CN105010399A - 一种利迪链霉菌发酵液中抗真菌活性物质的分离纯化方法 - Google Patents

一种利迪链霉菌发酵液中抗真菌活性物质的分离纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利迪链霉菌发酵液中抗真菌活性物质的分离纯化方法，步骤为：（1）将利迪链霉菌S.lydicus？E9保藏号为CGMCC？No.3075的发酵液离心，收集上清，加絮凝剂，混匀，静置，抽滤得滤液；（2）滤液经大孔树脂层析柱，用甲醇水溶液冲洗除色素和未吸附杂质，再用乙醇水溶液洗脱活性成分；（3）合并活性洗脱液并浓缩得浓缩液；（4）浓缩液经葡聚糖凝胶层析柱进行分子筛层析，用乙醇水溶液洗脱，分管收集洗脱液，并按收集顺序依次编号，分别检测其抗真菌活性，收集抗真菌活性组分。本发明分离纯化流程简单快速、操作方便、成本低。三废排放少。纯化过程温和，活性物质的纯度较高。洗脱剂毒性低，回收处理简单。

Description

一种利迪链霉菌发酵液中抗真菌活性物质的分离纯化方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种利迪链霉菌发酵液中抗真菌活性物质的分离纯化方法。
背景技术
据FAO统计，全世界农林业中每年因虫害、病害和杂草危害造成的损失占总产值的37%，真菌病害占据各种病害之首，损失额高达1260亿美元，相当于中国农业总产值的一半。我国是一个农业大国，农业生产是国民经济中的重要组成部分，而农作物的病虫害又是影响农业丰产的重要生物学因子，因此用于防治植物病虫害的农药在农业生产中起着至关重要的作用。
化学农药在病虫草害的防治上一直居于主导地位，但化学农药的使用越来越显现出以下几个方面的问题：高毒性，杀灭病原物的同时也杀伤害虫天敌及其它有益生物；高残留，化学农药对土壤、水体和大气的污染，农副产品中农药残留增加；抗药性，化学农药长期大量的使用致使病原物及害虫改变代谢途径产生抗药性等。因此，生物农药的开发和应用已成为全球农药产业发展的新趋势，其绿色、环保、节能等优越特性比以往任何时期都更加受到世界各国的重视，成为生物技术领域的研究热点。
链霉菌是一种分布及其广泛的革兰氏阳性菌，呈类似于真菌的纤维状，几乎60%的应用于农业的生物活性物质均来源于链霉菌。因此链霉菌被公认为在农业上极具应用潜力的工业微生物。生物活性物质是生物包括微生物、动植物在内在其生命活动过程中所产生的（或由其它方法获得的）能在低微浓度下有选择性地抑制或影响其它生物机能的有机物质，含量一般占发酵液的0.1%-5%（w/v），有些更低，因此选用合理有效的分离纯化技术，是成功获取高纯度抗生素的关键。
目前已有许多学者在进行抗真菌活性物质分离纯化的研究。2009年隋琴等人通过乙醇提取、吸附柱层析、硅胶柱层析、制备型HPLC从Streptomyces lydicus A02的发酵液中分离纯化出具有广谱抗真菌活性的那他霉素；2011年穆凌霄等人通过酸沉淀、大孔树脂SP825L吸附柱层析、硅胶柱层析、Sephadex LH－20凝胶柱层析从Streptomyces tz92的发酵液中分离纯化出嘧肽霉素；2011年张楠等人通过大孔树脂X-5吸附柱层析、硅胶柱层析、制备型HPLC从Streptomyces hygroscopicus BS-112的发酵液中分离纯化出抗真菌的Tetramycins A和B。2010年梁雪琴等人通过壳聚糖絮凝处理、酸沉淀、大孔树脂吸附层析、离子交换层析、制备型HPLC从Bacillu.sp N-23的发酵液中分离纯化出一种核苷嘧啶类抗真菌抗生素。Streptomyceslydicus E12是从海南省的土壤中筛选出来的一株放线菌，其发酵液对植物病原真菌（立枯丝核和灰葡萄孢等）具有明显的抑制作用，但对其抗真菌活性成分的分离纯化研究较少。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供一种工艺简单、成本低廉、操作简便、产品纯度高的利迪链霉菌发酵液中抗真菌活性物质的分离纯化方法。
一种利迪链霉菌发酵液中抗真菌活性物质的分离纯化方法，包括如下步骤：
