153.81,150.08,13361,133.49,133.43,131.49,131.14,130.00,129.88,129.18,129.12,129.03,129.01,128.73,128.48,128.44,118.63,118.06,114.81,97.37,97.00,72.88,72.75,69.91,69.63,69.52,69.01,68.64,68.44,66.76,66.52,65.63,55.47.

8)式Ⅲ所示化合物的合成

于250mL圆底烧瓶中,将化合物8(2.0g,2mmol)溶于100mL甲醇-四氢呋喃(v/v,1/1)溶液中,向体系中加入CH₃COONH₄(4.5g,60mmol),冰浴冷却至–10℃,向体系中快速加入Pd[PPh₃]₄(92mg,0.08mmol)、NaBH₄(0.15g,4mmol).TLC(2:1石油醚-乙酸乙酯)检测至反应完全.将反应液减压浓缩,除去甲醇、四氢呋喃.将反应体系用CH₂Cl₂稀释,饱和食盐水萃取、无水Na₂SO₄干燥、浓缩柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝5/1)分离得到白色泡沫状式Ⅲ所示化合物(4.0g,82％)。

结构确证数据如下：¹H NMR(300MHz,CDCl₃):δ8.15-8.03(m,8H,OBz),7.63-7.35(m,12H,OBz),7.11(d,J＝9.0Hz,2H,HMp),6.87(d,J＝9.0Hz,2H,HMp),5.78-5.62(m,3H,H-4,2×H-2),5.49-5.40(m,2H,H-4,H-1),5.04(s,1H,H-1),4.61(dd,J_2,3＝3.2Hz,J_3,4＝9.8Hz,1H,H-3),4.46(dd,J_2,3＝3.2Hz,J_3,4＝9.7Hz,1H,H-3),4.34(m,1H,H-5),3.97(m,1H,H-5),3.79-3.64(m,5H,OCH₃,2×H-6),3.45-3.42(m,2H,2×H-6),2.62(brs,3H,3×OH).¹³CNMR(75MHz,CDCl3):δ167.25,166.79,165.91,165.84,155.38,149.88,133.72,133.67,133.48,129.94,129.85,129.80,129.21,129.17,129.07,129.00,128.67,128.55,128.51,117.87,114.69,97.47,96.59,72.68,70.57,70.09,69.94,69.67,68.98,68.52,66.19,60.95,55.53.

实施例2、式Ⅴ所示的四糖受体化合物的合成

根据图2所示的合成流程图合成式Ⅴ所示的双糖受体化合物

1)化合物9的合成

将化合物1(28.6g，0.1mol)溶解在300mL无水DMF中，搅拌下加入一水合对甲苯磺酸(0.38g，2mmol)和2-甲氧基丙烯(10.5mL，0.11mol)。室温下2小时后，90摄氏度下在反应3小时，反应完全，反应体系用乙酸乙酯和水萃取，有机相干燥，浓缩后柱层析分离，得到白色粉末状化合物9(24.1g，74％)。[α]_D ²⁵+69.7°(c 1.0 CHCl3).

结构确证数据如下：¹H NMR(300MHz,CDCl3):δ7.00–6.95(m,2H,Ar-H),6.82–6.86(m,2H,Ar-H),5.67(s,1H,H-1),4.38(d,J_2,3＝5.7Hz,1H,H-2),4.32(m,1H,H-3),3.84–3.78(m,7H,H-4,H-5,H-6,OCH₃),2.82(d,J＝3.9Hz,1H,4-OH),2.04(m,1H,6-OH),1.56,1.41(2s,6H,Me₂C).

