CN1049823C - 生物制菌液及其生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于防治动物细菌病和促进动物新陈代谢的生物制剂—生物制菌液及其生产方法，属于生物制品及其制造领域。本发明采用加热或氯仿作用的方法得失活宿主菌于37-43℃环境中培养噬菌蛭弧菌，并将筮菌蛭弧菌培养物与失活宿主菌按比例悬浮在含有微量元素Ca、Mg、Zn、Fe的稀释液中，在37-43℃环境中培育一定时间，校正其pH值在3.0-9.8范围内，即得到生物制菌液。

Description

生物制菌液及其生产方法
本发明涉及一种防治动物细菌病和促进动物新陈代谢的生物制剂及其生产方法，属于生物制品及其制造领域。
目前国内外动物细菌病的防治药品，主要有抗生素类的化学合成药物。此类药物的使用，会使动物体内不断产生抗药菌株，有效药量逐渐增大，抑制动物的正常生长，且药物在动物体内的残留，会殃及人体健康。因此，研制开发高效无毒的生物防治动物细菌病的方法和制品引起人们极大兴趣和关注，各类生态制剂的研究正在崛起，以菌制菌的生物防治方法倍受重视。
噬菌蛭弧菌自60年代发现起，它对许多种动植物致病菌的“寄生”和“裂解”的独特的生物学特性就引起了人们的高度重视。但长期以来，人们一直认为噬菌蛭弧菌的生长温度为25-30℃，在40℃以上就不能生长繁殖，且只能在活菌上生长。而动物体(除人体)内的正常温度一般为40℃左右，噬菌蛭弧菌对温度特别敏感，25-30℃环境中培养的噬菌蛭弧菌在动物体内易失活；又在活菌上培养噬菌蛭弧菌的生产过程中，活菌易污染环境，且培养周期长(48-72小时)，收获量低(＜106pfu/ml)，培养物残留活菌对动物体有害。因此，人们利用噬菌蛭弧菌防治动物细菌病的开发和应用受到了极大限制。
本发明的目的在于提供一种以噬菌蛭弧菌培养物为主要成分，用于防治动物细菌病和促进动物新陈代谢的生物制剂--生物制菌液及其生产方法。
实现本发明的目的的技术解决方案是：用常规方法制取宿主菌悬液，并用灭菌蒸馏水离心洗涤三次以上；然后，加入灭菌蒸馏水配制成含菌量在20亿/ml以上的菌悬液；再在70-150℃下，加热至少15分钟以上，或者用容积比为1/5-1/10量(体积)氯仿作用1小时以上，制得失活宿主菌；然后以此失活宿主菌为宿主，用噬菌蛭弧菌常规培养法制取其培养物，再选择于25-30℃环境中在自来水双层琼脂平皿上噬斑典型的噬菌蛭弧菌，挑取单噬斑浸泡于灭菌自来水中4-6小时，然后，取上清再制双层琼脂平皿，调高温度3-5℃培养，选育出在37-43℃环境中能生长的噬菌蛭弧菌；最后将上述过程中制得的失活宿主菌和选育出的噬菌蛭弧菌按比例1∶10-1∶10万悬浮在含有微量元素含量Ca(1.0-10.0mg/l)、Mg(2.0-11.0mg/l)、Zn(2.0-15mg/l)、Fe(0.1-1.5mg/l)的稀释液中，在37-43℃温度条件下培育10-24小时，校正其PH值为3.0-9.8范围内，即得到本发明所要提供的用于防治动物细菌病和促进动物新陈代谢的生物制菌液。
本发明所提供的生物制菌液对伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌、嗜水气单胞菌的清除率均在92.74％以上。经南京农业大学测试，生物制菌液用于预防雏鸡白痢的保护率为88.3％，对仔鸡增重率为8.23-15.66％；经天津农学院测试，其用于治疗仔猪肠道细菌病的效果与抗生素基本相同。
本发明公开的生产生物制菌液的方法，避免了在活菌上培养噬菌蛭弧菌所造成的环境污染，且培养周期短、产量高；特别是使得噬菌蛭弧菌对动植物致病菌的“寄生”和“裂解”的独特的生物学特性应用于动物细菌病的防治成为现实。
下面结合实施例对本发明进行进一步详细说明：
首先，用常规方法获取对噬菌蛭弧菌敏感的、不产毒素的、非致病菌为宿主菌，再用加热或氯仿致死的方法使宿主菌失活。具体做法是：向菌种保藏机构索取或从环境中分离得到大肠杆菌，将其在营养琼脂平皿上划线分离，在37℃培养18小时，用相应的血清凝集，取凝集反应阳性的单菌落，接种到营养肉汤中，在37℃培养4-6小时，然后，转种琼脂斜面，于37℃培养18-20小时，用灭菌蒸馏水洗脱菌苔，并离心沉淀洗涤三次以上，去除培养基中的营养物质，再加入灭菌蒸馏水配制成含菌量在20亿/ml以上的菌悬液；然后在70-150℃温度条件下加热至少15分钟灭菌，或者用容积比为1/5-1/10量(体积)氯仿作用1小时以上，即得到失活的大肠杆菌。
其次，以上述失活的大肠杆菌为宿主，用噬菌蛭弧菌常规培养法制取其培养物后，再对其进行耐37-43℃的训化。具体做法是：从菌种保藏机构索取或从环境中分离得到噬菌蛭弧菌，并将其和失活的大肠杆菌加入4ml、46℃的0.7％上层琼脂中混合，然后倒在自来水双层琼脂平皿上，使其凝固一层；接着，于25-30℃环境中培养48-72小时，选取噬斑典型的噬菌蛭弧菌，挑取单噬斑浸泡于灭菌自来水中4-6小时；然后，取上清再制双层琼脂平皿，调高温度3-5℃培养，选育出在37-43℃环境中能生长的噬菌蛭弧菌。
最后，将失活的大肠杆菌和噬菌蛭弧菌按比例1∶103-1∶104悬浮在含有微量元素Ca、Mg、Zn、Fe分别为3.0mg/l、3.5mg/l、3.2mg/l、0.25mg/l的稀释液中，37-43℃培育10-24小时，校正其PH值为7.4，即得到生物制菌液。

