CN105012283A - 一种包含大黄酸的药物组合物及其制药用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种包含大黄酸的药物组合物及其制药用途，该组合物含有大黄酸、大黄素，还可以含有大黄酚和大黄素甲醚。该组合物可以制成固体形式、液体形式、气体形式或半固体形式的制剂，经大量实验证实，它可用于治疗肾脏疾病、肾病综合征、高血压肾病、心脑血管疾病和肿瘤疾病等。

Description

一种包含大黄酸的药物组合物及其制药用途

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种含有大黄酸和大黄素用于治疗肾脏疾病的药物组合物及其应用。

背景技术

大黄酸(Rhein,4.5-dihydroxy anthraquinone)属单蒽核类1，8-二羟基蒽醌衍生物，咖啡色针晶，不溶于水，能溶于吡啶、碳酸氢钠水溶液，微溶于乙醇、苯、氯仿、乙醚和石油醚，分子式C15H8O6，主要分布于蓼科植物中，它是大黄、何首乌、虎杖等多种传统中药的主要成分之一，豆科，玄参科植物中也含有该成分，其药源丰富，易得。近年来研究发现，大黄酸具有广泛的药理活性,可保肝，抗纤维化，改善细胞代谢，抗肿瘤，保护内皮细胞，调节肾功能等，一般用于治疗肾病、肿瘤、炎症等。

大黄素(1,3,8-Trihydroxy-6-methylanthraquinone)属单蒽核类1，3，8-三羟基蒽醌衍生物，橙黄色长针状结晶，几乎不溶于水，溶于乙醇及碱溶液，分子式C15H10O5，主要分布于蓼科植物中，是大黄的主要成分之一，研究发现，大黄素具有抗菌、止咳、抗肿瘤、降血压，保护肾脏的作用，可用于治疗细菌或真菌感染、肿瘤、肝炎及肾脏疾病。

大黄酚(1,8-Dihydroxy-3-methyl-anthraquinone)，橙黄色片状体，几乎不溶于水，略微溶于冷醇，易溶于沸乙醇，溶于苯、氯仿、乙醚、冰醋酸及丙酮等。分子式C15H10O4，主要来源于蓼科植物，具有抗菌和抗衰老的作用。

大黄素甲醚(1,8-dihydroxy-3-methoxy-6-methylanthraquinone emodin3-methylether)，金黄色针状结晶，几乎不溶于水，微溶于冷乙醇，易溶于沸乙醇，溶于苯、氯仿、乙醚、丙酮、冰醋酸、氢氧化钠及热碳酸钠溶液。分子式C16H12O5。主要来源于蓼科植物，具有抗菌和杀菌的作用。

虽然目前对大黄酸的治疗作用已有研究报道，但多集中用于治疗糖尿病肾病，大黄素的报道也多集中在治疗糖尿病肾病，并未见两种成分以固定投药量组合用于治疗肾脏及其他疾病的报道，更未见到大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚组合治疗肾脏疾病。本发明将多种成分组合使用，取得了意想不到的治疗效果，从而公开了一种治疗肾脏疾病的组合药物，为临床治疗肾脏疾病提供了新的方法。

发明内容

经过大量试验研究证实，本发明公开的中药组合物能有效治疗肾脏疾病、慢性肾衰、高血压肾病、肿瘤、心脑血管等疾病。

本发明组合物含有大黄酸1-80份、大黄素1-60份。还含有大黄酚1-50份和大黄素甲醚1-50份。

本发明组合物成分可以是从大黄、虎杖或何首乌等中药中提取得到，也可以化学合成得到。

本发明药物组成优选：

1.大黄酸1mg、大黄素60mg。

2.大黄酸80mg、大黄素1mg。

3.大黄酸40mg、大黄素30mg。

4.大黄酸40mg、大黄素30mg、大黄酚和大黄素甲醚1mg。

5.大黄酸40mg、大黄素30mg、大黄酚和大黄素甲醚50mg。

6.大黄酸40mg、大黄素30mg、大黄酚和大黄素甲醚25mg。

本发明组合物可采用本技术领域常用技术手段，将本发明药物组合物制成任何一种临床所需剂型，包括可以制成固体形式、液体形式、气体形式或半固体形式的制剂，优选注射剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂或冲剂。

