CN104988156A - p53R175H特异性核酸适配体及其筛选方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公布了一种特异性结合p53突变体蛋白p53R175H的核酸适配体，所述核酸适配体包含如SEQ ID NO.1所示的序列。本发明还公开了所述核酸适配体的衍生物以及所述核酸适配体的筛选方法及其在肿瘤治疗中的用途。

Description

p53R175H特异性核酸适配体及其筛选方法和用途

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体地，涉及一种RNA适配体的筛选及应用，尤其涉及突变蛋白的特异RNA适配体筛选方法和应用。

背景技术

p53蛋白是已知的重要肿瘤抑制蛋白。p53蛋白存在有多个功能结构域，在p53蛋白中间的核心区域，约为100-300位氨基酸处，有DNA结合结构域。这个结构域依据序列特异性结合实现DNA与之结合。这个结构域被认为是实现p53功能最重要的结构域，因为之后的研究进一步证实，多数与p53突变相关的肿瘤均是由于p53在这个核心结构域中发生无义突变所致，而有超过一半的人类肿瘤与p53蛋白的突变有关。随着测序技术的发展，在所有已知的人类癌症中的p53的突变种类就超过了10000个。其中的95％以上的突变是发生在上述的DNA结合结构域中。75％的突变是单个位点无义突变，而不是缺失、插入或者是移位。所以我们一般认为在大多数的癌症中，p53主要是在核心结构域中以单个位点突变的形式而存在。

p53的突变体p53R175H已知在小鼠胚胎成纤维(MEF)细胞和胸腺细胞中不行使p53野生型蛋白的功能，并且在肺癌细胞中存在抗凋亡的获得性功能。同时，p53R175H比其他的任何一种p53蛋白的突变体具有更强的细胞群落形成能力，且发现在前列腺细胞中的迁移能力也得到进一步加强。在临床研究当中，因为p53R175H突变而造成的癌症患者中，其临床治疗效果也是最不理想的。

目前对于p53突变蛋白的治疗手段有限，效果较差。并且药物用量高，毒副作用大。而解决方法除了开发新药外，靶向治疗成为了最主要的方法。此外，对于治疗后复发的病人，目前缺乏有效的靶向诊断措施，难以判断肿瘤复发的部位和位置，使临床医生选择合理的治疗方案非常困难。目前，缺乏高度特异的靶向介质，是制约针对p53蛋白突变的靶向诊断和治疗发展的瓶颈。

核酸适配体，是与抗体功能类似的单链寡核苷酸分子，可特异性识别包括金属离子、有机小分子、多肽、蛋白质、细胞等多种靶标。它具有亲和力与抗体相当甚至更高、分子量小、无免疫原性、合成方便且批次差异小、化学性质稳定等优点。因此核酸适配体在生物监测、疾病诊断和靶向治疗方面具有广阔的前景。目前，世界上尚无能够特异性针对突变蛋白的特异RNA适配体的报道。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种具有高度特异性，分子量小，化学性质稳定，易于保存和标记的可用于识别突变蛋白的核酸适配体及其衍生物。本发明还相应地提供所述核酸适配体的筛选方法与应用。

为了解决上述技术问题，一方面，本发明提供了一种核酸适配体(在本文中也被称为p53R175H-APT)，所述核酸适配体的核苷酸序列包含以下RNA序列：

5’-GCAAUGGUACGGUACUUCCAUUAGCGCAUUUUAACAUAGGGUGCCAAAAGUGCACGCUACUUUG-3’(SEQ ID NO.1)

在本发明的另一个方面中，作为对上述技术方案的改进，可选择地，对上述核酸适配体的核苷酸序列上的某一位置进行磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化。

在本发明的另一个方面中，作为对上述技术方案的改进，可选择地，在上述核酸适配体的核苷酸序列上连接荧光物质，放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料或酶标记。

以上所述的经部分取代或经过修饰后的所述核苷酸序列，都具有原核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能，都可应用于识别p53R175H蛋白并部分回复其野生型功能。

作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列包括以下三种序列中的任意一种：

(1)与前述所有技术方案中所述核酸适配体的核苷酸序列的同源性在60％以上的序列(例如可将前述核酸适配体序列删除或增加部分互补的核苷酸)；

(2)与前述所有技术方案中所述核酸适配体的核苷酸序列能够进行杂交的序列；

(3)由前述所有技术方案中所述核酸适配体的核苷酸序列反转录的DNA序列。

作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种核酸适配体衍生物，所述衍生物是前述所有技术方案中所述核酸适配体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架，或者是前述所有技术方案中所述核酸适配体改造成的相应肽核酸。

以上不论是衍生出的核酸适配体还是衍生出的其他衍生物，都具有原核酸适配体基本相同或类似的分子结构，理化性质和功能，即都可应用于识别p53R175H蛋白并部分回复其野生型功能。

