CN107243079A - 一种含大黄酸的药物组合物及其在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含大黄酸的药物组合物及其在制备抗肿瘤药物中的应用，该药物组合物包括大黄酸和EGFR抑制剂。细胞试验结果显示，大黄酸和EGFR抑制剂联用时，可以对产生耐药性的肿瘤细胞具有更好的抑制效果，具有较好的抗肿瘤潜力。

Description

一种含大黄酸的药物组合物及其在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于抗肿瘤药物领域，具体涉及一种含大黄酸的药物组合物及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

EGFR/MEK是调节细胞内环境稳态的一种酪氨酸激酶，其与配体结合后可影响细胞增殖、凋亡、迁移、存活、血管生成和肿瘤发生等一系列复杂过程，EGFR/MEK抑制剂已逐渐应用于临床肿瘤治疗。但随着时间的推移，EGFR/MEK抑制剂靶向治疗出现了耐药现象。由于EGFR/MEK调节多种细胞功能，该耐药现象可能与多个传导通路紊乱有关,包括配体自分泌/旁分泌的产生、受体突变、下游信号蛋白的组成性活化以及旁路信号途径的激活。

信号转导和转录激活子3(Signal Transducer and Activator ofTranscription,STAT3)是信号转导和转录活化因子家族的重要成员之一，因其可介导细胞的恶性转化和肿瘤的生成而被确认为癌基因。目前研究表明，STAT3及其介导的信号转导通路在肿瘤的发生、发展及浸润转移中起着重要的作用，并且与肿瘤细胞的耐药有关。STAT3不仅可以作为EGFR信号通路中的一个重要下游调节因子，参与EGFR/MEK介导的癌细胞的迁移与侵袭，也可以通过IL-6/STAT3通路及其他信号通路进行非EGFR依赖性地激活，从而成为独立于EGFR/MEK，调控细胞增殖存活等多种生物学功能的重要信号通路，进一步可能成为EGFR/MEK抑制剂耐药过程中被激活而促进细胞增殖存活的一条重要旁路。因此，STAT3信号通路的反馈性激活是肿瘤细胞对EGFR/MEK抑制剂耐药的新机制，有必要寻找与EGFR/MEK抑制剂联合使用的辅助药物，从而克服耐药、更好地治疗肿瘤。

近年来从中草药和常见的天然产物中寻找毒副作用小的抗肿瘤药物已成为研究热点。大黄酸是常见的天然产物，具有抗肿瘤作用且毒性较低，公开号为CN 103505448 A的中国专利申请公开了一种大黄酸在治疗纤维化病症和肿瘤的应用，然而大黄酸的抗肿瘤效果不够强，往往需要使用较大的剂量。

在现代医学尤其是肿瘤的治疗中，联合用药已成为一种趋势。单药治疗时，不可能通过无限增加剂量而提高疗效，因为随之而来的必然是不良反应的增加。相当一部分抗肿瘤药都有可能危及患者生命的不良反应。选用不良反应不相叠加的药物联合治疗不仅可因剂量低而最大限度地减少不良反应，还可能通过药物的协同作用增加疗效。然而两种药物联合使用的时候，可能产生拮抗作用，也可能产生协同作用，因此，开发出具有协同作用的药物组合可以避免单独用药的缺陷，具有重要的意义。

发明内容

本发明提供了一种含大黄酸的药物组合物及其在制备抗肿瘤药物中的应用，该药物组合物对产生耐药性的癌细胞具有较好的疗效。

一种含大黄酸的药物组合物，包括大黄酸和EGFR/MEK抑制剂。

细胞试验表明，大黄酸可以降低癌细胞p-STAT3(Y705)的水平，而STAT3在EGFR/MEK抑制剂耐药过程中的重要作用，当癌细胞中的p-STAT3(Y705)水平升高时，其对EGFR/MEK抑制剂的耐药性增加。大黄酸通过抑制STAT3磷酸化，可以有效减缓EGFR/MEK抑制剂的耐药性，因此，大黄酸可以作为一种STAT3抑制剂，用于辅助治疗癌症。

同时，更进一步的细胞试验表明，当将大黄酸与EGFR/MEK抑制剂组合使用时，与单独的EGFR/MEK抑制剂相比，对癌细胞具有更好的抑制效果，尤其是那些已经对EGFR/MEK抑制剂产生一定耐药性的癌细胞，联合使用的效果尤其好。

作为优选，所述的EGFR抑制剂为Afatinib(阿法替尼)、Erlotinib(厄洛替尼)。MEK抑制剂为GSK1120212(Tramatinib)中的一种或者多种，此时，药物组合物的协同效果更好。

本发明还提供了一种所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

作为优选，所述的抗肿瘤药物由所述的药物组合物和药用辅料制成。本文中所用“药用辅料”指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙/镁、聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