2)化合物10的合成

于250mL圆底烧瓶中,将化合物9(6.5g,20mmol)溶于50mL吡啶中，冰浴冷却至–10℃,向体系中滴加苯甲酰氯(6.9mL，60mmol)的吡啶(10mL)混合液，滴加完毕后继续在此温度下反应1小时，TLC(3:1石油醚-乙酸乙酯)检测至反应完全。将反应体系用CH₂Cl₂稀释,1MHCl洗涤、无水Na₂SO₄干燥、浓缩。将浓缩后所得产物直接溶解在含70％的乙酸水溶液(200mL)中，于75摄氏度下搅拌反应。2小时后反应完全，反应液冷却后减压浓缩，用甲苯(3×80mL)共沸旋蒸，浓缩物柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝4/1)得到白色粉末状固体化合物10(8.0g，82％)。

结构确证数据如下：¹H NMR(300MHz,CDCl3):δ8.04～8.01(m,2H,OBz),7.88～7.85(m,2H,OBz),7.57～7.50(m,2H,OBz),7.48～7.32(m,2H,OBz),7.05～7.02(m,2H,HMp),6.73～6.70(m,2H,HMp),5.55(d,J＝1.4Hz,1H,H-1),5.46(t,J_3,4＝J_4,5＝9.6Hz,1H,H-4),4.51～4.30(m,4H),4.22(m,1H),3.71(s,3H,OMe),3.59(brs,2H,2×OH).

3)化合物11的合成

将化合物10(4.9g,10mmol)溶解在200mL干燥的CH₂Cl₂中，加入Py(4mL,50mmol)，冰浴冷却至–10℃，30分钟内滴加AcCl(0.75mL,11mmol)的30mLCH₂Cl₂溶液，滴加完毕撤去冰浴，室温搅拌2h，TLC(3:1石油醚-乙酸乙酯)检测反应完全。将反应体系依次用1M盐酸、饱和NaHCO₃溶液、饱和食盐水洗涤,CH₂Cl₂萃取、无水Na₂SO₄干燥、浓缩柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝5/1)分离得白色粉末状化合物11(4.5g,84％)。

结构确证数据如下：¹H NMR(300MHz,CDCl3):δ8.01～7.99(m,2H,OBz),7.91～7.88(m,2H,OBz),7.59～7.33(m,6H,OBz),7.09～7.06(m,2H,HMp),6.78～6.74(m,2H,HMp),5.75(m,2H),5.55(d,J_1,2＝1.8Hz,1H,H-1),4.50～4.38(m,3H),4.34(s,1H),3.73(s,3H,OCH₃),2.46(s,1H,OH),2.02(s,3H,CH₃CO)。

4)化合物12的合成

将化合物11(1.8g，3.4mmol)、式Ⅳ所示化合物(2.7g，3.7mmol)和干燥分子筛(1.5g)溶解于60mL二氯甲烷中，冰盐浴冷却至-10摄氏度，氮气保护下搅拌0.5小时，加入三甲基硅烷基三氟甲磺酸酯44μL(0.24mmol)，保持-10摄氏度反应0.5小时，撤去冰盐浴使反应体系自然升温到室温，2小时后加入80μL三乙胺终止反应。抽滤反应液，滤液减压下浓缩，柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝4/1)得到白色泡沫状固体双糖化合物12(3.2g,87％)。

结构确证数据如下：¹H NMR(300MHz,CDCl3):δ8.05～7.88(m,12H,OBz),7.74～7.29(m,18H,OBz),7.09～7.06(m,2H,HMp),6.73～6.70(m,2H,HMp),6.15(t，J_3,4＝J_4,5＝9.6Hz,1H,H-4’),6.05(dd,J_2,3＝3.2Hz,J_3,4＝10.1Hz,1H,H-3’),5.85～5.83(m,3H),5.72(d,J_1,2＝1.8Hz,1H,H-1),5.36(d,J_1,2＝1.7Hz,1H,H-1),4.66～4.42(m,7H),3.72(s,3H,OCH₃),2.11(s,3H,CH₃CO).¹³C NMR(75MHz,CDCl3):δ170.49,166.09,166.05,165.54,165.22,165.19,165.07,155.23,149.36,133.50,133.44,133.13,132.94,132.90,129.87,129.77,129.69,129.62,129.55,129.47,129.13,129.04,128.94,128.72,128.57,128.46,128.39,128.27,117.67,114.60,99.48,97.22,70.44,7.09,69.70,69.46,69.32,67.53,66.86,63.47,62.92,55.48,20.69.

