CN104988104A - 一株具有吸附或降解肠毒素功能的乳酸菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株具有吸附或降解肠毒素功能的乳酸菌及其应用，其保藏编号为CCTCC NO:M2015128。所述乳酸菌具有吸附或降解肠毒素功能，且有较好的耐酸、耐胆盐及耐人工胃液、肠液效果。具体体现在：可吸附或降解肠毒素，具有较好的清除肠毒素能力；能够抑制常见病原菌的生长；能够耐酸、耐胆盐可在消化道内存活。具体应用时，方法为：常温下将冻干菌粉溶于水中口服或者直接按照一定比例添加制成功能性食品或保健品。本发明的乳杆菌是从众多乳酸菌中筛选得到的，其不仅具高清肠毒素能力，还具有良好的性能，可用于人体保健。
Description
技术领域
本发明涉及一株具清肠毒素功能的乳酸菌及其应用，可应用于功能性食品及保健食品，属于生物技术领域。
背景技术
毒素是一种可以干预正常生理活动并破坏机体功能的物质。由于外在环境的污染、饮食的不健康等因素导致体内产生毒素。人体内在毒素有自由基、宿便、胆固醇、尿酸、乳酸、水毒和淤血等，并且新陈代谢过程中产生内生毒素如糖、脂肪、蛋白质代谢紊乱所产生的毒素，肠内宿便积聚产生的毒素。
人体积存的毒素不仅破坏人体正常的消化吸收，同时毒素也会随着血液循环到人体各器官，从而损坏循环系统、过滤系统及消化系统。当人体内的毒素积累到一定量的时候，将严重威胁到人的身体健康。由于女性身体结构的特殊性，健康就受到了更为严峻的挑战，会导致以下几个方面的健康问题:体内毒素过多积累，造成人体免疫力下，表现为降畏寒怕冷、特别容易感冒；体内淤血等毒素淤积，气血不调表现为身体疼痛，手脚冰凉；毒素释放胶原蛋白酶和硬弹性蛋白酶，破坏人体酶系统平衡，导致肌肤失去弹性，导致皱纹、肤色暗沉、肌肤老化，失去美丽；体内致癌毒素囤积引发癌变，诸如乳腺痛、子宫癌等。排毒是维护女性健康的必要课程，只有排出体内毒素，才会获得由内而外的美丽。
目前，排毒养颜保健品按特点及主要功效成分可划分为四类：第一类以大黄等致泻药剂为主要功效成分，有腹痛、腹泻等副作用，长期服用会导致肠功能紊乱，如排毒养颜胶囊。第二类以决明子、淮山药和芦荟等清润类药剂为主要功效成分，有一定副作用，长期服同样用会产生依赖性，如碧生源常润茶。第三类以益生元为主要功效成分，不含任何药物成分，以纯粮提炼的天然元素为功效成分，通便自然，不腹痛、不腹泻、无依赖，但见效时间长，如立健三清。第四类以益生菌为主要功效成分，无明显副作用，如昂立1号R优菌多颗粒(女士型)(嗜酸乳杆菌)。排毒养颜保健品中前三类数量繁多，但只占据了很少的市场份额，具北京、上海、杭州三地调查研究发现，排毒养颜这一款产品占据了排毒养颜类产品的43％份额，处于主导地位的只有排毒养颜、昂立一号、脑白金等几款产品。面对排毒养颜类产品市场的主导产品少的局面，适时抓住商机，推出人体全方位“调理、养护、促排”新概念的特色产品，真正解决排除体内毒素，降低毒素引发的体弱多病、免疫低下、肤质暗淡等的发生，为中年女性朋友增添一抹靓色。
本发明从现有的乳酸菌中初选的10株菌进行清除肠道毒素功能的筛选，筛选到一株具清除肠道毒素性能的植物乳杆菌，分析其清毒素机理，并对其耐受性进行研究，为将乳酸菌的清除肠道毒素作用应用于功能性食品或保健品的开发和生产提供理论依据。
发明内容
针对上述现有技术，本发明旨在筛选出一株具有吸附或降解肠毒素功能的乳酸菌，分析清除肠毒素机理，并对其耐受性进行研究，为将乳酸菌的清除肠毒素作用应用于功能性食品或保健品的开发和生产奠定基础。
为了解决以上发明目的，本发明采用的技术方案如下，一株具有吸附或降解肠毒素功能的乳酸菌，该菌株命名为植物乳杆菌BLCC2-0126，其保藏编号为CCTCC NO:M2015128。
为了解决以上发明目的，本发明还采用了如下技术方案，一株具有吸附或降解肠毒素功能的乳酸菌的应用，用于机体的肠毒素清除。
作为优选：将菌粉与载体混匀，直接饮用或制成功能性食品及保健品食用。
为了解决以上发明目的，本发明还采用了如下技术方案，一种菌粉的制备方法：所述菌粉是通过以下步骤得到的：
(ⅰ)菌种：选用植物乳杆菌BLCC2-0126；
(ⅱ)斜面培养：将冻干粉菌种接种于固体斜面培养基上，在30～40℃培养22～26h；
(ⅲ)一级种子培养：取培养好的斜面，在无菌条件下接种于种子液体培养基中，在30～40℃条件下，静置培养12～16h，制得一级种子液；
(ⅳ)扩大培养：按2～10％的接种量，将一级种子液接种于种子液体培养基中，在30～40℃条件下，静置培养12～24h，制得二级种子液；
(ⅴ)发酵罐培养：按1～5％的接种量，将二级种子液接于液体发酵培养基中，在30～40℃条件下，静置培养12～24h；
(ⅵ)收集发酵产物：待步骤(ⅴ)之发酵液黏度达12000～15000cP时，收集发酵液；
(ⅶ)发酵结束后，立即将发酵液离心并用清水清洗，如此反复2～3遍后冷冻干燥，粉碎，即为菌粉成品；或：发酵结束后，立即喷雾干燥，即得菌粉成品。
作为优选：所述步骤(ⅲ)、(ⅳ)中，种子液体培养基配方为：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L，使用时，调节pH至5.5～6.5，115℃条件下灭菌20min。
作为优选：所述步骤(ⅱ)中，固体斜面培养基为上述种子液体培养基中添加1.5～2.0％的琼脂粉。