另一方面，本发明还提供了一种如前述核酸适配体的筛选方法，包括以下骤：

(1)合成以下序列所示的随机单链DNA文库和引物：

随机单链DNA文库：TAATACGACTCACTATAGCAATGGTACGGTACTTCC(N25)CAAAAGTGCACGCTACTTTG

5’端引物：5’-TAATACGACTCACTATAGCAATGGTACGGTACTTCC(SEQ ID NO.2)

3’端引物：5’-CAAAGTAGCGTGCACTTTTG(SEQ ID NO.3)

(2)体外转录：以单链DNA文库为模板，进行PCR扩增制备体外转录模板。将以上PCR产物投入体外转录体系中，经过一段时间孵育，纯化步骤，得到用于筛选的RNA适配体文库；

(3)固相偶联蛋白：将p53野生型蛋白偶联在NHS活化的琼脂糖珠子上。将p53R175H蛋白偶联在NHS活化的磁珠上，用于下步差别竞争SELEX筛选步骤；

(4)差别竞争SELEX筛选：将步骤(3)中得到的偶联有特定蛋白的珠子加入步骤(2)中得到的RNA适配体文库，经过37℃2小时孵育，通过磁性分离只保留磁珠，并将依旧结合在磁珠上的RNA适配体纯化、反转录，制备下一轮差别竞争SELEX筛选的文库；

(5)多轮筛选：将步骤4中得到的文库替代步骤(1)中的随机文库，并重复上述步骤(2)～(4)的过程；每一轮筛选后通过ELISA方法检测文库分子对p53R175H结合能力，直至出现与靶标分子有高亲和力的RNA适配体后，将所得RNA适配体投入下游功能研究。

第三方面，本发明还提供了一种前述核酸适配体或者核酸适配体衍生物在制备检测含有p53R175H的肿瘤的试剂盒、分子探针或靶向介质中的应用。

第四方面，本发明还提供了一种前述核酸适配体或者核酸适配体衍生物在设计和制备治疗含有p53R175H的肿瘤的药物中的用途

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明的筛选方法可以用于筛选突变蛋白特异的核酸适配体。将蛋白野生型与突变型分别偶联于不同的固相介质，让两种蛋白竞争性地与文库中适配体结合，在结合过程中使得野生型与突变型的差别得以放大，进而筛选出与突变蛋白亲和力更强的核酸适配体。本方法解决了微小差异靶标特异性低的问题，避免了单一筛选方法带来的非特异性结合的不断积累，筛选效率更高；通过筛选得到的核酸适配体具有比蛋白抗体更高的亲和力与特异性且能够合成，分子量小，可以对不同部位进行修饰和取代，且更稳定，易于保存。

采用本发明的核酸适配体经实验验证，其对含有p53野生型的细胞无亲和力，对p53R175H有较高亲和力，并可以通过与靶标的结合，部分回复p53野生型功能，降低p53R175H细胞的生长速率、促进凋亡、减慢迁移速率，具有一定的治疗效果。

更具体地，本发明提供以下各项：

1.特异性结合p53突变体蛋白p53R175H的核酸适配体，所述核酸适配体包含如SEQ ID NO.1所示的序列。

2.根据1所述的核酸适配体，其在SEQ ID NO.1的某一位置处被修饰，如磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化。

3.根据1所述的核酸适配体，其还连接有荧光标记物、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料或酶标记。

4.核酸适配体，其包含以下三种序列中的任意一种：

(1)与根据1-3中任一项所述的核酸适配体的序列的序列同源性在60％以上的序列；

(2)能够与根据1-3中任一项所述的核酸适配体的序列进行杂交的序列；或

(3)由根据1-3中任一项所述的核酸适配体的序列反转录的序列。

5.根据1-3中任一项所述的核酸适配体的衍生物，所述衍生物具有由根据1-3中任一项所述的核酸适配体的序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架，或者是由根据1-3中任一项所述的核酸适配体改造成的相应的肽核酸。

6.用于筛选特异性结合p53突变体蛋白p53R175H的核酸适配体的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)提供随机单链DNA文库，所述DNA文库包含由下式表示的随机单链DNA：TAATACGACTCACTATA GCAATGGTACGGTACTTCC(N25)CAAAAGTGCACGCTACTTTG，其中N25表示中间的25个氨基酸的随机序列，并且提供如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的一对引物；

(2)以所述DNA文库为模板，使用上述引物进行PCR扩增，以所述PCR的产物作为体外转录模板进行体外转录，从而获得用于筛选的RNA适配体文库；

(3)将野生型p53蛋白偶联在NHS活化的琼脂糖珠子上，并且将突变体蛋白p53R175H偶联在NHS活化的磁珠上；

(4)将步骤(3)中得到的偶联有p53的珠子和偶联有p53R175H的磁珠加入步骤(2)中得到的RNA适配体文库中进行孵育，孵育后对磁珠进行磁性分离，对结合在所述磁珠上的RNA适配体进行纯化和反转录以制备用于进一步筛选的DNA文库；

