CN104984402A - 一种羟乙基壳聚糖原位水凝胶的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种羟乙基壳聚糖原位水凝胶的制备方法，首先将高碘酸钠粉末溶于去离子水中，制得高碘酸钠水溶液，然后搅拌海藻酸钠水溶液与高碘酸钠水溶液形成混合液使其进行氧化反应后加入乙二醇终止反应，抽滤混合液并用无水乙醇脱水沉淀后低温真空干燥制得氧化海藻酸钠粗品，再用蒸馏水溶解成氧化海藻酸钠粗品水溶液，将其透析完全后进行离心取上清液冷冻干燥制得氧化海藻酸钠，最后将羟乙基壳聚糖与氧化海藻酸钠混合经双联注射器交联反应挤推至试管中得羟乙基壳聚糖原位水凝胶，用于角膜缘干细胞的快速包封移植；其制备工艺简单，原理安全可靠，制备成本低，产品质量好，使用安全，卫生，治疗环境友好。

Description

一种羟乙基壳聚糖原位水凝胶的制备方法

技术领域：

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种羟乙基壳聚糖原位水凝胶的制备方法。

背景技术：

角膜位于眼球最外层，受伤概率极高，易导致不同程度的瘢痕，影响视力，角膜损伤种类繁多，其中化学损伤在临床上治疗难度较大，由于化学物质能对眼组织结构造成严重损伤，导致上皮坏死、脱落，角结膜融解穿孔及睑球粘连等，预后较差；目前临床上主要以羊膜移植或角膜移植来治疗，但前者常常发生羊膜自溶，后者又面临供体缺乏和免疫排斥两大问题，所以角膜缘干细胞移植治疗角膜损伤成为研究的热点。角膜碱烧伤后，由于碱的皂化作用，首先破坏角膜的最外层—上皮层，上皮损伤后角膜缘干细胞向中央移行，形成覆盖创面的新上皮。一旦角膜缘损伤，角膜上皮再生来源缺乏，就会严重延迟角膜上皮的修复，从而激发急性炎症反应；白细胞迅速侵入角膜，缺损区出现多形核白细胞(PMN)，PMN释放大量的蛋白酶；其中的胶原酶溶解胶原纤维，而被激活的基质金属蛋白酶(MMPs)降解角膜细胞外基质多种成分，致使角膜组织迅速崩解，形成溃疡；同时，暴露的角膜基质细胞受刺激后，为了弥补溃疡面的缺损，从静止状态向修复表型的成纤维细胞、肌成纤维细胞转化，使得细胞内部结构发生改变，光线通过时发生散射而致透明度下降；而且成肌纤维细胞会产生大量的粗大且排列紊乱的胶原纤维，造成组织纤维化瘢痕的形成，严重影响视力的恢复。所以，角膜严重损伤治疗必须从两方面着手，一是进行角膜缘干细胞移植，为角膜上皮及时修复提供种子细胞；二是防止角膜基质细胞向肌成纤维细胞转化，抑制瘢痕的形成。近年来，为了解决角膜缺损后的干细胞来源问题，研究者尝试在体外培养自体或同种异体培养角膜缘干细胞(LSCs)用于角膜移植；体外培养的角膜缘干细胞具有诸多优点：1、所需角膜缘组织极少，对供眼无潜在威胁；2、培养的细胞可冻存用于二次移植；3、能抑制眼表急性病变的发展，迅速恢复术眼正常的眼表结构；4、可避免异体组织移植而导致的免疫排斥；5、缓解角膜供体来源不足的难题。但角膜缘干细胞移植必须借助一种安全可靠的载体，这是决定该技术应用效果的关键环节，若载体适宜，角膜缘干细胞移植将为角膜损伤患者带来新的福音；目前，临床上应用较多的载体是羊膜，因其作为一种基底膜，具有类似角、结膜的成分，即Ⅳ型胶原纤维，但严重角膜损伤如碱烧伤后，组织中胶原酶的表达量大大增加，易导致羊膜自溶，直接延缓修复过程；因此患者即使多次移植，效果仍不理想，探寻一种安全有效的角膜缘干细胞移植载体成为当前研究的热点。