作为优选：所述步骤(ⅴ)中，液体发酵培养基配方为：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸铵2g/L、磷酸氢二钾5g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸锰0.2g/L、吐温-801mL/L，使用时，调节pH至5.5～6.5。
本发明的有益效果如下：一种清除肠道毒素微生态制剂，是由以下原料组成的：菌粉和益生元；所述菌为可用于清除肠道毒素的乳杆菌，该株菌株命名为植物乳杆菌BLCC2-0126(Lactobacillus plantarum BLCC2-0126)，已于2015年3月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNO:M2015128。使用时，直接食用或冲服饮用即可。本发明的植物乳杆菌是从众多乳酸菌中筛选得到的，其不仅具清除肠道毒素活性，还可以具有良好的耐酸耐胆盐特性，可增强机体免疫力。
附图说明
图1为植物乳杆显微菌形态图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
如图1所示，所述乳酸菌的菌种生物学特性如下：该菌种的细胞大小为(0.6μm～0.8μm)×(1.5μm～4.5μm)，杆状，无鞭毛，不产芽孢，单个排列；该菌种能在MRS琼脂培养基上生长，菌落呈乳白色，圆形，规则，中央突起，表面光滑，质地均匀，挑取菌体时具一定黏性；该菌种属于同型发酵乳酸菌，能够发酵果糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖、蔗糖；接触酶试验、淀粉水解试验、乙酸氧化试验、明胶液化试验、硝酸盐还原试验甲基红反应均为阴性；最适生长温度为30～37℃，兼性厌氧，在pH值4.5～9.5生长，最适pH值6.0左右。
实施例1 具有清除肠毒素功能乳酸菌的筛选
1.1乳酸菌的培养及发酵液的制备
乳酸菌在MRS液体培养基中37℃培养24h，6000r/min，4℃离心10min，收集上清液即为发酵液。
1.2乳酸菌在不同毒素及不同浓度中的耐受能力测定
吸取2mL吲哚、苯酚、对甲酚母液与100mL MRS培养基中，配制成毒素浓度分别为0.1、0.1、0.5mg/mL的培养基，接种乳酸菌24h发酵液(2％)于12h、24h、32h取样活菌计数，以不含毒素的培养基发酵液为对照，计算乳酸菌的存活率。母液制备：苯酚(60度温裕由结晶状态成为液体)、对甲酚，分别称取0.05g、0.25g溶于10mL蒸馏水，121℃灭菌15min，即为5mg/mL、25mg/mL母液；吲哚0.05g溶于70％酒精，充分溶解后0.22微米滤膜过滤除菌，备用，母液浓度5mg/mL。
1.3乳酸菌清除肠道毒素的功效验证
选用老龄小鼠，经口灌胃受试样品，依据《保健品功能评价程序与检验手册》，在实验结束时测定粪样LPS、吲哚、苯酚、对甲酚含量，验证乳酸菌的清除肠道毒素的作用。
实施例2 耐酸性试验
用HCl将生理盐水的pH值分别调至1.5、2.0、3.0，115℃,灭菌30min,按1％接菌量无菌接入发酵24h的菌液，37℃条件下分别于1h、2h、3h取样测定活菌数,盐水作对照。存活率(％)＝待测pH的菌液活菌数/盐水活菌数×100。实施例3耐胆盐试验
菌液按1％(v/v)接种于胆盐浓度为0.1％、0.2％、0.3％、(w/v)的MRS培养基中，以不加胆盐的MRS培养基为对照，在37℃条件下培养0h、2h、4h、6h后，取样进行平板菌落计数，计算乳杆菌存活率。
实施例4 耐人工胃液试验
菌液按2％(v/v)接种于模拟胃液中，在37℃条件下培养0.5h、1h、2h，取样进行平板菌落计数，以0h活菌数为对照，计算乳杆菌存活率。
人工胃液：准确量取20mL的1mol/L盐酸加蒸馏水调节PH值为2.5，加入胃蛋白酶(1g/100mL)，充分溶解后，用孔径为0.22微米滤膜过滤除菌即可。
实施例5 耐人工肠液试验
菌液按2％(v/v)接种于模拟胃液中，在37℃条件下培养2h、4h、6h、8h，取样进行平板菌落计数，以0h活菌数为对照，计算乳杆菌存活率。
人工肠液配制：取磷酸二氢钾6.8g，加水500mL使溶解，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节PH值至6.8，另取胰酶10g，加水适量使溶解，将两液混合后加水稀释至1000mL，即得。
实施例6 试验结果与分析
6.1菌株的筛选及肠毒素耐受性能测定
6.1.1肠毒素耐受性试验
表1 乳酸菌对不同浓度吲哚耐受性试验结果
表2 乳酸菌对不同浓度对甲酚耐受性试验结果
表3 乳酸菌对不同浓度苯酚耐受性试验结果
由表1、2、3中的实验数据综合分析可知，乳酸菌大-2-1-1(即BLCC2-0126)对吲哚、对甲酚、苯酚的耐受力最好，因此选用该菌株进行肠毒素清除率的测定试验。
6.1.2肠毒素清除率
表4 粪便吲哚、3-甲基吲哚、苯酚、对甲酚含量测定结果(ug/g)
注：降解率＝(对照-样本)/对照×100％；＊：与CK比较差异极显著
由表4中实验数据综合分析可以看出，灌胃具有降解毒素的乳酸菌发酵液(D1)的小白鼠肠道毒素降解率明显优于其他组。
6.2菌株特性