（1）将利迪链霉菌S.lydicus E9保藏号为CGMCC NO.3075的发酵液在4000-5000rpm的转速下离心10-20min，收集上清液，按比例在1L上清液中加入4-8g絮凝剂，搅拌混匀后在0-4℃静置10-12h，真空抽滤收集滤液；所述絮凝剂是由质量比为0.6：1：1的亚铁氰化钾，硫酸锌和硼砂组成；
（2）滤液经装填有型号为Diaion HP-20的大孔树脂的层析柱进行吸附层析，用1-2倍柱体积的体积浓度为40%-60%的甲醇水溶液冲洗所述层析柱以除去色素和未吸附的杂质，再用3-5倍柱体积的体积浓度为50%-80%的乙醇水溶液洗脱活性成分，分管收集洗脱液，检测其抗真菌活性；
（3）合并步骤（2）中收集的抗真菌活性组分并减压浓缩至原体积的1/3-1/2，得活性浓缩液；
（4）活性浓缩液经装填有型号为Sephadex LH20的葡聚糖凝胶的层析柱进行分子筛层析，用1-2倍柱体积的体积浓度为60%的乙醇水溶液洗脱，分管收集洗脱液，检测其抗真菌活性，收集抗真菌活性组分。
步骤（1）中的离心的转速优选为4500rpm，离心的时间为10min。
步骤（2）中所述甲醇水溶液的体积浓度优选为50%，用量为2倍柱体积。
步骤（2）中乙醇水溶液的体积浓度优选为60%，用量为5倍柱体积。
步骤（2）的层析柱的装柱体积优选为15-25ml、柱高径比为8:1-15:1，上样流速为1-1.5ml/min，洗脱流速为0.3-0.6ml/min。
步骤（3）优选为：合并步骤（2）中收集的抗真菌活性组分并减压浓缩至原体积的1/3，得活性浓缩液。
步骤（4）的层析柱的装柱体积优选为80-100ml，柱高径比为10:1-20:1，上样流速为0.1-0.3ml/min，洗脱流速为0.1-0.3ml/min。
本发明的优点是：
1.分离纯化流程简单快速、操作方便、成本低廉。
2.三废排放较少，对环境友好。
3.纯化过程温和，抗真菌活性物质的纯度较高。
4.选用低毒性、低沸点的乙醇作为洗脱剂，后续回收处理简单；分离时间较短。
附图说明
图1为实施例2中絮凝处理后的发酵液与原始发酵液抗真菌活性的对比。
图2为实施例2中吸附柱层析收集到的组分的抗真菌活性检测结果。分管收集并按收集顺序依次编号后，每管取10ul滴加到PDA平皿的病原真菌菌丝块周围，28℃恒温培养12h，记录结果。对照分别为絮凝后的发酵液（CK）、50%甲醇（50%甲）和60%乙醇（60%乙）。
图3为实施例2中分子筛层析收集到的组分的抗真菌活性检测结果。分管收集并按收集顺序依次编号后，每管取10ul滴加到PDA平皿的病原真菌菌丝块周围，28℃恒温培养12h，记录结果。
图4为实施例2中分子筛层析收集到的抗真菌活性组分的LC-MS图。LC-MS条件为LCQDeca XP MAX四级杆离子肼质谱检测器(Thermo Finnigan,CA,USA)，色谱柱为XBP C18column(150mm,2.1mm;Agela Technologies)，流动相为乙腈：水(35:65)，流速0.2ml/min。
具体实施方式
下面的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限制。
利迪链霉菌Streptomyces lydicus E9于2009年5月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，并已存活。保藏机构地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，电话：010-64807355,保藏号为CGMCC NO.3075。以下简称利迪链霉菌S.lydicus E9保藏号为CGMCC NO.3075。
实施例1
取-40℃保存的菌种（利迪链霉菌S.lydicus E9保藏号为CGMCC NO.3075）接种于装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中，220rpm、28℃回旋式摇床培养48h，得到一级种子。将一级种子以10%（v/v）接种于装有100mL种子培养基的250mL摇瓶中，220rpm、28℃回旋式摇床培养24h，得到二级种子。将二级种子混匀后，4500rpm离心10min，用同等体积的无菌水重悬，然后按10%（v/v）的接种密度接种到装有3L发酵培养基的5L发酵罐中，在28℃，搅拌转速500rpm，通气量2vvm，pH自然，发酵18h即可卸罐，收集发酵液用于抗真菌活性物质的分离纯化。