在现有技术中，水溶性的羟乙基壳聚糖(HECTS)是壳聚糖的一种重要衍生物，其在生物体内可被生物酶催化，缓慢降解成对人体无毒的单糖，与细胞外基质成分相似，支持细胞的粘附和生长；同时能够抑制成纤维细胞生长，降低创面转化生长因子-β(TGF-β)表达水平，从而具有防粘连的作用；海藻酸钠(SA)是从海藻中提取的天然聚阴离子多糖，具有良好的成胶性、生物相容性和低毒性以及相对低廉的价格，被广泛地应用在轻工业、食品、组织工程和医药等领域，SA具有聚阴离子羧基，可与二价离子形成离子交联型水凝胶，常用作酶类、蛋白质、药物及动植物细胞的包埋固定化载体，但由于二价离子很容易与周围介质中的离子发生交换，导致凝胶的降解速度不可控。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，寻求设计一种羟乙基壳聚糖原位水凝胶的制备方法，以角膜碱烧伤为研究模型，针对角膜损伤修复制备能够在角膜损伤原位自主交联快速形成凝胶的新型角膜缘干细胞移植载体。

为了实现上述目的，本发明涉及的羟乙基壳聚糖原位水凝胶的制备工艺包括高碘酸钠水溶液制备、氧化海藻酸钠制备和羟乙基壳聚糖原位水凝胶制备三个步骤：

(1)、高碘酸钠水溶液制备：常温下称取高碘酸钠(sigma，S1878)粉末1g并溶于50ml去离子水中，制得质量百分比浓度为2％的高碘酸钠水溶液；

(2)、氧化海藻酸钠制备：在质量百分比浓度为2％的海藻酸钠水溶液中按海藻酸钠与高碘酸钠反应的摩尔比为10:1加入步骤(1)制备的高碘酸钠水溶液，在室温下搅拌海藻酸钠水溶液和高碘酸钠水溶液混合形成的混合液使其进行氧化反应，24h后在混合液中加入乙二醇100ul终止氧化反应0.5h，抽滤混合液并用无水乙醇脱水沉淀得到白色固形物，低温真空干燥白色固形物后制得氧化海藻酸钠粗品，再将氧化海藻酸钠粗品用蒸馏水溶解成质量百分比浓度为2％的氧化海藻酸钠粗品水溶液，在4℃温度下将氧化海藻酸钠粗品水溶液置于透析袋中透析，每6h换1次蒸馏水，用电导率仪测定氧化海藻酸钠粗品水溶液透析完全后进行离心后取上清液冷冻干燥制得氧化度为10％的氧化海藻酸钠；

(3)、羟乙基壳聚糖原位水凝胶制备：将质量百分比浓度为2％羟乙基壳聚糖与步骤(2)制得的氧化海藻酸钠按质量比8:1等体积混合后经过双联注射器交联反应挤推至试管中得羟乙基壳聚糖原位水凝胶。

本发明所述高碘酸钠为强氧化剂，能氧化邻二醇结构，使其成为醛或酮；海藻酸钠的糖醛酸单元具有顺式邻二醇结构，能在高碘酸钠的氧化作用下打开C-C键生成两个醛基，海藻酸钠的氧化机理如图1所示，海藻酸钠通过氧化引入醛基制备得到的氧化海藻酸钠，直接与带有游离氨基的羟乙基壳聚糖发生交联反应在创面快速形成原位水凝胶，作为角膜缘干细胞移植载体，促进角膜上皮重建。

