CN104988182A - 一种红球菌产表面活性剂的制备方法 - Google Patents

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本发明公开一种红球菌产表面活性剂的制备方法，利用从海岸滩涂淤泥中分离筛选出的红球菌，经发酵生产生物表面活性剂。技术步骤包括菌种活化、菌种种子液培养、菌种发酵培养和生物表面活性剂制备。将红球菌菌种先接种于固体发酵培养基进行活化，然后接种于液体发酵培养基中获得种子液，再将种子液接种于液体发酵培养基中获得发酵培养液，然后将发酵培养液经酸沉淀、离心分离、有机溶剂萃取、旋转蒸发，制成具有高表面活性的生物表面活性剂成品。本发明涉及的红球菌生物表面活性剂，制备工艺简便，具有对石油很好的乳化作用，制备方法便于推广应用，有很好的市场应用潜力。

Description

一种红球菌产表面活性剂的制备方法
技术领域
本发明涉及生物表面活性剂的制备方法,特别是涉及一种红球菌产表面活性剂的制备方法。
背景技术
生物表面活性剂是表面活性剂的一种，由微生物产生，是既含有亲水基团又含有疏水基团的两亲性生物大分子物质。与化学合成的表面活性剂相比，生物表面活性剂除具有降低表面张力、稳定乳化液和增加泡沫等作用外，还具有如下特点：(1)高表面与界面活性，(2)生物降解性，(3)低毒性，(4)原材料的易获得性，(5)生产的经济性，(6)结构特异性。截止目前，已报道的可产生物表面活性剂的菌株达上百株，隶属于真菌、酵母、细菌等多个属。其来源多样，可产多种生物表面活性剂。
生物表面活性剂在石油、石化、环境管理、农药、食品、饮料、化妆品、医药、干洗、冶矿业等领域具有极大的应用潜力，它们可以被用作乳化剂、破乳剂、润湿剂与发泡剂、功能性食品配料和洗涤剂。随着消费者环保意识的提高，环境友好的生物制品越来越受到青睐。
然而在我国，生物表面活性剂还没有大规模生产，具有研究发展的空间。特别是，利用从海岸滩涂筛选的红球菌制备生物表面活性剂的方法更处于研究探讨之中。
发明内容
本发明提供一种红球菌产表面活性剂的制备方法，其目的在于利用从海岸滩涂淤泥中分离筛选出的红球菌，通过发酵培养、酸沉淀、离心分离、有机溶剂萃取、旋转蒸发，制成具有高表面活性的生物表面活性剂成品。
本发明的红球菌产表面活性剂的制备方法所采用的生产菌为红球菌SY095(Rhodococcus sp.SY095)，从海岸滩涂淤泥中分离筛选而获得，该微生物菌种己于2015年04月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.10724。保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明所述红球菌产表面活性剂的制备方法，技术步骤包括菌种活化、菌种种子液培养、菌种发酵培养和生物表面活性剂制备。
S1、菌种活化 
将红球菌菌种接种于固体发酵培养基进行活化，30℃温箱培养1d～2d。
所述固体发酵培养基：大豆油15～25g/L，尿素2～4g/L，K2HPO40.5～1.5g/L，KH2PO40.5～1g/L，MgSO4·7H2O 0.25～0.75g/L，pH 7.0～8.0，1.5％琼脂，121℃灭菌30min。
S2、菌种种子液培养
将步骤S1活化后的红球菌菌种接种于500mL液体发酵培养基中，在30℃±3℃、摇床转速160rpm～200rpm条件下培养1d～2d，获得种子液。
所述液体发酵培养基：大豆油15～25g/L，尿素2～4g/L，K2HPO40.5～1.5g/L，KH2PO40.5～1g/L，MgSO4·7H2O 0.25～0.75g/L，pH 7.0～8.0，121℃灭菌30min。
S3、菌种发酵培养
将步骤S2培养的种子液接种于发酵罐的50L液体发酵培养基中，在30±3℃、搅拌速度120rpm～180rpm，溶氧25％～35％条件下培养10h～36h，获得发酵培养液。
S4、生物表面活性剂制备
将S3步骤获得的发酵培养液经酸沉淀、离心分离、有机溶剂萃取、旋转蒸发获得生物表面活性剂成品。具体步骤为：
步骤S3发酵停止后，下罐，用HCl(5N)调节发酵培养液pH值至2±0.5pH，室温静置4～24h；撇取浮于发酵培养液表面的膏状物，在4℃～8℃、转速10000rpm～15000rpm条件下高速离心分离，去除多余水分；然后，将膏状物使用有机溶剂氯仿/甲醇(1:1)溶液萃取，70℃～90℃，转速60rpm～100rpm旋转蒸发干燥，获得生物表面活性剂成品。
本发明利用红球菌制备的生物表面活性剂，对石油具有良好的乳化作用，工艺简便，便于应用推广。
附图说明
图1为本发明所述红球菌产表面活性剂的制备方法的流程简图。图中标记说明：
S1、菌种活化 
S2、菌种种子液培养
S3、菌种发酵培养
S4、生物表面活性剂制备
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。
实施例1、配制发酵培养基
发酵培养基为无机盐培养基。
配制液体发酵培养基60L：尿素150g，K2HPO460g，KH2PO445g，MgSO4·7H2O 30g，加自来水定容至60L，调节pH至7.0，加入大豆油1200g，121℃灭菌30min。
配制固体发酵培养基100mL：尿素0.25g，K2HPO40.1g，KH2PO40.075g，MgSO4·7H2O 0.05g，加蒸馏水定容至100mL，调节pH至7.0，加入大豆油2g，121℃灭菌30min。
实施例2、菌种发酵培养
将红球菌单菌落先接种于固体培养基斜面，30℃温箱培养1d，然后用接种针挑取单菌落接种于500mL液体发酵培养基中，在30℃、摇床转速160rpm条件下培养1d，获得种子液；将种子液全部接种于50L液体发酵培养基中，在30℃、搅拌速度160rpm，通气量30slpm(保证溶氧30％)条件下培养24h，获得发酵培养液。
实施例3、制备生物表面活性剂成品
发酵停止后，下罐，用HCl(5N)调节发酵培养液pH值为2，室温静置6h；撇取浮于发酵培养液表面的膏状物，4℃、转速15000rpm条件下，高速离心，去除多余水分；将膏状物使用氯仿/甲醇(1:1)溶液抽提，70℃，转速80rpm旋转蒸发干燥获得生物表面活性剂成品1.128kg。
实施例4、表面活性检测
表面活性初步检测采用排油圈法。
取直径10cm的培养皿，加入15mL蒸馏水，再取5mL液体石蜡倒于蒸馏水表面，液体石蜡在水面上形成稳定的油膜。吸取500μL样品滴在油膜中央，观察记录不同菌株的发酵液排油圈大小。
表面活性精确检测采用铂金板法，利用全自动表面/界面张力仪A101实现。
表面活性检测结果：排油圈达到6cm，通过仪器测量表面张力为28mN/m。所获得的生物表面活性剂成品的活性比常规生物表面活性剂活性提高10％。