5)化合物13的合成

将化合物12(2.3g，2mmol)溶解于60mL 80％的乙腈水溶液中，30摄氏度下加入硝酸铈铵(CAN)(5.6g，10mmol)，维持该温度40分钟后反应完全。将反应液在低于50摄氏度下减压浓缩，二氯甲烷溶解浓缩物，水洗，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩后柱层析分离，得到1位为羟基的化合物。将此化合物溶解在50mL干燥二氯甲烷中，氮气保护下加入三氯乙腈(3mL，3mmol)和DBU(0.01mL)，于室温搅拌下反应，2小时后反应完全。将反应液减压浓缩，浓缩物柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝4/1)得到粘稠状液体化合物13(1.7g,71％)。

结构确证数据如下：¹H NMR(300MHz,CDCl3):δ8.69(s,1H,NH),8.10～7.89(m,12H,OBz),7.59～7.30(m,18H,OBz),6.58(d,J_1,2＝1.7Hz,1H,H-1),6.21(t,J_3,4＝J_4,5＝10.0Hz,1H,H-4’),6.03～5.92(m,2H),5.85(m,1H,H-2’),5.71(dd,J_2,3＝3.2Hz,J_3,4＝9.7Hz,1H,H-3’),5.38(d,J_1,2＝1.2Hz,1H,H-1),4.75～4.47(m,7H),2.09(s,3H,CH₃CO).

6)化合物14的合成

将化合物8(0.8g，0.77mmol)、化合物13(1g，0.85mmol)和干燥分子筛(1g)溶解于40mL二氯甲烷中，冰盐浴冷却至-10摄氏度，氮气保护下搅拌0.5小时，加入三甲基硅烷基三氟甲磺酸酯10μL(0.055mmol)，保持-10摄氏度反应0.5小时，撤去冰盐浴使反应体系自然升温到室温，2小时后加入40μL三乙胺终止反应。抽滤反应液，滤液减压下浓缩，柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝6/1)得到白色泡沫状固体双糖化合物14(0.94g,60％)。

结构确证数据如下：¹H NMR(300MHz,CDCl₃):8.14-8.11(m,2H,OBz),8.05-7.82(m,22H,OBz),7.46-7.34(m,26H,OBz),7.08(m,2H,HMp),6.92(m,2H,HMp),5.96(t,J_3,4＝J_4,5＝9.2Hz,H-4),5.90-5.68(m,8H),5.64-5.55(m,4H,2×H-1,H-2,H-3),5.46(m,2H,H-1,H-2),5.28-5.15(m,3H),5.07-5.00(m,2H),4.76(dd,J_2,3＝3.2Hz,J_3,4＝9.5Hz,1H,H-3),4.55-4.42(m,8H),4.40-4.28(m,4H),4.15-4.12(m,3H),3.93(m,2H),3.69(s,3H,OCH₃),3.62(m,1H),1.96(s,3H,CH₃CO).¹³C NMR(75MHz,CDCl3):δ169.53,166.22,166.05,165.89,165.49,165.23,165.20,165.08,164.94,164.82,164.74,155.66,154.48,153.63,149.92,133.41,133.31,133.27,133.09,133.01,132.94,132.81,132.73,132.68,131.39,131.08,130.11,129.89,129.79,129.74,129.68,129.60,129.41,129.20,129.06,128.92,128.74,128.47,128.42,128.37,128.34,128.29,128.23,128.13,128.07,118.74,118.50,114.83,114.71,100.18,99.51,97.61,97.35,78.34,75.18,72.83,71.78,70.07,69.70,69.50,69.42,69.13,68.69,68.53,68.32,67.24,66.72,66.61,66.13,65.66,63.57,62.80,55.33,29.53,20.49.