本发明与现有技术相比，利用海藻酸钠具有顺二醇结构的性质，将其适度氧化引入一定量的醛基，制备成氧化海藻酸钠，使其能直接与带有游离氨基的多糖发生交联反应，氧化海藻酸钠与羟乙基壳聚糖直接交联形成原位水凝胶，作为角膜缘干细胞移植的载体并将其用于角膜眼表严重损伤的修复，既无交联剂的添加，生物安全性高，又可达到与损伤角膜高度吻合；利用羟乙基壳聚糖原位水凝胶快速原位成胶的特性，将体外培养的角膜缘干细胞与羟乙基壳聚糖混合后，与氧化海藻酸钠经双联注射器交联成胶，将角膜缘干细胞包封于眼表创面治疗严重角膜损伤，羟乙基壳聚糖原位水凝胶与眼表曲率吻合度更高，克服了膜片无法实现理想曲率的缺点，羟乙基壳聚糖原位水凝胶-角膜缘干细胞能够明显促进角膜上皮重建，有效防止角膜瘢痕化；通过慢病毒感染体外培养的角膜缘干细胞，筛选出稳定表达荧光素酶的干细胞用于活体示踪，来揭示角膜缘干细胞参与修复的动态过程；其制备工艺简单，原理安全可靠，制备成本低，产品质量好，使用安全，卫生，治疗环境友好。

附图说明：

图1是本发明涉及的海藻酸钠的氧化机理示意图。

图2是本发明涉及的兔角膜缘干细胞体外培养图及细胞免疫化学染色结果(100×)，(a)角膜缘干细胞原代培养；(b)角膜缘干细胞传代培养；(c)△Np63细胞免疫化学染色；(d)角蛋白K3细胞免疫化学染色。

图3是本发明涉及的转化生长因子-β/Smad通路相关因子基因及蛋白水平的检测，A：Real-time PCR结果(*P<0.05)；B：Westernblot结果；C-D：相关因子蛋白水平的比较。

具体实施方式：

下面通过实施例并结合附图对本发明做进一步描述。

实施例：

本实施例涉及的羟乙基壳聚糖原位水凝胶的制备工艺包括高碘酸钠水溶液制备、氧化海藻酸钠制备和羟乙基壳聚糖原位水凝胶制备三个步骤：

(1)、高碘酸钠水溶液制备：常温下称取高碘酸钠(sigma，S1878)粉末1g并溶于50ml去离子水中，制得质量百分比浓度为2％的高碘酸钠水溶液；

(2)、氧化海藻酸钠制备：在质量百分比浓度为2％的海藻酸钠水溶液中按海藻酸钠与高碘酸钠反应的摩尔比为10:1加入步骤(1)制备的高碘酸钠水溶液，在室温下搅拌海藻酸钠水溶液和高碘酸钠水溶液混合形成的混合液使其进行氧化反应，24h后在混合液中加入乙二醇100ul终止氧化反应0.5h，抽滤混合液并用无水乙醇脱水沉淀得到白色固形物，低温真空干燥白色固形物后制得氧化海藻酸钠粗品，再将氧化海藻酸钠粗品用蒸馏水溶解成质量百分比浓度为2％的氧化海藻酸钠粗品水溶液，在4℃温度下将氧化海藻酸钠粗品水溶液置于透析袋中透析，每6h换1次蒸馏水，用电导率仪测定氧化海藻酸钠粗品水溶液透析完全后进行离心后取上清液冷冻干燥制得氧化度为10％的氧化海藻酸钠；

(3)、羟乙基壳聚糖原位水凝胶制备：将质量百分比浓度为2％羟乙基壳聚糖与步骤(2)制得的氧化海藻酸钠按质量比8:1等体积混合后经过双联注射器交联反应挤推至试管中得羟乙基壳聚糖原位水凝胶。

本实施例所述高碘酸钠为强氧化剂，能氧化邻二醇结构，使其成为醛或酮；海藻酸钠的糖醛酸单元具有顺式邻二醇结构，能在高碘酸钠的氧化作用下打开C-C键生成两个醛基，海藻酸钠的氧化机理如图1所示，海藻酸钠通过氧化引入醛基制备得到的氧化海藻酸钠，直接与带有游离氨基的羟乙基壳聚糖发生交联反应在创面快速形成原位水凝胶，作为角膜缘干细胞移植载体，促进角膜上皮重建。