(5)用步骤(4)中得到的DNA文库代替步骤(1)中的文库来作为步骤(2)中的模板，并重复步骤(2)至(4)，在每一轮筛选后比较所筛选到的RNA适配体与p53和p53R175H的结合能力，直至获得特异性结合p53R175H的RNA适配体。

7.根据6所述的方法，其中使用ELISA方法来比较所筛选到的RNA适配体对p53和p53R175H的结合能力。

8.根据1-4中任一项所述的核酸适配体，或根据5所述的核酸适配体的衍生物，在制备用于结合p53R175H蛋白的试剂中的用途。

9.根据1-4中任一项所述的核酸适配体，或根据5所述的核酸适配体的衍生物，在制备药物中的用途，所述药物用于治疗由p53突变体p53R175H引起的肿瘤。

附图说明

图1显示本发明实施例的筛选流程图。

图2显示本发明实施例的亲和力筛选流程及检测情况

图3显示本发明实施例筛选得到的核酸适配体与p53野生型的亲和力。

图4显示本发明实施例筛选得到的核酸适配体与p53R175H的亲和力以及对细胞的影响。

图5显示本发明实施例筛选得到的核酸适配体在裸鼠体内降低肿瘤生长速率。

具体实施方式

提供以下实施例以便更好地理解本发明，而非限制本发明。以下实例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买所得。

以下实施例中使用到以下细胞：HEK293T(CRL-3216^TM)，NCI-H1299(CRL-5803^TM)。

本发明利用核酸适配体的体外筛选技术SELEX技术，以p53R175H为靶标，同时加入p53野生型蛋白竞争筛选，从体外合成的随机寡聚RNA文库中筛选出与所述细胞株特异结合的核酸适配体。

本发明中，所述的核酸适配体序列可选自天然存在或人工合成的序列，或任何其他来源的同样的序列。

本发明中，所述的核酸适配体序列含有与所述特征序列的核苷酸的全部都相同的序列。

本发明中，可以对核酸适配体进行修饰或改造，得到所述核酸适配体的衍生物，所述核酸适配体的衍生物可为：

a)将所述核酸适配体删除部分或增加部分互补的核苷酸，得到的与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；

b)将所述核酸适配体进行核苷酸取代或部分修饰，得到的与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体衍生物；

c)将所述核酸适配体的骨架改造为硫代磷酸酯骨架，得到的与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体衍生物；

d)将核酸适配体改造为肽核酸，得到的与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；

e)将上述核酸适配体连接上荧光物质、放射性物质、治疗性物质、生物素、酶标记等物质后，得到的与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体衍生物。

本发明所述序列的靶标在H1299细胞中不表达，本例使用的是H1299-p53R175H稳转细胞系。

实施例

实施例1、核酸适配体的筛选

1.随机核酸文库的设计与合成

设计合成如下所示单链DNA，其中间包括25个核苷酸的随机序列，其组成核酸序列文库

TAATACGACTCACTATA GCAATGGTACGGTACTTCC(N25)CAAAAGTGCACGCTACTTTG

2.蛋白偶联固相载体

2.1.将p53R175H蛋白(Cat.No.AZ-026Abzyme，氨基酸序列如SEQID NO.4所示)偶联到NHS活化的磁珠(28-9940-09 GE Healthcare)上。

将适量磁珠从原管中放入新的EP管中，置于磁力架上，移走原来的储存液；

加上500μl冰预冷的平衡液(1mM HCl(冰冷的))，混匀，移走平衡液；

平衡后马上加入10μg蛋白，在结合缓冲液(0.2M NaHCO₃,0.5MNaCl,pH 8.3)环境中重悬磁珠，在垂直混合仪上孵育15分钟；

置于磁力架上，移除上清液，进入到清洗封闭步骤；

加500μl封闭缓冲液A(0.5M乙醇胺,0.5M NaCl,pH 8.3)，移除上清；

加500μl封闭缓冲液B(0.1M乙酸钠,0.5M NaCl,pH 4.0)，移除上清；

加500μl封闭缓冲液A，垂直混合孵育15分钟；

加500μl封闭缓冲液B，移除上清；

加500μl封闭缓冲液A，移除上清；

加500μl封闭缓冲液B，移除上清；

加500μl结合缓冲液(50mM Tris,150mM NaCl,pH 7.5)，并放于4℃保存。

2.2.p53野生型蛋白(Cat.No.AZ-025，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示)偶联到NHS活化的琼脂糖珠子(Cat.No.SF024-NHS,Sangon)上。