本发明选择六组组合物开展的试验研究如下，六组组合物分别是：

组合物一：大黄酸1mg、大黄素60mg。

组合物二：大黄酸80mg、大黄素1mg。

组合物三：大黄酸40mg、大黄素30mg。

组合物四：大黄酸40mg、大黄素30mg、大黄酚和大黄素甲醚1mg。

组合物五：大黄酸40mg、大黄素30mg、大黄酚和大黄素甲醚50mg。

组合物六：大黄酸40mg、大黄素30mg、大黄酚和大黄素甲醚25mg。

实验一、本发明对慢性肾衰大鼠的治疗作用

1.实验动物SD大鼠150只，雌雄各半，体重200g±20g，购自中国科学院上海实验动物中心。

2.实验药物本发明6组组合物成分由大连美仑生物技术有限公司提供，实验前均用0.5％羧甲基纤维钠配成5mg/ml溶液，大黄酸和大黄素组配制浓度基本与组合物六浓度相同。

3.实验方法取SD大鼠，随即取出15只作为空白对照组，其余大鼠适应性喂养3天。除空白对照组外，其余大鼠用2.5％腺嘌呤混悬液按250mg/kg/天灌胃，连续灌胃给予3周，待出现血清尿素氮、肌酐升高等肾功能衰竭现象时，将符合要求的大鼠随即分为模型组、组合物一至六组、大黄酸组和大黄素组。组合物一至六组、大黄酸和大黄素组分别灌胃给予相应药物10ml/kg，空白对照组和模型组灌胃给予等体积的0.5％羧甲基纤维钠溶液，每日给药一次，连续给药4周。末次给药24h后，腹主动脉取血，测定血清尿素氮、肌酐、血清白蛋白的含量和血液流变学各指标，解剖肾脏进行病理切片，显微镜下观察病理变化。

4.检测指标

(1)测定血清尿素氮、肌酐和血清白蛋白的含量

(2)血液流变学检查

(3)病理学检查

5.实验结果

(1)本发明对慢性肾衰模型大鼠血清尿素氮、肌酐和血清白蛋白的影响。见表1。

表1本发明对慢性肾衰大鼠血清尿素氮、肌酐和血清白蛋白的影响

注：各组与模型组比较^*P<0.05，^**P<0.01

结果表明：空白对照组与模型组比较尿素氮和肌酐明显较低，血清白蛋白明显较高，且有显著性差异，表明造模后，已对大鼠造成严重损伤，经过4周的治疗，各给药组大鼠尿素氮和肌酐明显降低，血清白蛋白明显升高，且有显著性差异(p<0.05或p<0.01)，且指标改善情况优于单有等剂量的大黄酸或大黄素。

(2)本发明对慢性肾衰大鼠血液流变学的影响。见表2。

表2本发明对慢性肾衰大鼠血液流变学的影响

注：各组与模型组比较^*P<0.05，^**P<0.01

结果表明：空白对照组与模型组比较全血粘度，血浆粘度和红细胞压积均明显较低，且有显著性差异，表明造模后，已对大鼠造成严重损伤，经过4周的治疗各给药组大鼠全血粘度，血浆粘度和红细胞压积均明显降低，且有显著性差异(p<0.05或p<0.01)，且指标改善情况优于或等于单有等剂量的大黄酸或大黄素。

(3)HE染色显微镜下观察结果

空白对照组：肾小球和肾小管清晰，结构正常，未见病理改变；模型组：肾小球萎缩，肾小管明显扩张，近曲小管和远曲小管上皮细胞均有明显浊肿和变性发生，肾间质纤维组织增生，并有慢性炎细胞浸润；各给药组：肾小球轻微充血，结构未见异常，肾小管有轻微扩张，无明显炎细胞浸润。