Claims (8)

1.一种红球菌产表面活性剂的制备方法，其特征在于：其操作步骤包括菌种活化(S1)、菌种种子液培养(S2)、菌种发酵培养(S3)和生物表面活性剂制备(S4)；菌种活化(S1)是将从海岸滩涂淤泥中分离筛选而获得红球菌SY095接种于固体发酵培养基进行活化，菌种种子液培养(S2)是将S1步骤活化后的红球菌菌种接种于液体发酵培养基中获得种子液，菌种发酵培养(S3)是将S2步骤培养的种子液接种于液体发酵培养基中获得发酵培养液，生物表面活性剂制备(S4)是将S3步骤获得的发酵培养液经酸沉淀、离心分离、有机溶剂萃取、旋转蒸发获得生物表面活性剂成品。
2.根据权利要求1所述的一种红球菌产表面活性剂的制备方法，其特征在于，所述红球菌的菌种为红球菌SY095(Rhodococcus sp.SY095)，从海岸滩涂淤泥中分离筛选而获得，己于2015年04月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCCNo.10724。
3.根据权利要求1所述的一种红球菌产表面活性剂的制备方法，其特征在于，所述液体发酵培养基：大豆油15～25g/L，尿素2～4g/L，K2HPO4 0.5～1.5g/L，KH2PO4 0.5～1g/L，MgSO4·7H2O 0.25～0.75g/L，pH 7.0～8.0，121℃灭菌30min。
4.根据权利要求1所述的一种红球菌产表面活性剂的制备方法，其特征在于，所述固体发酵培养基成分为：大豆油15～25g/L，尿素2～4g/L，K2HPO40.5～1.5g/L，KH2PO4 0.5～1g/L，MgSO4·7H2O 0.25～0.75g/L，pH 7.0～8.0，1.5％琼脂，121℃灭菌30min。
5.根据权利要求1所述的一种红球菌产表面活性剂的制备方法，其特征在于，所述菌种活化(S1)是将红球菌菌种接种于固体发酵培养基进行活化，30℃温箱培养1d～2d。
6.根据权利要求1所述的一种红球菌产表面活性剂的制备方法，其特征在于，所述菌种种子液培养(S2)是将步骤S 1活化后的红球菌菌种接种于500mL液体发酵培养基中，在30℃±3℃、摇床转速160rpm～200rpm条件下培养1d～2d，获得菌种种子液。
7.根据权利要求1所述的一种红球菌产表面活性剂的制备方法，其特征在于，所述菌种发酵培养(S3)是将步骤S2获得的菌种种子液接种于50L液体发酵培养基中，在30±3℃、搅拌速度120rpm～180rpm，溶氧25％～35％条件下培养10h～36h，获得发酵培养液。
8.根据权利要求1所述的一种红球菌产表面活性剂的制备方法，其特征在于，所述生物表面活性剂制备(S4)是在步骤S3发酵停止后，下罐，用HCl(5N)调节发酵培养液pH值至2±0.5pH，室温静置4～24h后撇取浮于发酵培养液表面的膏状物，在4℃～8℃、转速10000rpm～15000rpm条件下高速离心，去除多余水分；然后，将膏状物使用氯仿/甲醇(1:1)溶液抽提，70℃～90℃，转速60rpm～100rpm旋转蒸发干燥，获得生物表面活性剂成品。
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