本实施例制备的羟乙基壳聚糖原位水凝胶的性质测定包括细胞毒性评价、皮内刺激试验、体内降解性实验和生物相容性评价四个方面：

(1)、细胞毒性评价：参照国标医疗器械生物学评价标准：体外细胞毒性评价(GB/T16886.5-2003)标准和样品制备与参照样品(GB/T16886.12-2003)标准，按200mg凝胶/ml培养基的比例，于37℃浸提羟乙基壳聚糖原位水凝胶24h，取对数生长的L929成纤维细胞常规消化，调节细胞浓度为5.0×104个/ml，接种于96孔细胞培养板，每孔加200μL，培养24h后，吸弃原培养液，分别加入凝胶浸提原液，同时设立正常、空白、和样品对照组，每组各设6个平行孔，分别于培养2d、4d、7d时倒置显微镜观察细胞生长情况，MTT方法检测细胞增殖率，实验组的吸光值与对照组相比无显著差异，说明羟乙基壳聚糖原位水凝胶属于无毒的生物材料；

(2)、皮内刺激试验：根据国标医疗器械生物学评价—刺激与迟发型超敏反应试验(GB/T 16886.10-2005)标准，进行羟乙基壳聚糖原位水凝胶浸提液的皮内反应试验，通过皮内注射材料浸提液，对材料产生刺激反应的潜在性做出评价；挑选皮肤健康无损伤、初成年的新西兰大白兔，雌雄不限，体重不低于2kg，按GB/T 16886.2的规定饲养，使动物适应环境，试验前彻底除去动物背部脊柱两侧背毛，以备注射浸提液，为了证实试验的敏感性，每只动物设有空白对照组；在每只兔脊柱一侧的3个点，皮内注射0.2ml用生理盐水制备的羟乙基壳聚糖原位水凝胶浸提液(浸提标准同上)，同时在每只兔脊柱另一侧的五个皮内注射点上注射0.2ml生理盐水作为对照组，注射后0h、24h，48h，和72h分别观察记录各注射部位状况，按表1给出的记分系统对每一观察期各注射部位的红斑和水肿的组织反应评分，并记录试验结果；

表1皮内反应记分

(3)、体内降解性实验：将羟乙基壳聚糖原位水凝胶注入小鼠腿部肌肉后，实验组小鼠全部成活，无感染及其他并发症发生，腿部均无肿胀现象，定期切开注射部位观察，均未发现充血、化脓等现象，组织切片镜下观察发现：1w时肌肉组织内中有大量的未降解材料分散于肌肉组织间，并伴有炎症细胞的浸润，但材料周围未见有包膜形成，之后，随着时间的推移，材料逐渐降解，炎症反应也逐渐消退，4w时材料基本降解完全，且炎症反应完全消退；

(4)、生物相容性评价：随机选取实验级健康小鼠，雌雄兼半，体重为20g～22g，20只，选择小鼠左腿肌肉为注射点，分别注射内毒素检验合格的羟乙基壳聚糖原位水凝胶，100μl/只肌肉注射；分别于1、2、3、4w时将动物处死，每组每次至少3只，首先切开肌肉注射部位，观察组织外观形态以及材料的降解情况，后取部分肌肉、肝脏及肾脏组织切片，常规HE染色，评价其生物相容性及安全性。