将适量磁珠从原管中转移到新的EP管中，1000g离心1分钟，移走原来的储存液；

加500μl纯水，1000g离心1分钟，移除上清；

加500μl结合/洗涤缓冲液(0.1M Sodium Phosphate,0.15M NaCl,pH7.2(PBS))，1000g离心1分钟，移除上清；

加蛋白溶液(10ug)，垂直混合仪上室温孵育1h；

1000g离心1分钟，移除上清；

1ml结合/洗涤缓冲液清洗，1000g离心1分钟，移除上清；

重复f；

加500μl封闭缓冲液(1M乙醇胺，pH7.4)，垂直混合仪上孵育15-20分钟；

1000g离心1分钟，移除上清；

1ml上述结合/洗涤缓冲液清洗，1000g离心1分钟，移除上清；

将蛋白最终重悬在500μl SHMCK缓冲液(20mM HEPES pH7.35,120mM NaCl,5mM KCl,1mM CaCl₂,1mM MgCl₂)里，放于4℃保存。

3.体外转录RNA

a.以合成的初始DNA库为模板，加入到如下PCR体系中：

反应程序为：

98℃预变性5分钟，98℃变性30s，55℃退火3s，72℃延伸10s，共25个循环，72℃10分钟，4℃终止反应。

b.跑胶验证产物纯度

配置12％Native PAGE胶

取出5ul PCR产物，加上1ul 6×上样缓冲液，上样，200V稳压跑胶。

c.以PCR产物为模板，进入到如下体外转录体系：

37℃8h孵育。

d.往体外转录体系中加入2μl DNaseI以移除DNA模板。

e.往体外转录体系中，加入15μl 3M NaAc pH5.2，115μl无RNA酶纯水，混匀。

f.加入等量体积的酚氯仿溶液，充分震荡混合，12000rpm离心1分钟，取上清并转移到另一个干净的EP管中。

g.加入等体积氯仿，充分震荡混合，12000rpm离心1分钟，取上清并转移到另一个干净的EP管中。

h.加入2倍体积冰乙醇，-80℃静置至少30分钟。

i.4℃12000rpm离心15分钟，弃上清。

j.加入1ml 75％乙醇清洗，4℃12000rpm离心10分钟，弃上清。

k.室温充分晾干，50μl无RNA酶纯水溶解，测定浓度，-80℃保存。

4.竞争性筛选

将偶联有p53野生型的琼脂糖珠子和偶联有p53R175H的磁珠各取出1μg，用SHMCK缓冲液(20mM HEPES pH7.35,120mM NaCl,5mM KCl,1mM CaCl₂,1mM MgCl₂)清洗一次，之后同时投入到上述体外转录的RNA库(1μg)中进行孵育，总孵育体系500μl，37℃震荡孵育。当经过了2个小时的震荡孵育后，通过磁力架将偶联有p53R175H的磁珠单独保留下来，加入1ml TRIzol RNA抽提试剂(Ambion)进行磁珠上RNA抽提。

5.TRIzol法RNA抽提

a.向得到的磁珠中加入1ml TRIzol，室温静置5分钟，使得介质均一化；

b.加入200μl氯仿，手中剧烈震荡15s，之后室温静置2-3分钟；

c.4℃12000g离心15分钟；

d.将上层水相转移到另一个干净的空管中，加入500μl 100％的异丙醇，室温放置10分钟；

e.4℃12000g离心10分钟；

f.弃上清，用75％乙醇洗涤，4℃7500g离心5分钟；

g.弃上清，在室温中晾干，20μl DEPC处理过的水溶解，进入反转录程序。

6.反转录

a.预变性体系与预变性

RNA                           500ng-1μg

GSP(基因特异引物)(0.5μg/反应) 1μl

无核酸酶的水                  加至10μl

70℃5分钟，完成后马上置于冰上。

b.反转录体系与反转录

25℃5分钟；42℃60分钟；70℃15分钟；4℃∞。

7.PCR扩增下一轮RNA库的模版

以上述得到的cDNA作为模板，加入到如下PCR体系中：

反应程序为：

98℃预变性5分钟，98℃变性30s，55℃退火3s，72℃延伸10s，共25个循环，72℃10分钟，4℃终止反应。

8.多轮筛选

将步骤7所得到的特异核酸适配体单链文库替代步骤3中DNA文库，继续重复上述步骤2～7的操作过程。经过5轮筛选，在每轮筛选后，通过本领域技术人员所熟知的用于检测核酸适配体与靶蛋白结合能力的测定方法(例如实施例2中所述的基于ELISA的亲和力测定方法)对在本轮随机选取的序列进行亲和力测定，最终筛选得到具有如SEQ ID NO.1所示的序列的核酸适配体。相对于p53野生型，所述序列的核酸适配体对于p53R175H的亲和力更高(近一个数量级差异)。