7)式Ⅴ所示化合物的合成

于250mL圆底烧瓶中,将化合物14(0.8g,0.4mmol)溶于100mL甲醇-四氢呋喃(v/v,1/1)溶液中,向体系中加入CH₃COONH₄(0.92g,12mmol),冰浴冷却至–10℃,向体系中快速加入Pd[PPh₃]₄(19mg,0.016mmol)、NaBH₄(0.03g,0.8mmol).TLC(2:1石油醚-乙酸乙酯)检测至反应完全.将反应液减压浓缩,除去甲醇、四氢呋喃.将反应体系用CH₂Cl₂稀释,饱和食盐水萃取、无水Na₂SO₄干燥、浓缩柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝5/1)分离得到白色泡沫状式Ⅴ所示化合物(0.48g,66％)。

结构确证数据如下：¹H NMR(300MHz,CDCl₃):δ8.12(m,2H,OBz),8.09-7.84(m,19H,OBz),7.60-7.33(m,29H,OBz),7.06(m,2H,HMp),6.83(m,2H,HMp),5.96(t,J_3,4＝J_4,5＝10.2Hz,H-4),5.90-5.82(m,3H,2×H-1,H-4),5.76-5.69(m,2H,H-1,H-4),5.59(m,H,H-2),5.49-5.39(m,4H,H-1,H-2,2×H-3),5.02(s,1H,H-1),4.76(dd,J_2,3＝3.3Hz,J_3,4＝9.5Hz,1H,H-3),4.59-4.38(m,6H),4.36-4.25(m,3H),3.94-3.79(m,3H),3.70(s,3H,OCH₃),3.62-3.52(m,3H),2.47(d,J＝7.2Hz,1H,OH),2.29(m,1H,OH),1.96(s,3H,CH₃CO).¹³C NMR(75MHz,CDCl3):δ169.71,167.34,166.32,166.01,165.99,165.87,165.57,165.38,165.02,164.92,164.87,155.60,149.74,133.75,133.63,133.53,133.49,133.38,133.23,133.10,133.06,132.79,130.10,129.98,129.91,129.88,129.79,129.72,129.69,129.64,129.29,129.27,129.22,129.14,129.11,128.84,128.64,128.58,128.54,128.51,128.39,128.36,128.25,128.13,118.44,114.84,114.66,100.19,99.61,97.60,97.10,78.33,75.28,72.73,71.76,70.64,70.17,69.91,69.61,69.53,69.27,68.77,68.42,67.31,66.62,66.36,63.66,62.80,61.11,55.55,20.64.

实施例3、式Ⅰ所示化合物的合成

根据图3所示的合成流程图合成式Ⅰ所示的化合物

1)式Ⅵ所示化合物的合成

将式Ⅲ化合物(0.4g，0.46mmol)、式Ⅳ所示化合物(1.3g，1.8mmol)和干燥分子筛(0.5g)溶解于30mL二氯甲烷中，冰盐浴冷却至-10摄氏度，氮气保护下搅拌0.5小时，加入三甲基硅烷基三氟甲磺酸酯10μL，保持-10摄氏度反应0.5小时，撤去冰盐浴使反应体系自然升温到室温，2小时后加入30μL三乙胺终止反应。抽滤反应液，滤液减压下浓缩，柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝6/1)得到白色泡沫状式Ⅵ所示化合物(0.53g,44％)。

结构确证数据如下：

图5为式Ⅵ所示的五糖化合物的合成共振氢谱图

¹H NMR(300MHz,CDCl₃):δ8.23-7.30(m,80H,OBz),7.08(d,J＝9.1Hz,HMp),6.78(d,J＝9.1Hz,HMp),6.16(t,J_3,4＝J_4,5＝10.0Hz,1H,H-4),6.11-6.04(m,2H),6.02-5.95(m,2H),5.93-5.88(m,2H),5.58(m,1H,H-2),5.48(m,1H,H-2),5.41(d,J_1,2＝1.4Hz,1H,H-1),5.36(m,2H,H-1,H-2),5.17(s,1H,H-1),4.87(dd,J_2,3＝3.3Hz,J_3,4＝9.7Hz,1H,H-3),4.78(d,J_1,2＝1.2Hz,1H,H-1),4.67-4.61(m,2H),4.57-4.52(m,3H),4.50-4.32(m,4H),4.29-4.21(m,4H),4.01(m,1H),3.81(m,1H),3.47(s,3H,OCH₃),3.44(m,1H).