种子培养基（g/L）的组成如下，淀粉30，葡萄糖5，酵母粉4，蛋白胨2，K2HPO41.5，Mg2SO4·7H2O0.5，NaCl0.5，余量为水，pH自然，121℃蒸汽灭菌20min。
发酵培养基（g/L）的组成如下，淀粉40，葡萄糖5，蛋白胨2，K2HPO41.0，Mg2SO4·7H2O0.5，NaCl0.5，余量为水，pH自然，121℃蒸汽灭菌20min。
实施例2
一种利迪链霉菌发酵液中抗真菌活性物质的分离纯化方法，包括如下步骤：
（1）将利迪链霉菌S.lydicus E9保藏号为CGMCC NO.3075的发酵液在4500rpm的转速下离心10min，收集上清液，检测其抗真菌活性，按比例在1L上清液中加入6g絮凝剂，搅拌混匀后在2℃静置11h，真空抽滤收集滤液，检测其抗真菌活性；见图1，所述絮凝剂是由质量比为0.6：1：1的亚铁氰化钾，硫酸锌和硼砂组成；
（2）滤液经装填有型号为Diaion HP-20的大孔树脂的层析柱进行吸附层析，用2倍柱体积的体积浓度为50%的甲醇水溶液冲洗层析柱以除去色素和未吸附的杂质，再用5倍柱体积的体积浓度为60%的乙醇水溶液洗脱活性成分，分管收集洗脱液，并按收集顺序依次编号，每管5ml，分别检测其抗真菌活性，见图2，收集图中抑菌圈所对应管号中的组分即为吸附层析分离得到的抗真菌活性组分，层析柱的装柱体积为20ml、柱高径比为10:1，上样流速为1.5ml/min，洗脱流速为0.4ml/min；
（3）合并步骤（2）中收集的抗真菌活性组分并减压浓缩至原体积的1/3，得活性浓缩液；
（4）活性浓缩液经装填有型号为Sephadex LH20的葡聚糖凝胶的层析柱进行分子筛层析，用1倍柱体积的体积浓度为60%的乙醇水溶液洗脱，分管收集洗脱液，并按收集顺序依次编号，每管4ml，分别检测其抗真菌活性，见图3，收集图中抑菌圈所对应管号中的组分即为分子筛层析分离得到的抗真菌活性组分。将有抗真菌活性的组分作LC-MS，见图4。层析柱的装柱体积为90ml，柱高径比为15:1，上样流速为0.2ml/min，洗脱流速为0.2ml/min。
实施例3
一种利迪链霉菌发酵液中抗真菌活性物质的分离纯化方法，包括如下步骤：
（1）将利迪链霉菌S.lydicus E9保藏号为CGMCC NO.3075的发酵液在4000rpm的转速下离心20min，收集上清液，检测其抗真菌活性，按比例在1L上清液中加入4g絮凝剂，搅拌混匀后在0℃静置12h，真空抽滤收集滤液，检测其抗真菌活性，所述絮凝剂是由质量比为0.6：1：1的亚铁氰化钾，硫酸锌和硼砂组成。
（2）滤液经装填有型号为Diaion HP-20的大孔树脂的层析柱进行吸附层析，用1倍柱体积的体积浓度为60%的甲醇水溶液冲洗层析柱以除去色素和未吸附的杂质，再用3倍柱体积的体积浓度为80%的乙醇水溶液洗脱，分管收集洗脱液，每管5ml，并按收集顺序依次编号，分别检测其抗真菌活性，收集抑菌圈所对应管号中的组分即为吸附层析分离得到的抗真菌活性组分。层析柱的装柱体积为15ml、柱高径比为8:1，上样流速为1ml/min，洗脱流速为0.3ml/min；
（3）合并步骤2中收集的抗真菌活性组分并减压浓缩至原体积的1/2，得活性浓缩液；
（4）活性浓缩液经装填有型号为Sephadex LH20的葡聚糖凝胶的层析柱进行分子筛层析，用2倍柱体积的体积浓度为60%的乙醇水溶液洗脱，分管收集洗脱液，并按收集顺序依次编号，每管4ml，分别检测其抗真菌活性，收集抑菌圈所对应管号中的组分即为分子筛层析分离得到的抗真菌活性组分。层析柱的装柱体积为80ml，柱高径比为10:1，上样流速为0.1ml/min，洗脱流速为0.1ml/min。
实施例4
一种利迪链霉菌发酵液中抗真菌活性物质的分离纯化方法，包括如下步骤：
（1）将利迪链霉菌S.lydicus E9保藏号为CGMCC NO.3075的发酵液在5000rpm的转速下离心10min，收集上清液，检测其抗真菌活性，按比例在1L上清液中加入8g絮凝剂，搅拌混匀后在4℃静置10h，真空抽滤收集滤液，检测其抗真菌活性，所述絮凝剂是由质量比为0.6：1：1的亚铁氰化钾，硫酸锌和硼砂组成。