所述筛选方法中，可逐轮增加筛选压力，以增进筛选核酸适配体的富集程度。所述增加筛选压力包括线性减少投入RNA量、靶标的用量和两者的孵育时间。

实施例2、基于ELISA的亲和力筛选方法

本领域技术人员将理解核酸适配体与靶蛋白的结合能力可以通过不同于ELISA方法的其他方法检测。

1.T载体构建与蓝白斑筛选

a.按以下体系配置T载体连接体系：

b.将连接产物转化入感受态细胞中；

c.在具有氨苄抗性的LB板中，事先涂上100ul IPTG和200ul X-Gal，放于37℃培养箱晾干。再将低速培养过的感受态细胞均匀涂抹至板上，37℃培养12-16小时；

d.次日挑取白色克隆，培养细菌并送测序；

e.对测序成功的样本抽取质粒，用作下一步体外转录模板。

2.体外转录带有生物素标记的RNA

a.使用AmpliScribe^TMT7-Flash^TMBiotin-RNA Transcription试剂盒(Epicentre)，按如下配方进行体外转录；

37℃1小时

b.加入1μl(1MBU)DNaseI消化DNA模板，37℃30分钟。

3.酚氯仿抽提RNA

a.加入80μl无RNA酶纯水到以上体外转录体系；

b.加入同等体积的酚氯仿溶液，振荡15秒，4℃12000rpm离心5分钟，将上清取到另一只管中；

c.加入同等体积的氯仿溶液，振荡15秒，4℃12000rpm离心5分钟，将上清取到另一只管中；

d.加入两倍体积冰乙醇和10％体积的3M醋酸钠，-80℃静置30分钟以上；

e.4℃12000rpm离心15分钟，弃上清，保留沉淀；

f.加入1ml 75％乙醇清洗，4℃12000rpm离心5分钟，弃上清，置于室温晾干；

g.加入50μl无RNA酶纯水溶解RNA沉淀，测量浓度，用于下步亲和力测试。

4.ELISA亲和力测试(图2a)

a.在0.05M的碳酸钠溶液中配制p53和p53R175H蛋白溶液(1-10μg/ml不等，根据蛋白性质)；

b.每个小孔中加入0.1μg上述蛋白溶液，用封口膜封住盖子，室温震荡孵育2h或4℃过夜；

c.用PBST溶液洗涤小孔3次，最后一次将96孔板倒置在吸水纸上，以控干液体；

d.加入200μl封闭液(0.5％BSA，PBST溶解)，室温孵育1h或4℃过夜；

e.再用PBST清洗小孔三次；

f.加入体外转录的带有生物素标记的RNA，室温震荡孵育1小时；

g.PBST(NaCl 8g，KCl 0.2g，KH₂PO4 0.24g，Na₂HPO₄.12H₂O 2.9g，加水到1L体系，pH7.4)清洗小孔三次；

h.加上稀释过的AP标记的链霉亲和素100μl。用封口膜将盖子封闭，室温震荡1h；

i.再次用洗涤缓冲液洗涤非特异背景；

j.马上加入100μl底物(1mg/ml对硝基苯磷酸二钠)，避光孵育30分钟；

k.向每个孔中加入100μl 3M NaOH以终止反应。在酶标仪中读取405nm时的光吸收。

如图所示，在对第三轮和第四轮进行的亲和力测试中，相对于对p53野生型的亲和力，暂未发现有对p53R175H蛋白更具亲和力的候选适配体(图2b)。但在第五轮结束后进行的亲和力测试中，第3号候选适配体对p53R175H的亲和力是对p53野生型的近10倍(图2c)。故选定其进行后续研究，第3号候选适配体的核酸序列为SEQ ID NO.1。

实施例3、筛选得到的核酸适配体对p53野生型蛋白无亲和力

1.p53免疫共沉淀实验

a.将HEK293T细胞铺在10cm细胞培养板中，5％CO2环境下37℃培养12-18h，待到细胞密度达到60-70％时利用LipofectAmine 2000体系分别转染通过实施例1筛选到的序列如SEQ ID NO.1所示的核酸适配体(p53R175H-APT)和scramble(其为随机负对照序列GCAATGGTACGGTACTTCCGCCTGGCTGGTCTTTGAACTCTTTTCAAAAGTGCACGCTACTTTG)，继续培养，直到转染后48小时后开始后续实验；

b.细胞交联反应：向细胞培养皿中滴加终浓度为0.75％的甲醇，室温温和震荡10分钟；

c.加入终浓度为125mM的甘氨酸溶液，室温条件下温和震荡5分钟，以终止交联反应；

d.向细胞板中加入终裂解液(冰预冷)的60％的体积将细胞洗下，再加入剩余的40％体积从后到前洗涤细胞板，使之充分收集细胞。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触，裂解缓冲液RIPA：50mM Tris-Cl[pH 8.0]，150mM NaCl，5mM EDTA，1％NP-40，0.1％SDS(EDTA用NaOH溶解)；