本实施例制备的羟乙基壳聚糖原位水凝胶移植角膜缘干细胞对角膜损伤修复效果的评价包括体外培养兔角膜缘干细胞、动物模型建立及实验分组和术后护理及观察三个步骤：

(1)、体外培养兔角膜缘干细胞：无菌摘取1月龄新西兰白兔眼球，沿角膜缘环形剪开球结膜和结膜下筋膜组织，环形剪取角膜缘外1mm、角膜缘及角膜缘内lmm的角膜缘组织(深约150um)，消化组织块后，贴于培养瓶或培养板，置CO2培养箱中，37℃培养，每天于倒置显微镜下观察细胞迁移情况，细胞融合成良好的单层(图2-a)；细胞至80％融合时传代培养，传代筛选活性强的细胞(图2-b)，细胞免疫化学染色检测△Np63(图2-c)及角蛋白K3(图2-d)的表达；当△Np63的阳性率高于80％，角蛋白K3/K12的阳性率低于20％时，可用于后续的实验研究；

(2)、动物模型建立及实验分组：新西兰大白兔，体质量2-3kg，全麻，右眼为术眼，制作角膜中央部中度碱烧伤模型，左眼为正常对照，将直径8mm的滤纸片浸入1mol/LNaOH溶液中，1min后取出，贴附于角膜中央，与角膜密切接触1min后取下，立即用生理盐水冲洗角膜表面和结膜囊1min，形成角膜中央边界清楚的圆盘状白色烧伤区，再用手术刀背轻轻刮擦眼表，模拟损伤后的摩擦性损伤，使损伤深度达角膜基质层，瞳孔及虹膜窥视不清，依据Hughes分度法确认为Ⅲ度碱烧伤模型建立；动物随机分为6组，每组20只，3组实验组分别为羟乙基壳聚糖原位水凝胶-角膜缘干细胞组、单纯羟乙基壳聚糖原位水凝胶和角膜缘干细胞组，羊膜修复组和术后单纯滴加表皮生长因子阳性对照组，不做修复的阴性对照组；

(3)、术后护理及观察：术后，每天用氧氟沙星滴眼液抗感染，1、3、7d；2，3，4w肉眼观察角膜烧伤面积的变化，照相、统计愈合率，同时分别取带1mm巩膜组织的角膜片(每组3眼)，固定，均切成四部分，分别做病理、电镜、免疫组化观察以及碱烧伤区组织mRNA和蛋白的提取，用于修复机理的分析；组织块法体外培养模型动物的角膜缘干细胞；建立中重度碱烧伤的动物模型；将体外培养的角膜缘干细胞与CMCTS混合后，与氧化海藻酸钠经过双联注射器交联混合至损伤眼表，同时设置只加羟乙基壳聚糖原位水凝胶和角膜缘干细胞修复组、羊膜或表皮生长因子阳性对照组，不进行任何修复措施的阴性对照组，术后通过损伤区域、病理切片以及扫描电镜观察评价修复效果；术毕，各组均缝合上下眼睑；术后定期观察外眼像，观察二者联合对角膜损伤的修复作用，结果发现，对照组15d时仍未修复，中间受损区明显呈白色的瘢痕状，且新生血管较多，而实验组角膜基本呈透明状，说明羟乙基壳聚糖原位水凝胶联合角膜缘干细胞对角膜碱烧伤有良好的修复作用。