图6为式Ⅵ所示的五糖化合物的合成共振碳谱图

¹³C NMR(75MHz,CDCl₃):δ166.14,166.11,166.09,166.01,165.90,165.69,165.54,165.47,165.15,165.13,165.06,164.98,164.64,164.63,164.57,16.52(16×COPh),155.52,149.84,133.17,130.18,130.03,129.98,129.86,129.84,129.75,129.72,129.70,129.68,129.1,129.59,129.57,129.44,129.19,129.07,128.99,128.94,128.64,128.55,128.47,128.41,128.35,128.33,128.21,128.08,118.39,114.65,99.92,99.67,97.52,97.33,97.09(5×C-1),72.03,71.95,70.17,70.09,69.7,69.63,69.54,69.34,69.21,68.78,68.14,66.55,66.43,66.39,62.65,62.55,62.50,55.31.

2)式Ⅰ所示化合物的合成

将式Ⅵ所示化合物(440mg，0.17mmol)溶解在饱和的NH₃-CH₃OH(40mL)中，于室温下搅拌反应，1周后反应完全，Sephadex LH-20(CH₃OH)柱纯化得到白色泡沫状固体目标五糖Ⅰ(129mg，81％)。

结构确证数据如下：

图7为式Ⅰ所示的目标五糖的合成共振氢谱图

¹H NMR(300MHz,MeOD-D₂O):δ7.08(d,J＝9.1Hz,2H,HMp),6.92(d,J＝9.1Hz,2H,HMp),5.32(d,J＝1.6Hz,1H,H-1),5.17(d,J＝1.6Hz,1H,H-1),5.08(d,J＝1.3Hz,1H,H-1),4.89(d,J＝1.3Hz,1H,H-1),4.76(d,J＝1.5Hz,1H,H-1),4.27(m,1H),4.06～4.02(m,4H),3.91～3.66(m,28H).

图8为式Ⅰ所示的目标五糖的合成共振碳谱图

¹³C NMR(75MHz,CDCl₃):δ155.06,150.40,117.77,114.27,102.40,102.27,99.70,99.55,99.44,79.37,78.79,73.43,73.23,72.79,72.31,71.18,70.93,70.89,70.56,70.52,70.45,69.88,69.70,67.23,67.04,66.03,65.93,65.80,65.64,61.21,61.13,54.78.

实施例4、式Ⅱ所示化合物的合成

根据图4所示的合成流程图合成式Ⅱ所示的化合物

1)式Ⅶ所示化合物的合成

将式Ⅴ化合物(0.3g，0.16mmol)、式Ⅳ所示化合物(0.36g，0.48mmol)和干燥分子筛(0.3g)溶解于30mL二氯甲烷中，冰盐浴冷却至-10摄氏度，氮气保护下搅拌0.5小时，加入三甲基硅烷基三氟甲磺酸酯10μL，保持-10摄氏度反应0.5小时，撤去冰盐浴使反应体系自然升温到室温，2小时后加入30μL三乙胺终止反应。抽滤反应液，滤液减压下浓缩，柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝6/1)得到白色泡沫状式Ⅶ所示化合物(0.28g,58％)。