e.4℃在垂直混合仪中裂解10分钟，将EP管放于冰上，利用超声破碎仪对细胞进行超声破碎，超声程序为：超声3s，停6s，功率30％，时间5分钟，4℃离心15分钟，将细胞破碎上清转移到另一个EP管中；

f.准备磁珠：取出一定量Dynabeads Protein G(Invitrogen)于EP管中。置于磁力支架上，吸去保存液，将抗体与Protein G磁珠偶联，将3μg左右p53抗体(cat#2524S，Cell Signaling Technology)稀释到200μl含有0.02％Tween-20的PBS中，加入到准备好的磁珠中，在室温条件下孵育1h左右，之后置于磁力支架上，吸取上清，用裂解缓冲液(RIPA)洗涤3次(1ml/次)；

g.将步骤e得到的上清与步骤f覆盖有抗体的Protein G磁珠在室温条件下旋转孵育2h，弃上清，用裂解缓冲液冲洗3次用提高盐离子浓度到250mM NaCl的RIPA缓冲液清洗，收集beads；

h.加入1ml TRIzol RNA提取试剂进行RNA抽提纯化。

2.TRIzol法RNA抽提

a.向得到的磁珠中加入1ml TRIzol，室温静置5分钟，使得介质均一化；

b.加入200μl氯仿，手中剧烈震荡15s，之后室温静置2-3分钟；

c.4℃12000g离心15分钟；

d.将上层水相转移到另一个干净的空管中，加入500μl 100％的异丙醇，室温放置10分钟；

e.4℃12000g离心10分钟；

f.弃上清，用75％乙醇洗涤，4℃7500g离心5分钟；

g.弃上清，在室温中晾干，20μl DEPC处理过的水溶解，进入反转录程序。

3.反转录

a.预变性体系与预变性

RNA                           500ng-1μg

GSP(基因特异引物)(0.5μg/反应) 1μl

无核酸酶的水                  加至10μl

70℃5分钟，完成后马上置于冰上。

b.反转录体系与反转录

25℃5分钟；42℃60分钟；70℃15分钟；4℃∞。

得到cDNA产物

4.实时荧光定量PCR

按照以下体系加入

将以上体系溶液按每孔15ul的量加入到三个孔中。将整个反应板放于PikoReal实时定量PCR检测系统(Thermo Scientific)中。按以下程序进行实时荧光定量PCR

其中，变性与退火/延伸这两步共进行40个循环。

对PCR数据进行分析。

实验结果表明(见图3)，在含有p53野生型的细胞系HEK293T细胞中，p53R175H-APT对于p53野生型的亲和力相比于scramble RNA并无显著差别。7SL为对照组。

实施例4、筛选得到的核酸适配体对p53R175H有亲和力

1.质粒构建

将p53R175H编码序列克隆入pIRES2-ZsGreen1中的EcoRI和BamHI两个酶切位点中，使用如下引物，

正向引物：GGGAATTCCACTGCCATGGAGGAGCCGCA

反向引物：GGGGATCCGAGAATGTCAGTCTGAGTCAG

构建好的质粒命名为pIRES2-ZsGreen1-p53R175H

将通过实施例1筛选到的序列如SEQ ID NO.1所示的核酸适配体(本发明的核酸适配体，p53R175H-APT)和scramble序列克隆入pLKO.1中AgeI和EcoRI两个酶切位点中，使用如下引物，

正向引物：GCACCGGTGCAATGGTACGGTACTTC

反向引物：CCTTAAGGTTTTTTCAAAGTAGCG

构建的质粒分别被命名为pLKO-p53R175H-APT和pLKO-scramble。

2.p53R175H稳转细胞系的建立

向H1299细胞(p53部分缺失细胞株)转染构建好的pIRES2-ZsGreen1-p53R175H质粒。用G418(400μg/ml)对其进行筛选。具有绿色荧光的细胞(群落)被挑选出来在24孔板里单独培养。随后进行扩大培养。筛选后得到的稳转细胞系命名为H1299-p53R175H。

3.MTT细胞增殖检测实验(图4a)