6.2.1耐酸性试验
菌株BLCC2-0126的耐酸性试验结果如表5所示
表5 菌株BLCC2-0126耐酸性试验结果活菌数存活率(％)0h：2.61*107
| 取样时间/pH值 | 1.5 | 2.0 | 3.0 | 盐水 |
| 1h | 0.86 | 81.23 | 105.36 | 122.61 |
| 2h | 0.08 | 76.63 | 90.04 | 104.98 |
| 3h | 0.0028 | 38.31 | 76.63 | 98.85 |
由表5可以看出菌株BLCC2-0126在pH值2.0、3.0时，1h内的存活率分别为81.23％、105.36％；2h内的的存活率分别为76.63％、90.04％；3h内的存活率分别为38.31％、76.63％说明该菌具有较强的耐酸性。
6.2.2耐胆盐试验
菌株BLCC2-0126的耐酸性试验结果如表6所示
表6 菌株BLCC2-0126的耐胆盐试验结果存活率(％)
| 取样时间/胆盐浓度 | 0％ | 0.1％ | 0.2％ | 0.3％ |
| 0h | 100 | 112.78 | 75.77 | 54.63 |
| 2h | 174.45 | 79.73 | 70.48 | 58.15 |
| 4h | 691.63 | 73.13 | 73.13 | 45.37 |
| 6h | 3105.73 | 127.75 | 61.67 | 29.07 |
益生菌只有能耐受一定的胆盐浓度，才能在肠道内定植。由图6看出菌株BLCC2-0126在胆盐浓度为0.1％环境中存活率为112.78％，随着胆盐浓度的增大存活率明显下降，在胆盐浓度0.3％时，存活率为54.63％，其存活率超过50％,因此能够在肠道内增殖。由此可以看出菌株BLCC2-0126具较好的耐胆盐效果。
6.2.3耐人工胃液试验
菌株BLCC2-0126的耐人工胃液试验结果如表7所示
表7 耐受人工胃液存活率(％)
| 时间 | 0.5h | 1h | 2h |
| 存活率 | 55.00 | 53.25 | 53.00 |
由表7可以看出菌株BLCC2-0126在人工胃液中0.5h、1h、2h时的存活率分别为55％、53.25％、53％，存活数比较稳定，因此，该菌株具有良好的耐人工胃液能力。
6.2.4耐人工肠液试验
菌株BLCC2-0126的耐人工肠液试验结果如表8所示
表8 耐受人工肠液存活率(％)
| 时间 | 2h | 4h | 6h | 8h |
| 存活率 | 133.29 | 145.24 | 157.06 | 186.60 |
由表8可以看出菌株BLCC2-0126在人工肠液中2h、4h、6h、8h时的存活率分别为133.29％、145.24％、157.06％/186.60％，存活率均大于1且不断上升，因此，该菌株具有良好的耐人工肠液能力。
Claims (7)
1.一株具有吸附或降解肠毒素功能的乳酸菌，其特征在于：该菌株命名为植物乳杆菌BLCC2-0126，其保藏编号为CCTCC NO:M2015128。
2.根据权利要求1所述的一株具有吸附或降解肠毒素功能的乳酸菌的应用，其特征在于：用于机体的肠毒素清除。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：将所述乳酸菌制成的菌粉与载体混匀，直接饮用或制成功能性食品及保健品食用。
4.根据权利要求3所述的菌粉的制备方法，其特征在于：所述菌粉通过以下步骤得到：
(ⅰ)菌种：选用植物乳杆菌BLCC2-0126；
(ⅱ)斜面培养：将冻干粉菌种接种于固体斜面培养基上，在30～40℃培养22～26h；
(ⅲ)一级种子培养：取培养好的斜面，在无菌条件下接种于种子液体培养基中，在30～40℃条件下，静置培养12～16h，制得一级种子液；
(ⅳ)扩大培养：按2～10％的接种量，将一级种子液接种于种子液体培养基中，在30～40℃条件下，静置培养12～24h，制得二级种子液；
(ⅴ)发酵罐培养：按1～5％的接种量，将二级种子液接于液体发酵培养基中，在30～40℃条件下，静置培养12～24h；
(ⅵ)收集发酵产物：待步骤(ⅴ)之发酵液黏度达12000～15000cP时，收集发酵液；
(ⅶ)发酵结束后，立即将发酵液离心并用清水清洗，如此反复2～3遍后冷冻干燥，粉碎，即为菌粉成品；或：发酵结束后，立即喷雾干燥，即得菌粉成品。
5.根据权利要求4所述的菌粉的制备方法，其特征在于：所述步骤(ⅲ)、(ⅳ)中，种子液体培养基配方为：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L，使用时，调节pH至5.5～6.5，115℃条件下灭菌20min。
6.根据权利要求4所述的菌粉的制备方法，其特征在于：所述步骤(ⅱ)中，固体斜面培养基为上述种子液体培养基中添加1.5～2.0％的琼脂粉。