结构确证数据如下：

图9为式Ⅶ所示的五糖化合物的合成共振氢谱图

¹H NMR(300MHz,CDCl₃):δ8.07-7.22(m,90H,OBz),7.08(d,J＝9.1Hz,2H,HMp),6.83(d,J＝9.1Hz,2H,HMp),6.11-5.89(m,7H),5.85-5.70(m,5H,H-1,2×H-2,2×H-3),5.60-5.58(m,2H,2×H-2),5.47-5.43(m,3H,H-1,H-2,H-3),5.34(d,J_1,2＝1.4Hz,1H,H-1),5.16(d,J_1,2＝1.6Hz,1H,H-1),4.86(dd,J_2,3＝3.4Hz,J_3,4＝9.7Hz,1H,H-3),4.80(d,J_1,2＝1.4Hz,1H,H-1),4.63-4.43(m,9H),4.37-4.28(m,3H),4.24-4.15(m,5H),3.97-3.93(m,2H),3.77(m,1H),3.47(s,3H,OCH₃),3.39(m,1H),1.91(s,3H,COCH₃).

图10为式Ⅶ所示的五糖化合物的合成共振碳谱图。

¹³C NMR(75MHz,CDCl₃):δ166.34,166.12,66.08,165.98,165.88,16587,165.62,165.53,165.46,165.36,165.12,165.07,164.98,164.94,164.82,164.67,164.54,133.62,133.47,133.37,133.31,33.25,133.20,133.09,133.03,133.00,132.91,132.75,130.14,129.96,129.88,129.84,129.81,129.74,129.67,129.65,129.55,129.45,129.40,129.33,129.3,2927,129.23,129.15,129.10,129.06,129.01,129.00,128.91,128.79,128.64,128.57,128.53,128.52,128.49,128.42,128.38,128.34,128.29,128.18,128.06,118.78,114.62,100.12,99.78,99.51,97.56,97.46,97.36,75.22,71.89,71.83,70.1,70.09,69.80,69.69,69.56,69.28,69.14,68.73,68.58,68.02,67.30,66.55,66.40,66.32,65.92,63.65,62.69,62.39,55.27,20.55.

2)式Ⅱ所示化合物的合成

将式Ⅶ所示化合物(240mg，0.08mmol)溶解在饱和的NH₃-CH₃OH(40mL)中，于室温下搅拌反应，1周后反应完全，Sephadex LH-20(CH₃OH)柱纯化得到白色泡沫状固体目标六糖Ⅱ(77mg，88％)。

结构确证数据如下：

图11为式Ⅱ所示的目标六糖的合成共振氢谱图

¹H NMR(300MHz,D₂O):δ7.01(d,J＝7.0Hz,2H,HMp),6.87(d,J＝7.0Hz,2H,HMp),5.39(d,J＝1.6Hz,1H,H-1),5.33(d,J＝1.5Hz,1H,H-1),4.97(m,2H,2×H-1),4.78(d,J＝1.5Hz,1H,H-1),4.63(d,J＝1.4Hz,1H,H-1),4.20(m,1H),4.0-3.55(m,38H)；

图12为式Ⅱ所示的目标六糖的合成共振碳谱图

¹³C NMR(75MHz,D₂O):δ15.51,149.29,118.33,115.07,102.24,102.19,100.76,99.6,98.96,98.62,7847,78.43,73.35,73.21,73.19,72.63,71.45,70.70,70.54,70.37,70.31,70.06,69.93,69.43,66.92,66.71,66.68,65.88,65.68,65.37,65.22,60.98,60.92,55.77,48.85.

实施例5、抗HIV活性的测定，测定方法如下：

本发明中，式Ⅰ及式Ⅱ所示化合物体外抗HIV-1活性的检测采用如下的材料和方法：

1、测定药物和化合物

待测样品为式Ⅰ及式Ⅱ所示化合物。阳性对照药物为叠氮胸苷(AZT，购自Sigma公司)。待测样品溶解于水中，分装后4摄氏度保存；AZT溶解于RPMI-1640完全培养基中，0.22μm滤膜过滤除菌，分装后-20摄氏度保存。