本方法所用MTT试剂盒为凯基MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(Cat.No.KGA312)，具体过程如下：

a.在96孔板加入H1299-p53R175H细胞100μL/孔(约1×10⁴)，置37℃5％CO₂细胞培养箱培养24小时；

b.将pLKO-p53R175H-APT和pLKO-scramble质粒分别转染进小孔里，在37℃，含5％CO2空气及100％湿度的细胞培养箱中孵育48h；

c.将5×MTT用Dilution Buffer稀释成1×MTT。每孔加50μL 1×MTT，在37℃孵育4小时，使MTT还原为甲月赞；

d.吸出上清液，每孔加150μL DMSO使甲月赞溶解，用平板摇床摇匀；

e.酶标仪在550nm波长处检测每孔的光密度。

通过对存活细胞数量的检测，结果表明，筛选出的本发明的核酸适配体能够显著降低含有p53R175H的细胞生长速率。

4.Annexin V-FITC_PI细胞凋亡检测实验(图4b)

本方法所用试剂盒为Vazyme公司的Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(Cat.No.A211-02)。

a.将已经处理过的细胞(H1299-p53R175H)用不含EDTA的胰酶消化后300g,4℃离心5分钟收集细胞。胰酶消化时间不宜过长，以防引起假阳性。

b.用预冷的PBS洗涤细胞两次，每次均在300g,4℃离心5分钟。收集1～5×10⁵细胞。

c.加入100μl 1×Binding Buffer重悬细胞。

d.加入5μl Annexin V-FITC和5μl PI Staining Solution，轻轻混匀。

e.避光、室温反应10分钟。

f.加入200μl 1×Binding Buffer(试剂盒自带)，轻轻混匀。样品在1小时内用流式细胞仪或荧光显微镜检测。

通过对凋亡细胞数量的检测，结果表明，筛选出的核酸适配体能够显著促进含有p53R175H的细胞凋亡。

4.p53免疫共沉淀实验

a.将H1299-p53R175H细胞(实施例4步骤2中获得的)铺在10cm细胞培养板中，5％CO₂环境下37℃培养12-18h，待到细胞密度达到60-70％时利用LipofectAmine 2000体系分别转染p53R175H-APT和scramble，继续培养，直到转染后48小时后开始后续实验

b.细胞交联反应向细胞培养皿中滴加终浓度为0.75％的甲醇，室温温和震荡10分钟

c.加入终浓度为125mM的甘氨酸溶液，室温条件下温和震荡5分钟，以终止交联反应

d.向细胞板中加入终裂解液(冰预冷)的60％的体积将细胞洗下，再加入剩余的40％体积从后到前洗涤细胞板，使之充分收集细胞。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触，裂解缓冲液RIPA：50mM Tris-Cl[pH 8.0]，150mM NaCl，5mM EDTA，1％NP-40，0.1％SDS(EDTA用NaOH溶解)；

e.4℃在垂直混合仪中裂解10分钟，

将EP管放于冰上，利用超声破碎仪对细胞进行超声破碎，超声程序为：超声3s，停6s，功率30％，时间5分钟，4℃离心15分钟，将细胞破碎上清转移到另一个EP管中；

f.准备磁珠。取出一定量Dynabeads Protein G(Invitrogen)于EP管中。置于磁力支架上，吸去保存液，

抗体与Protein G磁珠偶联将3μg左右p53抗体(cat#2524S，CellSignaling Technology)稀释到200μl含有0.02％Tween-20的PBS中，加入到步骤6中准备好的磁珠，在室温条件下孵育1h左右，之后置于磁力支架上，吸取上清，用裂解缓冲液(RIPA)洗涤3次(1ml/次)，

g.将步骤5得到的上清与此步骤7覆盖有抗体的Protein G磁珠在室温条件下旋转孵育2h，弃上清，用裂解缓冲液冲洗3次用提高盐离子浓度到250mM NaCl的RIPA缓冲液清洗，收集磁珠

h.加入1ml TRIzol RNA提取试剂进行RNA抽提纯化

5.TRIzol法RNA抽提

a.向得到的磁珠中加入1ml TRIzol，室温静置5分钟，使得介质均一化；

b.加入200μl氯仿，手中剧烈震荡15s，之后室温静置2-3分钟；

c.4℃12000g离心15分钟；

d.将上层水相转移到另一个干净的空管中，加入500μl 100％的异丙醇，室温放置10分钟；

e.4℃12000g离心10分钟；

f.弃上清，用75％乙醇洗涤，4℃7500g离心5分钟；

g.弃上清，在室温中晾干，20μl DEPC处理过的水溶解，进入反转录程序。

6.反转录

a.预变性体系与预变性

RNA                           500ng-1μg

GSP(基因特异引物)(0.5μg/反应) 1μl

无核酸酶的水                  加至10μl

70℃5分钟，完成后马上置于冰上。

b.反转录体系与反转录

25℃5分钟；42℃60分钟；70℃15分钟；4℃∞。

7.实时荧光定量PCR(图4c)

按照以下体系加入

将以上体系溶液按每孔15ul的量加入到三个孔中。将整个反应板放于PikoReal实时定量PCR检测系统(Thermo Scientific)中。按以下程序进行实时荧光定量PCR