6.结论结果证实，各给药组对慢性肾衰均有较好地治疗作用，且优于单用某一成分，具体表现在改善血肌酐、尿素氮、血清白蛋白、血液流变学各指标和病理学特征方面。

实验二、本发明组合物对肾小球肾炎的治疗作用

1.实验动物SD大鼠170只，雌雄各半，体重180-220g，购自中国科学院上海实验动物中心。新西兰白兔8只，购自西安市迪乐普生物资源开发有限公司。

2.实验药物本发明6组组合物成分由大连美仑生物技术有限公司提供，实验前均用0.5％羧甲基纤维钠配成5mg/ml溶液，大黄酸和大黄素组配制浓度基本与组合物六浓度相同。

3.实验方法

(1)制备兔抗大鼠胸腺细胞血清取无菌的SD大鼠6只，处死，小心摘取大鼠胸腺和肝脏。将肝脏用PBS缓冲液冲洗干净后制成肝粉待用；另将胸腺置于PBS缓冲液中，冲洗2-3次，小心分离、去除其表面的淋巴结和血管，置200目不锈钢网筛上，用解剖针轻轻划破胸腺游离出胸腺细胞，用PBS缓冲液冲洗，收集胸腺细胞悬液，离心10min，用PBS缓冲液重制2×10⁷/ml的胸腺细胞悬液，按体积比1：2混合胸腺细胞悬液和弗氏完全佐剂,充分混匀，以混合后的悬液作为大鼠胸腺细胞免疫抗原液。将大鼠胸腺细胞免疫抗原液多点注射于8只新西兰白兔背部皮下，每只兔子注射3ml。常规饲养2周后,兔耳缘静脉注射2×10⁷/ml的胸腺细胞悬液，每只注射1.5ml。7d后心脏抽取兔子血液，收集兔血清。用免疫扩散法测抗兔抗大鼠胸腺细胞血清效价为1：160-1：320。兔抗大鼠胸腺细胞血清于56℃、30min灭活后，分别用同个体大鼠肝粉吸附以去除非特异性抗体，室温离心30min，弃去肝粉，收集兔抗大鼠胸腺细胞血清，-20℃保存备用。

(2)慢性肾小球肾炎大鼠模型的制备取健康SD大鼠150只，适应性喂养3天后，收集尿液，检测尿蛋白，结果均为阴性。随即分为正常对照组、模型组、组合物一至六组、大黄酸组和大黄素组，每组15只。除正常对照组大鼠尾静脉注射2ml生理盐水外，其余组大鼠一次性尾静脉注射兔抗大鼠胸腺细胞血清2ml。

(3)给药方法及测定指标注射兔抗大鼠胸腺细胞血清6天后，组合物一至六组、大黄酸和大黄素组分别灌胃给予相应药物10ml/kg，空白对照组和模型组灌胃给予等体积的0.5％羧甲基纤维钠溶液，每日给药一次，连续给药4周。末次给药24小时后，腹主动脉取血，分别测定IL-6、IL-8和TNF-α水平，解剖肾脏，进行病理学考察。

4.结果

(1)本发明对慢性肾小球肾炎大鼠血清IL-6、IL-8和TNF-α的影响

表3本发明对慢性肾小球肾炎大鼠血清IL-6、IL-8和TNF-α的影响

注：各组与模型组比较^*P<0.05，^**P<0.01

结果表明：模型组大鼠血清IL-6、IL-8和TNF-α水平较正常对照组显著升高(P<0.01)，表明造模成功。本发明药物组和大黄酸、大黄素组大鼠血清IL-6、IL-8和TNF-α水平低于模型组(P<0.05或P<0.01)，本发明药物组可降低IL-6含量水平，表明各给药组在一定程度上均可以改善血清细胞因子水平；另外，同等剂量下，本发明药物组优于单纯大黄酸和大黄素组。

(3)病理学检查正常对照组大鼠肾小球轮廓、结构清晰，形态正常；模型组大鼠肾小管明显肿胀，有充血，管腔变窄，部分可见蛋白管形，肾小球体积增大，可见炎细胞浸润；各给药组大鼠肾小球结构未见明显异常，肾小球毛细管有轻微肿胀，基底膜稍有增厚，炎细胞浸润不明显。