2、试剂和溶液培养基

(1)试剂：HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)、MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)、DMF(N,N-二甲基甲酰胺)、青霉素、硫酸链霉素、谷氨酰胺均购自Sigma公司；2-巯基乙醇为Bio-Rad公司产品。RPMI-1640和新生小牛血清为Gibco公司产品。

(2)培养基：RPMI-1640完全培养基，含有10％新生小牛血清，2mM L-谷氨酰胺，10mM HEPES，50μM 2-巯基乙醇，100000IU青霉素，100μg/mL链霉素。

3、细胞和病毒

人T淋巴细胞C8166、HIV-1试验株HIV-1_ⅢB均由英国Medical Research Council，AIDS Reagent Project惠赠。所有细胞和病毒均含有10％小牛血清的RPMI-1640完全培养基进行培养。按常规方法制备HIV-1_ⅢB，滴定并计算出病毒的TCID₅₀。病毒贮存液分装后，置-70摄氏度保存。细胞和病毒按常规方法冻存和复苏。

4、HIV-1感染性滴定

HIV-1_ⅢB按Johnson&Byington(1990)所述方法改良进行滴定，简述如下：将HIV-1贮存液在96孔板上作4倍稀释，10个梯度，每梯度6个重复孔，同时设置对照孔6孔。每孔加入C8166细胞50μL(4×10⁵/mL)，每孔终体积为200μL。37摄氏度，二氧化碳培养。第三天补加新鲜RPMI-1640完全培养基100μL，第七天在倒置显微镜下观察每孔中HIV-1诱导的细胞病变效应(Cytopathic Effect，CPE)，以每孔是否有合胞体(Syncytium)的形成确定。按Reed&Muench方法计算病毒的TCID₅₀(50％Tissue Culture Infection Dose,半数组织培养感染剂量)。

5、计算公式

根据实验结果绘制剂量反应曲线，按Reed&Muench法计算出药物抑制病毒的50％有效浓度(EC₅₀)、50％抑制细胞生长浓度(CC₅₀)及抗HIV-1活性指数(Therapeutic index,TI),TI＝CC₅₀/EC₅₀。

(1)、细胞生长抑制率(％)＝(1-试验孔OD值/对照孔OD值)×100

(2)、HIV-1致细胞病变的抑制率(％)＝(1-实验孔合胞体数/对照孔合胞体数)×100

(3)、细胞生长存活率(％)＝(试验孔OD值/对照孔OD值)×100

式Ⅰ及式Ⅱ所示化合物对C8166细胞的毒性实验

将4×10⁵/mL C8166细胞悬液100μL与不同浓度的待测药物混合，设3个重复孔。同时设置不含药物的对照孔。37摄氏度，5％二氧化碳培养3天，采用MTT比色法检测细胞毒性。Elx800酶标仪测定OD值，测定波长为595nm，参考波长为630nm。计算得到CC₅₀值(50％Cytotoxic concentration)，即对50％的正常T淋巴细胞系C8166产生毒性时的药物浓度。实验结果如表1、图13～15所示。

表1式Ⅰ及式Ⅱ所示化合物对C8166细胞的毒性作用实验数据

式Ⅰ及式Ⅱ所示化合物对C8166细胞的毒性作用小，当药物浓度为2000μg/mL时，细胞存活率分别为45.58％、42.21％，CC₅₀值分别为1130μg/mL、1020μg/mL,与AZT对C8166细胞的毒性作用相当。

式Ⅰ及式Ⅱ所示化合物对HIV-1_ⅢB致细胞病变(CPE)的抑制试验

将8×10⁵/mL C8166细胞50μL/孔接种到含有100μL/孔梯度倍比稀释药物的96孔细胞培养板上，然后加入50μL的HIV-1_ⅢB稀释上清，1300TCID₅₀/孔。设置3个重复孔。同时设置不含药物的正常细胞对照孔。AZT为阳性药物对照。37摄氏度，5％二氧化碳培养3天，倒置显微镜下(100×)计数合胞体的形成。EC₅₀(50％Effective concentration)为抑制合胞体形成50％时的药物浓度。实验结果如表2、图16～18所示。