（2）滤液经装填有型号为Diaion HP-20的大孔树脂的层析柱进行吸附层析，用2倍柱体积的体积浓度为40%的甲醇水溶液冲洗层析柱以除去色素和未吸附的杂质，再用5倍柱体积的体积浓度为50%的乙醇水溶液洗脱，分管收集洗脱液，并按收集顺序依次编号，每管5ml，分别检测其抗真菌活性，收集抑菌圈所对应管号中的组分即为吸附层析分离得到的抗真菌活性组分。层析柱的装柱体积为25ml、柱高径比为15:1，上样流速为1.5ml/min，洗脱流速为0.6ml/min；
（3）合并步骤2中收集的抗真菌活性组分并减压浓缩至原体积的1/3，得活性浓缩液；
（4）活性浓缩液经装填有型号为Sephadex LH20的葡聚糖凝胶的层析柱进行分子筛层析，用1倍柱体积的体积浓度为60%的乙醇水溶液洗脱，分管收集洗脱液，并按收集顺序依次编号，每管4ml，分别检测其抗真菌活性，收集图中抑菌圈所对应管号中的组分即为分子筛层析分离得到的抗真菌活性组分。层析柱的装柱体积为100ml，柱高径比为20:1，上样流速为0.3ml/min，洗脱流速为0.3ml/min。
抗真菌活性检测方法采用琼脂扩散法：在PDA平皿中央接种病原真菌棉花立枯丝核菌Rhizoctonia solani的菌丝块（Φ6mm），28℃恒温培养24h，取出备用。取10ul分离纯化的样品滴加到PDA平皿的病原真菌菌丝块周围，28℃恒温培养12h，观察样品周围是否有抑菌圈出现。

Claims (7)

1.一种利迪链霉菌发酵液中抗真菌活性物质的分离纯化方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）将利迪链霉菌S.lydicus E9保藏号为CGMCC NO.3075的发酵液在4000-5000rpm的转速下离心10-20min，收集上清液，按比例在1L上清液中加入4-8g絮凝剂，搅拌均匀后在0-4℃静置10-12h，真空抽滤收集滤液；所述絮凝剂是由质量比为0.6：1：1的亚铁氰化钾，硫酸锌和硼砂组成；
（2）滤液经装填有型号为Diaion HP-20的大孔树脂的层析柱进行吸附层析，用1-2倍柱体积的体积浓度为40%-60%的甲醇水溶液冲洗所述层析柱以除去色素和未吸附的杂质，再用3-5倍柱体积的体积浓度为50%-80%的乙醇水溶液洗脱活性成分，分管收集洗脱液，检测其抗真菌活性；
（3）合并步骤（2）中收集的抗真菌活性组分并减压浓缩至原体积的1/3-1/2，得活性浓缩液；
（4）活性浓缩液经装填有型号为Sephadex LH20的葡聚糖凝胶的层析柱进行分子筛层析，用1-2倍柱体积的体积浓度为60%的乙醇水溶液洗脱，分管收集洗脱液，并按收集顺序依次编号，每管4ml，分别检测其抗真菌活性，收集抗真菌活性组分。
2.根据权利要求1所述的一种利迪链霉菌发酵液中抗真菌活性物质的分离纯化方法，其特征在于所述步骤（1）中的离心的转速为4500rpm，离心的时间为10min。
3.根据权利要求1所述的一种利迪链霉菌发酵液中抗真菌活性物质的分离纯化方法，其特征在于步骤（2）中所述甲醇水溶液的体积浓度为50%，用量为2倍柱体积。
4.根据权利要求1所述的一种利迪链霉菌发酵液中抗真菌活性物质的分离纯化方法，其特征在于步骤（2）中乙醇水溶液的体积浓度为60%，用量为5倍柱体积。
5.根据权利要求1所述的一种利迪链霉菌发酵液中抗真菌活性物质的分离纯化方法，其特征在于步骤（2）的层析柱的装柱体积为15-25ml、柱高径比为8:1-15:1，上样流速为1-1.5ml/min，洗脱流速为0.3-0.6ml/min。
6.根据权利要求1所述的一种利迪链霉菌发酵液中抗真菌活性物质的分离纯化方法，其特征在于所述步骤（3）为：合并步骤（2）中收集的抗真菌活性组分并减压浓缩至原体积的1/3，得活性浓缩液。
7.根据权利要求1所述的一种利迪链霉菌发酵液中抗真菌活性物质的分离纯化方法，其特征在于所述步骤（4）的层析柱的装柱体积为80-100ml，柱高径比为10:1-20:1，上样流速为0.1-0.3ml/min，洗脱流速为0.1-0.3ml/min。
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