本发明抗肿瘤药物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。所述药物的制剂形式包括注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、软膏剂、控释或缓释剂或纳米制剂。

作为优选，所述的抗肿瘤药物用于抑制癌细胞的生长；

所述的癌细胞为对EGFR/MEK抑制剂产生耐药性的癌细胞。此时，同现有的抗癌药物相比，该抗肿瘤药物具有更好的效果。

作为优选，所述的癌细胞为胰腺癌细胞。

同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

(1)细胞试验表明，大黄酸可以有效地抑制STAT3磷酸化，从而可以作为一种有效的STAT3抑制剂，改善癌细胞对EGFR/MEK抑制剂的耐药性，用于辅助治疗癌症。

(2)更进一步的细胞试验表明将大黄酸与EGFR/MEK抑制剂制备成组合物，可以产生协同作用，达到更好的抗癌效果。

附图说明

图1为实施例1中大黄酸对PANC-1和BxPC-3细胞中STAT3的抑制效果图；

图2为实施例1中大黄酸对PANC-1和BxPC-3细胞中Bcl-2和Caspase-3的作用效果图；

图3为实施例2中大黄酸抑制STAT3入核的显微镜照片；

图4为实施例2中大黄酸抑制STAT3入核的Western blotting分析结果；

图5为实施例3中大黄酸和Afatinib联合抑制PANC-1细胞生存率对比图；

图6为实施例4中大黄酸和Erlotinib联合抑制PANC-1细胞生存率对比图；

图7为实施例5中大黄酸和GSK1120212联合抑制PANC-1细胞生存率对比图；

图8为实施例6中大黄酸和EGFR抑制剂联用协同抑制细胞集落形成的示意图；

图9为实施例7中大黄酸和EGFR抑制剂协同诱导胰腺癌细胞调亡试验结果示意图；

图10为实施例8中大黄酸和EGFR抑制剂协同抑制增殖信号蛋白试验结果示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的描述。

实施例1大黄酸抑制STAT3磷酸化试验

大黄酸(终浓度30-100μM)处理胰腺癌细胞，孵育24-48h后，收集蛋白，进行Western blot分析。检测大黄酸对STAT3磷酸化水平的影响

结果见图1，当用不同浓度大黄酸干预PANC-1和BxPC-3细胞24h后，检测p-STAT3(Y705)蛋白的水平，结果显示对照组p-STAT3(Y705)含量较高，而大黄酸处理后p-STAT3(Y705)水平明显减少，说明大黄酸可以抑制STAT3的磷酸化激活。

同时，图2的结果表明，Bcl-2(B-cell lymphoma-2)细胞凋亡抑制基因减少，细胞凋亡Caspase-3剪切酶增加。说明大黄酸可能通过抑制STAT3的磷酸化及影响凋亡相关蛋白从而抑制细胞生长和促进凋亡。

实施例2大黄酸抑制IL-6诱导的STAT3入核

方法：大黄酸处理胰腺癌PANC-1细胞12后，再加入IL-6(10ng/mL)孵化15分钟，按免疫荧光实验方法步骤制片，荧光显微镜检查。结果见图3，激光共聚焦显微镜观察，每一张图片代表三次独立实验中随机选择的区域。

图3中，蓝色为DAPI染色的细胞核，红色为FITC标记的P-STAT3，PANC-1细胞中加入IL-6处理后，细胞核中P-STAT3显著增多，可以看到细胞核中有很明显的颗粒状P-STAT3，大黄酸可剂量依赖性抑制IL-6诱导p-STAT3入核。

同时，大黄酸处理PANC-1细胞12h后，加10ng/mL IL-6孵化1h，提取核蛋白进行Western blotting分析，Lamin B作为内参，分析结果见图4，结果也表明大黄酸可剂量依赖性抑制IL-6诱导P-STAT3入核。

实施例3大黄酸(Rhein,R)和阿法替尼(Afatinib)联合抑制PANC-1细胞生存率

方法：将处于对数期生长的细胞(15000细胞/mL)200μL接种于96孔板，每孔3000个；过夜培养后，更换新鲜培养基；每孔加入2μL DMSO溶解的药液，设置单独和联合药物组，继续分别培养72h后；用MTT法方法测定OD值，计算抑制率，细胞生存率＝1-抑制率。每个孵育时间组都同时设置阴性对照组，该组只加2μL不含药物的DMSO。每个药物在不同孵育时间组及每个阴性对照组都设置三个复孔，三次重复，得到的结果如图5所示，误差表示平均值的标准偏差。(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001)。