表2式Ⅰ及式Ⅱ所示化合物对HIV-1_ⅢB诱导C8166细胞病变(CPE)的抑制作用

式Ⅰ及式Ⅱ所示化合物对HIV-1_ⅢB诱导C8166细胞病变有良好的抑制作用，抑制作用的EC₅₀值分别为11.31μg/mL、15.08μg/mL。

阳性药AZT(叠氮胸苷)是1987年在临床上最先使用的抗HIV药物，单一或二联治疗HIV感染，由于这种治疗通常在6个月内即出现明细的耐药性，而且对机体的免疫重建不佳，并且还有骨髓抑制、白细胞下降、总淋巴细胞数减少及巨幼红细胞贫血等毒副反应，因此临床上治疗效果并不理想。式Ⅰ及式Ⅱ所示化合物对C8166细胞的毒性小，对HIV-1诱导C8166细胞形成合胞体抑制的EC₅₀值分别为11.31μg/mL、15.08μg/mL，治疗指数(TI值)分别为99.91、67.63，表明具有显著的抗HIV-1活性，可用作潜在的治疗艾滋病药物。

Claims

1.式Ⅰ或式Ⅱ所示化合物：

2.权利要求1中式I或式Ⅱ所示化合物的制备方法，包括下述步骤：

其中，Ac代表乙酰基，Bz代表苯甲酰基；

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：

步骤1)中，式Ⅲ所示的双糖受体化合物与式Ⅳ所示单糖供体化合物的摩尔比为1:3.3～4.0；

式Ⅴ所示的四糖受体化合物与式Ⅳ所示单糖供体化合物的摩尔比为1:2.2～3.0；

所述催化剂选自下述至少一种：N-碘代丁二酰亚胺/三氟甲磺酸、二甲基甲硫基硫鎓三氟甲磺酸盐和三甲基硅基三氟甲磺酸；

所述催化剂为三甲硅基三氟甲磺酸时，三甲硅基三氟甲磺酸与式Ⅲ所示的双糖受体化合物或式Ⅴ所示的四糖受体化合物的摩尔比为0.01～0.5:1；

所述缩合反应的温度为-45℃～15℃；

所述缩合反应的时间为2～4小时；

所述缩合反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂选自下述至少一种：二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、甲苯、氯仿、乙腈、乙醚、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃和二甲氧基乙烷。

4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于：

步骤1)中，式Ⅲ所示的双糖受体化合物按照包括下述步骤的方法制备得到：

以对甲氧基苯基甘露糖苷1作为起始原料，经过4,6-羟基异丙叉基化得到化合物2、选择性烯丙氧羰基化、苯甲酰基化得到化合物3、解叉基保护得到化合物4，再进行选择性烯丙氧羰基化、苯甲酰基化得到全保护的甘露糖苷化合物5；

化合物5经过脱除1位对甲氧基苯基、三氯乙酰亚胺酯活化，得到甘露糖三氯乙酰亚胺酯7；

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：

步骤1)中，式Ⅴ所示的四糖受体化合物按照包括下述步骤的方法制备得到：

以对甲氧基苯基甘露糖苷1作为起始原料，经过2,3-羟基异丙叉基化得到化合物9，经苯甲酰基化、解叉基保护得到化合物10、经选择性乙酰化反应得到2位羟基裸露的糖基受体化合物11；

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：

步骤1)中，式Ⅳ所示的单糖供体化合物按照包括下述步骤的方法制备得到：

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤2)中，所述保护基脱除反应的反应温度为20～30℃，时间为4～8天。

8.权利要求1中式I或式Ⅱ所示化合物在制备下述产品中的应用：1)抗HIV药物；2)治疗艾滋病药物。

9.一种产品，其活性成分为权利要求1中式I或式Ⅱ所示化合物；其中，所述产品为：1)抗HIV药物；2)治疗艾滋病药物。