5.结论实验结果证实，各给药组对慢性肾小球肾炎大鼠均有较好地治疗作用，具体表现在降低血清炎症因子水平和改善病理学特征方面。

实验三、考察本发明药物对高血压肾病的治疗作用

1.实验动物自发性高血压大鼠100只，雌雄各半，体重180-220g，购自中国科学院上海实验动物中心。

2.实验药物本发明6组组合物成分由大连美仑生物技术有限公司提供，实验前均用0.5％羧甲基纤维钠配成5mg/ml溶液，大黄酸和大黄素组配制浓度基本与组合物六浓度相同。

3.实验方法

待测得自发性高血压大鼠尿微量白蛋白为20-200mg/L时为自发性高血压肾病模型复制成功，剔除不合格大鼠，随机分为组合物一至六组和大黄酸组、大黄素组，另取10只做为对照组。各给药组灌胃给予相应药物0.5ml/10g，对照组给予等体积的0.5％羧甲基纤维钠溶液，每天给药一次，连续给药4周。

4.检测指标

4.1测定血压。给药前，测定大鼠清醒状态下的尾静脉收缩压，实验结束时，再次测定大鼠尾静脉的收缩压，且每次测三次求平均值。

4.2测定各组大鼠尿液中尿微量白蛋白、尿β₂微球蛋白。实验结束前收集12h尿液，收集尿液期间禁食，不禁水。

4.3测定血液中血肌酐和尿素氮的含量。实验结束时心脏取血，用济南汉方医疗器械有限公司生产的全自动生化分析仪测定血肌酐和尿素氮。

5实验结果

5.1组合物对自发性高血压肾病大鼠血压的影响，见表4。

表4本发明组合物对实验前后自发性高血压肾病大鼠血压的影响

注:与对照组比较^*P﹤0.05^**P﹤0.01

实验结果表明：实验结束时，各给药组大鼠血压与对照组相比明显降低，且有显著性差异(p<0.01)。各组实验前后的血压比较显示，本发明组合物降低血压幅度大于单纯使用大黄酸或大黄素组。表明本发明药物组合物对原发性高血压肾病大鼠的血压有一定降低作用。

5.2本发明对原发性高血压肾病大鼠尿液中尿微量白蛋白、尿β₂微球蛋白含量的影响，见表5。

表5对高血压肾病大鼠尿液尿微量白蛋白、尿β2微球蛋白含量的影响

注:与对照组比较*P﹤0.05**P﹤0.01

实验结果表明：本发明药物组合物可明显减低高血压肾病大鼠尿微量白蛋白和尿β2微球蛋白的含量，与空白组比较有显著性差异(p<0.01)。本发明药物组合物降低尿微量白蛋白和尿β2微球蛋白的幅度大于大黄酸和大黄素作用，表明本发明药物组合物对原发性高血压肾病大鼠的肾脏有一定保护作用。

5.3本发明对原发性高血压肾病大鼠血液中血肌酐和尿素氮的影响，见表6。

表6本发明对原发性高血压肾病大鼠血肌酐和尿素氮的影响

注:与模型组比较*P﹤0.05**P﹤0.01

结果表明：本发明药物组合物可明显减低高血压肾病大鼠血肌酐和尿素氮的含量，与空白组比较有显著性差异(p<0.01)。本发明药物组合物降低血肌酐和尿素氮的幅度大于大黄酸和大黄素的作用，表明本发明药物组合物对原发性高血压肾病大鼠的肾脏有一定保护作用。

实验四、考察本发明药物的抗肿瘤作用

1.实验动物BALB/C小白鼠100只，雌雄各半，体重18-22g，购自中国科学院上海实验动物中心。

2.实验药物本发明6组组合物成分由大连美仑生物技术有限公司提供，实验前均用0.5％羧甲基纤维钠配成5mg/ml溶液，大黄酸和大黄素组配制浓度基本与组合物六浓度相同；鼠肝癌细胞株H22由陕西中医学院药理学研究室惠赠。