图5的结果显示，大黄酸联合EGFR抑制剂Afatinib时，对胰腺癌耐药细胞的抑制活性优于大黄酸或Afatinib单独用药，并具有明显的统计学意义。

实施例4

将阿法替尼(Afatinib)替换为Erlotinib，其他操作方式与实施例3相同，得到的结果如图6所示。

图6的结果显示，大黄酸联合EGFR抑制剂Erlotinib时，对胰腺癌耐药细胞的抑制活性优于大黄酸或Erlotinib单独用药，并具有明显的统计学意义。

实施例5

将阿法替尼(Afatinib)替换为GSK1120212，其他操作方式与实施例3相同，得到的结果如图7所示。

图7的结果显示，大黄酸联合MEK抑制剂GSK1120212时，对胰腺癌耐药细胞的抑制活性优于大黄酸或GSK1120212单独用药，并具有明显的统计学意义。

实施例6

大黄酸和EGFR抑制剂Afatinib，Erlotinib单独或联合处理PANC-1细胞2小时，阴性对照加DMSO。将相同密度细胞分别接种和培养2-3周。克隆簇用冰甲醇固定和1％结晶紫染色，结果见图8。

由图8可知，大黄酸联合Afatinib和Erlotinib能够有效抑制胰腺癌细胞集落形成，EGFR抑制剂单独用药却几乎不影响细胞生长，说明对其有一定的耐药性。因此，大黄酸可能是通过抑制STAT3逆转胰腺癌对EGFR抑制剂耐药。

实施例7联合大黄酸和EGFR抑制剂协同诱导胰腺癌细胞调亡试验

对数生长期的PANC-1细胞1.2×10⁶个接种于直径为6cm的培养皿中，过夜培养后，加药孵育24h后，消化并收集细胞，用FITC AnnexinV和PI染色上机检测，分析细胞凋亡率，以DMSO组为空白对照。实验进行三次重复，得到的结果如图9所示。

图9(A)中，用100μM的大黄酸，5μM Erlotinib单独或联合处理胰腺癌PANC-1细胞24小时后，提取总蛋白，WB分析调亡相关蛋白Bcl-2，BAX，Cle-casepase-3和Cle-PARP，GAPDH作为内参。结果显示联合用药明显上调抑癌蛋白Bax，下调促癌蛋白Bcl-2的表达，同时提高Cle-Caspase-3和Cle-PARP的活性，进而诱导PANC-1细胞的凋亡。

图9(B)中，用60μM的大黄酸，5μM Erlotinib单独或联合处理胰腺癌PANC-1细胞24小时后，Hoechst 33258染色，荧光显微镜观察(×200)。结果显示联合处理组的细胞其细胞核颜色由正常的蓝色变为亮蓝色，表明细胞发生凋亡，联合处理组的细胞凋亡率明显高于单独处理组的细胞凋亡率。

图9(C)中，流式细胞仪测定化合物大黄酸单独或与Erlotinib联合诱导胰腺癌PANC-1细胞凋亡的情况。结果显示大黄酸联合Erlotinib可协同诱导PANC-1细胞的凋亡。

实施例8大黄酸和EGFR抑制剂协同抑制增殖信号蛋白试验

对PANC-1细胞系用不同抑制剂单独或联合处理(Rhein 60μM，Erlotinib 5μM，Afatinib 2.5μM)24小时，免疫印迹法检测P-EGFR，P-STAT3，STAT3和EGFR，结果见图10(A,B)。

对BxPC-3细胞系单独用60μM大黄酸处理或联合EGFR抑制剂(Erlotinib 5μM，Afatinib 2.5μM)处理24小时，再通过Western Blotting法检测P-STAT3(Y705)，STAT3，P-EGFR和EGFR，GAPDH作为内参，结果见图10(C,D)。

结果显示大黄酸能联合靶向药物EGFR抑制剂Erlotinib/Afatinib起协同作用，双重抑制STAT3和EGFR，增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性并减轻其副作用。

Claims (8)

1.一种含大黄酸的药物组合物，其特征在于，包括大黄酸和EGFR或MEK抑制剂。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，大黄酸与EGFR或MEK抑制剂产生协同抗肿瘤作用的机制是，大黄酸靶向抑制STAT3的激活，而肿瘤细胞中的STAT3激活是EGFR或MEK抑制剂产生耐药或脱敏的主要原因之一。

3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述的EGFR抑制剂为Gefitinib(吉非替尼)、Afatinib(阿法替尼)和Erlotinib(厄洛替尼)或MEK抑制剂GSK1120212(Tramatinib)中的一种或者多种。

4.一种如权利要求1-3所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物由所述的药物组合物和药用辅料制成。

6.根据权利要求4所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物的制剂形式选自注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、软膏剂、控释或缓释剂或纳米制剂。

7.根据权利要求4所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物用于抑制癌细胞的生长；

所述的癌细胞为对EGFR或MEK抑制剂产生耐药性的癌细胞。

8.根据权利要求7所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用，其中所述的肿瘤优选为胰腺癌和结直肠癌。