7.根据权利要求4或5或6所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(ⅴ)中，液体发酵培养基配方为：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸铵2g/L、磷酸氢二钾5g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸锰0.2g/L、吐温-80 1mL/L，使用时，调节pH至5.5～6.5。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP03 | Change of name, title or address | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: 271099 No. 17 Huayuan Road, Taishan District, Tai'an City, Shandong Province Patentee after: Shandong Fenghuang Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 271000 No. 28 Chuangye street, Taishan District, Tai'an City, Shandong Province Patentee before: SHANDONG PHOENIX BIO-TECH. Co.,Ltd. |
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Denomination of invention: A lactic acid bacteria with the function of adsorbing or degrading enterotoxin and its application Effective date of registration: 20211229 Granted publication date: 20171226 Pledgee: Taian Bank Co.,Ltd. Daizong sub branch Pledgor: Shandong Fenghuang Biotechnology Co.,Ltd. Registration number: Y2021980016806 |
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| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20221206 Granted publication date: 20171226 Pledgee: Taian Bank Co.,Ltd. Daizong sub branch Pledgor: Shandong Fenghuang Biotechnology Co.,Ltd. Registration number: Y2021980016806 |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A Lactic Acid Bacteria with the Function of Absorbing or Degrading Enterotoxin and Its Application Effective date of registration: 20221212 Granted publication date: 20171226 Pledgee: Taian Bank Co.,Ltd. Daizong sub branch Pledgor: Shandong Fenghuang Biotechnology Co.,Ltd. Registration number: Y2022980026535 |
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| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20231213 Granted publication date: 20171226 Pledgee: Taian Bank Co.,Ltd. Daizong sub branch Pledgor: Shandong Fenghuang Biotechnology Co.,Ltd. Registration number: Y2022980026535 |
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Denomination of invention: A Lactic Acid Bacteria with the Function of Adsorption or Degradation of Enterotoxins and Its Application Effective date of registration: 20231227 Granted publication date: 20171226 Pledgee: Taian Bank Co.,Ltd. Daizong sub branch Pledgor: Shandong Fenghuang Biotechnology Co.,Ltd. Registration number: Y2023980074803 |
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