3.实验方法

建立肿瘤模型自种鼠腹腔内小心抽出接种H22细胞株的腹水，转移接种到另一只小鼠腹腔，传代三次。取接种H22细胞株并传代三次的小鼠，无菌条件下用5ml注射器抽吸出1-2ml牛奶状、较粘稠的腹水，先用0.4％苔盼蓝染色，细胞计数板，计活细胞率>90％，然后以灭菌D-Hanks液稀释调整肿瘤细胞浓度为1.0×10⁷个/ml。在其余小鼠右前肢腋窝和皮下接种调好浓度的肿瘤细胞，注射量为0.15ml/只。

给药方法建立模型72小时后，将实体瘤小鼠随机分为九组，即羧甲基纤维钠对照组、组合物一至六组、大黄酸组和大黄素组，每组10只。各给药组灌胃给于相应药物0.5ml/10g，羧甲基纤维钠对照组给予等体积的羧甲基纤维钠，每天一次，连续给药2周。每天记录小鼠死亡数，并称量不同给药组小鼠体重。

抗肿瘤活性评价给药期间每天称量动物体重，末次给药48h后处死动物，剥离肿瘤，称重，置于10％福尔马林溶液固定后，进行病理切片。

按以下公式计算药物对肿瘤生长的抑制率。肿瘤生长抑制率＝(对照组平均瘤重－给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100％。

4.实验结果

本发明药物体内抗肿瘤活性结果如下表。

表7体内抗肿瘤活性实验结果

注：各组与对照组比较^*P<0.05，^**P<0.01

实验结果表明：不同给药组与对照组相比明显抑制肿瘤活性，均有显著性差异(P<0.05或P<0.01)，可以看出各组药物对肿瘤的抑制程度以组合物六最佳。

5.结论本发明药物对肿瘤有抑制作用，可用于肿瘤疾病的治疗。

实验五、本发明药物对血管内皮细胞的保护作用

1.实验材料人脐静脉血管内皮细胞株(内皮细胞ECV-304)购自上海拜力生物科技有限公司；DMEM高糖培养基、胎牛血清均购自Gibco公司。MDA、SOD试剂盒购自南京建成生物有限公司；H₂O₂购于天津科密欧化学试剂有限公司；胰酶、四氮唑兰(MTT)购自美国SIGMA公司。

2.实验药物本发明6组组合物成分由大连美仑生物技术有限公司提供，实验前均用0.5％羧甲基纤维钠配成5mg/ml溶液，大黄酸和大黄素组配制浓度基本与组合物六浓度相同。

3.实验方法

细胞培养将人脐静脉血管内皮细胞置于混有2mmol/L L－谷氨酰胺、100μg/ml肝素、100U/ml青霉素、30μg/ml内皮细胞生长因子和10％胎牛血清的1640培养液中，于37℃、5％CO₂饱和湿度的细胞培养箱中培养。当细胞生长融合至80％时，倒出旧的培养基，用PBS液轻洗细胞2～3次，再加入1ml左右0.125％胰酶，至37℃、5％CO₂培养箱孵育2min，镜下见细胞皱缩、细胞间隙增大时，吸弃胰酶，加入含10％胎牛血清的完全培养液以终止胰酶的作用，用吸管反复轻轻吹打细胞，使之从瓶壁脱落成细胞悬液。细胞计数，调整细胞密度为1×10⁵个/ml，接种于96孔板每孔100μl，置于37℃、5％CO₂条件下培养。约24h后，用于实验。

建立H₂O₂诱导人脐静脉血管内皮细胞损伤模型血管内皮细胞以10⁴个/孔接种于96孔培养板。用无血清培养基将H₂O₂配成0、75、150、300、600μmol/L剂量组，分别加入96孔板中，每孔100μl，分别作用12、24、48h后，将上清液弃掉，每孔加入100μl培养基和20μl MTT(5g/L)作用4h，将上清弃掉，每孔加150μl二甲基亚砜，微孔振荡器上振荡15min，570nm酶标仪下测定细胞吸光度值(A)。细胞抑制率％＝(空白组吸光度值－各组吸光度值)(A)/空白组吸光度值(A)×100％。