本实施例制备的羟乙基壳聚糖原位水凝胶移植角膜缘干细胞对角膜损伤修复的机理推导过程为：以新西兰大白兔为实验对象，设置羟乙基壳聚糖原位水凝胶联合角膜缘干细胞治疗组和不作治疗处理的对照组，每组15只；定期提取正常角膜组织、损伤修复组和模型对照组的mRNA及蛋白，检测转化生长因子-β通路相关因子，从转录和蛋白水平分析羟乙基壳聚糖原位水凝胶-角膜缘干细胞的作用机理；mRNA逆转录成cDNA后进行real-time PCR检测转化生长因子-β1、smad2、smad3以及去磷酸化酶PPM1A(如图3，A)，结果发现：将正常角膜的表达量定为“1”，模型对照组的PPM1A表达量为1.6，转化生长因子-β为16.9；而修复组PPM1A显著升高至8.4，转化生长因子-β显著降低至5.7；而两组的smad2、smad3基本没有变化；western blot检测转化生长因子-β、smad2、smad3以及磷酸化smad2(p-smad2)、p-smad3、PPM1A的蛋白量(如图3，B-D)，结果同样显示：修复组PPM1A高于模型对照组，而转化生长因子-β正好相反；而两组的smad2、smad3总蛋白量没有明显变化，但二者的磷酸化水平均降低；角膜损伤后，转化生长因子-β明显上调，诱导角膜基质细胞向肌成纤维细胞转化，导致纤维化瘢痕的形成，严重影响角膜的透明性；TGF-β是角膜损伤修复的关键因子；Smad寡聚物进入核内后，可受到多种蛋白的调节，其中镁依赖蛋白磷酸酶1A(PPM1A)是Smad寡聚物的一种重要调节分子，属于PPM家族成员；PPM1A是一种金属离子依赖型的蛋白磷酸酶，剪切底物为丝氨酸和苏氨酸残基上的磷酸基团，使Smad2/3去磷酸化，抑制转化生长因子-β/Smad信号通路，通过PPM1A敲除小鼠的眼表损伤发现，PPM1A的缺失可导致磷酸化Smad2/3明显上调，转化生长因子-β通路激活，导致眼表损伤修复过程延迟，所以PPM1A是转化生长因子-β/Smad信号通路的重要负调控因子，对于眼表损伤修复具有重要作用。

本实施例涉及的羟乙基壳聚糖原位水凝胶移植角膜缘干细胞对角膜严重损伤进行修复的机理为：通过作用PPM1A的转录水平促进其蛋白表达，从而降低smad2、smad3的磷酸化水平，抑制转化生长因子-β/Smad通路，促进眼表损伤修复。

Claims (2)

1.一种羟乙基壳聚糖原位水凝胶的制备方法，其特征在于制备工艺包括高碘酸钠水溶液制备、氧化海藻酸钠制备和羟乙基壳聚糖原位水凝胶制备三个步骤：

(1)、高碘酸钠水溶液制备：常温下称取高碘酸钠粉末1g并溶于50ml去离子水中，制得质量百分比浓度为2％的高碘酸钠水溶液；

(2)、氧化海藻酸钠制备：在质量百分比浓度为2％的海藻酸钠水溶液中按海藻酸钠与高碘酸钠反应的摩尔比为10:1加入步骤(1)制备的高碘酸钠水溶液，在室温下搅拌海藻酸钠水溶液和高碘酸钠水溶液混合形成的混合液使其进行氧化反应，24h后在混合液中加入乙二醇100ul终止氧化反应0.5h，抽滤混合液并用无水乙醇脱水沉淀得到白色固形物，低温真空干燥白色固形物后制得氧化海藻酸钠粗品，再将氧化海藻酸钠粗品用蒸馏水溶解成质量百分比浓度为2％的氧化海藻酸钠粗品水溶液，在4℃温度下将氧化海藻酸钠粗品水溶液置于透析袋中透析，每6h换1次蒸馏水，用电导率仪测定氧化海藻酸钠粗品水溶液透析完全后进行离心后取上清液冷冻干燥制得氧化度为10％的氧化海藻酸钠；

(3)、羟乙基壳聚糖原位水凝胶制备：将质量百分比浓度为2％羟乙基壳聚糖与步骤(2)制得的氧化海藻酸钠按质量比8:1等体积混合后经过双联注射器交联反应挤推至试管中得羟乙基壳聚糖原位水凝胶。

2.根据权利要求1所述的羟乙基壳聚糖原位水凝胶的制备方法，其特征在于所述高碘酸钠为强氧化剂，能氧化邻二醇结构，使其成为醛或酮；海藻酸钠的糖醛酸单元具有顺式邻二醇结构，能在高碘酸钠的氧化作用下打开C-C键生成两个醛基，海藻酸钠通过氧化引入醛基制备得到的氧化海藻酸钠，直接与带有游离氨基的羟乙基壳聚糖发生交联反应在创面快速形成原位水凝胶，作为角膜缘干细胞移植载体，促进角膜上皮重建。