其中，变性与退火/延伸这两步共进行40个循环。

对PCR数据进行分析。

在本实验结果中，无论是以IgG作为对照(图4c左)还是以scramble序列作为对照(图4c右)，p53R175H-APT都显示出来对p53R175H的高亲和力。

实施例5、筛选得到的核酸适配体在裸鼠体内降低肿瘤生长速率

1.实验动物购买及饲养

13只5周龄雌性裸鼠均购于上海斯莱克(SLAC)实验动物有限公司，通过空运抵达合肥，随后以每3只为一笼，饲养于中国科学技术大学实验动物中心II区。所有实验动物操作流程均按照National Institutes of HealthGuide for the Care and Use of Laboratory animals进行，并经中国科学技术大学实验动物伦理委员会批准，批准号No.USTCACUC1401008(实体瘤注射治疗)，No.USTCACUC1401010(静脉注射治疗)。

2.肿瘤接种

在每只裸鼠背部皮下接种肿瘤。将准备好的H1299-p53R175H细胞用胰酶消化并计数，将细胞悬浮并加等量的Matrigel(BD Biosciences)混合，使得终浓度为5X10⁶个/100μl。在左右背部各接种一个肿瘤。

3.给药方式与肿瘤测量

实验动物抵达饲养间一周后接种肿瘤，5天后当肿瘤已可通过触感摸到时给药。实体瘤注射为每个肿瘤部位注射10μg p53R175H-APT。静脉注射治疗是通过尾静脉注射，每只裸鼠直接注射20μg p53R175H-APT。

对于肿瘤每周使用游标卡尺测量两次，计算公式为V(in mm³)＝a×b²/2，其中，a为长径，b为短径。

实验结果经分析，无论是通过实体瘤注射(图5a)还是静脉注射(图5b)，p53R175H-APT均能显著降低肿瘤生长速率，起到良好的治疗效果。

Claims (9)

1.特异性结合p53突变体蛋白p53R175H的核酸适配体，所述核酸适配体包含如SEQ ID NO.1所示的序列。

2.权利要求1所述的核酸适配体，其在SEQ ID NO.1的某一位置处被修饰，如磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化。

3.权利要求1所述的核酸适配体，其还连接有荧光标记物、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料或酶标记。

4.核酸适配体，其包含以下三种序列中的任意一种：

(1)与权利要求1-3中任一项所述的核酸适配体的序列的序列同源性在60％以上的序列；

(2)能够与权利要求1-3中任一项所述的核酸适配体的序列进行杂交的序列；或

(3)由权利要求1-3中任一项所述的核酸适配体的序列反转录的序列。

5.权利要求1-3中任一项所述的核酸适配体的衍生物，所述衍生物具有由权利要求1-3中任一项所述的核酸适配体的序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架，或者是由权利要求1-3中任一项所述的核酸适配体改造成的相应的肽核酸。

6.用于筛选特异性结合p53突变体蛋白p53R175H的核酸适配体的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)提供随机单链DNA文库，所述DNA文库包含由下式表示的随机单链DNA：TAATACGACTCACTATAGCAATGGTACGGTACTTCC(N25)CAAAAGTGCACGCTACTTTG，其中N25表示中间的25个氨基酸的随机序列，并且提供如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的一对引物；

(2)以所述DNA文库为模板，使用上述引物进行PCR扩增，以所述PCR的产物作为体外转录模板进行体外转录，从而获得用于筛选的RNA适配体文库；

(3)将野生型p53蛋白偶联在NHS活化的琼脂糖珠子上，并且将突变体蛋白p53R175H偶联在NHS活化的磁珠上；

(4)将步骤(3)中得到的偶联有p53的珠子和偶联有p53R175H的磁珠 加入步骤(2)中得到的RNA适配体文库中进行孵育，孵育后对磁珠进行磁性分离，对结合在所述磁珠上的RNA适配体进行纯化和反转录以制备用于进一步筛选的DNA文库；

(5)用步骤(4)中得到的DNA文库代替步骤(1)中的文库来作为步骤(2)中的模板，并重复步骤(2)至(4)，在每一轮筛选后比较所筛选到的RNA适配体与p53和p53R175H的结合能力，直至获得特异性结合p53R175H的RNA适配体。

7.权利要求6所述的方法，其中使用ELISA方法来比较所筛选到的RNA适配体对p53和p53R175H的结合能力。

8.权利要求1-4中任一项所述的核酸适配体，或权利要求5所述的核酸适配体的衍生物，在制备用于结合p53R175H蛋白的试剂中的用途。

9.权利要求1-4中任一项所述的核酸适配体，或权利要求5所述的核酸适配体的衍生物，在制备药物中的用途，所述药物用于治疗由p53突变体p53R175H引起的肿瘤。