给药方法将细胞以2×10⁵个/孔接种于6孔板，实验分为10组，正常对照组:每孔给予2ml无血清培养基；模型组:每孔给予2ml终浓度为300μmol/LH₂O₂，作用24h；本发明组方一至六和大黄酸组、大黄素组:给予2ml终浓度为50mg/ml相应药物，孵育4h后，给予2ml终浓度为300μmol/L H₂O₂作用24h。检测细胞中SOD、MDA的含量:消化收集各组细胞，每组加1ml PBS，采取反复冻融的方法(－80°冰箱15min，室温20min，如此重复5次)，至细胞破碎，内容物流出，3000r/min离心15min，吸取上清，进行BCA蛋白定量，然后按试剂盒说明书进行MDA、SOD的含量测定。

4.实验结果

本发明药物对人静脉血管损伤的保护作用，见表8。

表8本发明药物对人静脉血管SOD、MDA的影响

注：各组与模型组比较^*P<0.05，^**P<0.01

实验结果表明：各给药组较模型组SOD活性升高，MDA含量下降，且有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。

5.结论实验证明本发明组方可以改善受损的静脉血管内皮细胞，提示可以用于治疗心脑血管疾病。

具体实施例

实施例1

取大黄酸2.0g、大黄素1.5g，加PEG-20050ml,再加注射用水稀释至500ml，滤过，补充注射用水至800ml，调节pH值至6.5-7.0，加注射用水稀释至1000ml，用0.22μm微孔滤膜滤过，分装，灭菌，得注射剂。

实施例2

取大黄酸200g、大黄素150g、葡甲氨和精氨酸适量，加入注射用水稀释至5L，搅拌直至溶解，滤过，滤液调pH值至5.0-7.0，用0.22μm微孔滤膜进行精滤；取甘露醇适量加注射用水配制成溶液，与上述滤液混匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，加注射用水稀释至10L，按单位制剂10ml的剂量分装，冷冻干燥，得冻干粉。

实施例3

取大黄酸62.5g、大黄素46.9g、大黄酚和大黄素甲醚0.6g，预交化淀粉，微粉硅胶，硬脂酸镁，滑石粉适量，分别过80目筛后，与药粉混合均匀，加适量的黏合剂制成软材，制粒，颗粒于60℃干燥。加微粉硅胶、硬脂酸镁和滑石粉后混合均匀，压制成1000片。

实施例4

取大黄酸62.5g、大黄素46.9g、大黄酚和大黄素甲醚0.6g，预交化淀粉，微粉硅胶，硬脂酸镁，滑石粉适量,分别过80目筛后，均匀混合，加适量的黏合剂制成软材，制粒；颗粒在60℃干燥。加入羧甲淀粉钠、微粉硅胶、硬脂酸镁和滑石粉混合均匀，装胶囊，制成1000粒。

实施例5

取大黄酸1056g、大黄素792g、大黄酚和大黄素甲醚10.56g，预交化淀粉，微粉硅胶，硬脂酸镁，滑石粉适量,再加阿斯巴甜适量,制成软材，制粒，在60℃干燥后，检测合格后，分装于药用聚乙烯塑料袋中，每袋5g,共制1000袋。

Claims (9)

1.一种用于治疗肾脏疾病的组合物，按重量份计，含有大黄酸1-80份、大黄素1-60份。

2.根据权利要求1所述组合物，其特征在于：还含有大黄酚1-50份和大黄素甲醚1-50份。

3.根据权利要求1-2任一所述的组合物，其特征在于：其中大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚可以从大黄、虎杖、或何首乌中提取得到。

4.根据权利要求1-2任一所述的组合物在制备用于治疗肾脏病的药物中的应用。

5.根据权利要求1-2任一所述的组合物在制备用于治疗肾病综合征的药物中的应用。

6.根据权利要求1-2任一所述的组合物在制备用于治疗高血压肾病的药物中的应用。

7.根据权利要求1-2任一所述的组合物在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用。

8.根据权利要求1-2任一所述的组合物中制备用于治疗心血管疾病的药物中的应用。

9.根据权利要求1-2任一所述组合物，其特征在于：该组合物为固体形式、液体形式、气体形式或半固体形式的制剂。