Claims (4)

1、一种用于防治动物细菌病和促进动物新陈代谢的生物制菌液，其特征在于：其成份为：能在失活宿主上，于37-43℃环境中生长的噬菌蛭弧菌，对噬菌蛭弧菌敏感的、不产毒素的、非致病的宿主菌和微量元素Ca、Mg、Zn、Fe，其中噬菌蛭弧菌与宿主菌的比例为1∶10-1∶10万；微量元素含量分别为Ca为1.0-10.0mg/l，Mg为2.0-11.0mg/l，Zn为2.0-15mg/l，Fe为0.1-1.5mg/l；PH值为3.0-9.8。
2、根据权利要求1所述的生物制菌液，其特征在于：噬菌蛭弧菌与宿主菌的比例为1∶103-1∶104；Ca含量为3.0mg/l，Mg含量为3.5mg/l，Zn含量为3.2mg/l，Fe含量为0.25mg/l；PH值为7.4。
3、根据权利要求1或2所述的生物制菌液，其特征在于：宿主菌为失活的大肠杆菌。
4、根据权利要求1所述的生物制菌液，其特征在于：其生产方法包括以下工艺步骤：
(1)用常规方法制取宿主菌悬液并用灭菌蒸馏水离心洗涤三次以上；然后，
(2)加入灭菌蒸馏水配制成含菌量在20亿/ml以上的菌悬液；然后，
(3)在70-150℃下，加热至少15分钟，或者用容积比为1/5-1/10的氯仿作用1小时以上，制得失活宿主菌；
(4)以步骤(1)-(3)制得的失活宿主菌为宿主，用噬菌蛭弧菌常规培养法制取其培养物；然后，
(5)选择于25-30℃环境中在自来水双层琼脂平皿上噬斑典型的噬菌蛭弧菌，挑取单噬斑浸泡于灭菌自来水中4-6小时；然后，
(6)取上清再制双层琼脂平皿，调高温度3-5℃培养，选育出在37-43℃环境中能生长的噬菌蛭弧菌；
(7)将通过步骤(1)-(3)制得的失活宿主菌和通过步骤(4)-(6)制得的噬菌蛭弧菌按比例1∶10-1∶10万悬浮在含有微量元素含量Ca为1.0-10.0mg/l，Mg为2.0-11.0mg/l，Zn为2.0-15mg/l，Fe为0.1-1.5mg/l的稀释液中，37-43℃培育10-24小时，校正其PH值为3.0-9.8范围内，即得生物制菌液。
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