CN101643714B

CN101643714B - 一种防治乳腺炎的蛭弧菌菌株及其应用

Info

Publication number: CN101643714B
Application number: CN2009100422746A
Authority: CN
Inventors: 蔡俊鹏; 鲁锋; 蒋小平
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2009-08-28
Filing date: 2009-08-28
Publication date: 2011-09-21
Anticipated expiration: 2029-08-28
Also published as: CN101643714A

Abstract

本发明公开了一种防治乳腺炎的蛭弧菌菌株及其应用。本发明分离得到一株在电子显微镜下观察呈单细胞，弧形，大小为0.9×0.25μm，端生鞭毛，鞭毛长度为4μm的蛭弧菌BDS01。将其以双层平板法于28℃培养四天可形成直径1～2mm的透明圆形噬菌斑。应用蛭弧菌BDS01蛭质体制备的微生物制剂对预防奶牛乳腺炎的发生有良好的效果。与游泳体相比，蛭质体具有制备、保存更为方便，环境耐受力强，杀菌作用时间虽略慢但更久等特点，并且蛭弧菌蛭质体对奶牛无毒副作用，因此含有蛭弧菌BDS01蛭质体的微生物制剂适合于奶牛大规模工厂化养殖，可以为牛奶的绿色加工生产提供保障并且为防治乳腺炎提供了一种新方法。

Description

一种防治乳腺炎的蛭弧菌菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一种蛭弧菌，特别涉及一种防治乳腺炎的蛭弧菌菌株及其应用。

背景技术

奶牛乳腺炎(也叫乳房炎)是奶牛最常见的三大疾病之一，它不仅严重影响奶牛的产乳量和乳品质，而且危及人的健康。我国每年因隐性乳腺炎造成的损失约达1.35亿元人民币，在世界范围内，每年损失估计可达380万t牛奶。我国乳腺炎的发病率高于世界平均水平，包括隐性型乳腺炎在内的发病率平均为70％。由此可见，奶牛乳腺炎对奶牛业的危害极大。

病原体感染是引起乳腺炎的主要原因，有细菌、真菌、病毒、支原体等。其中主要的致病菌是细菌，常见的有金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌属和支原体。葡萄球菌和链球菌是临床型乳腺炎的主要病原菌，占50％以上，其次是大肠杆菌。这三种病原菌所致的乳腺炎常年发生，其它病原菌所致的乳腺炎多为散发或继发。

目前常规的防治乳腺炎的方法主要有干乳期在奶牛乳腺内灌注抗生素，抗生素可根据当地流行病菌选择最佳药物，直接将药物注入乳内，药物浓度高，吸收快，疗效好。但缺点是可能会对乳腺组织产生刺激性，会引发新的炎症。如果长期大量使用抗生素会使致病菌耐药菌株增加，一些乳腺炎病例变得难以用常规方法治愈。此外，牛奶中抗生素残留会影响牛奶品质。因此市场不允许出售抗生素残留过量的牛奶，同时也造成牛奶生产者的经济损失。

中草药防治乳腺炎具有无药物残留、经济效益高的优点，但有见效慢的缺点。基因工程疫苗采用疫苗防治乳腺炎的发生是较为安全、有效的方法。但是利用疫苗防治牛乳腺炎最常见的问题是细菌抗原的变异，造成疫苗在第一年效果很好，第二年却失去作用。其它的一些疗法包括，乳腺按摩、食物疗法和同种疗法等，它们的主要优点是没有副作用和不会造成牛奶中药物的残留问题，致病菌不会产生抗药性。但是，这些疗法中大部分都耗时、耗力、还需要把病牛单独处理。它们不适应现代化的规模养殖，生产效率较低。

实验表明使用常规消毒剂生石灰、火碱、煤酚皂溶液、新洁尔灭等消毒奶牛养殖环境，可以大大降低奶牛乳腺炎的发病率，并且操作简便容易、起效快。但是这些常规消毒剂与牛粪、饲料残渣等有机物直接接触，造成消毒剂被大量的有机物所消耗，妨碍药物作用的发挥，大大降低了药物对病原微生物的杀灭作用，需要消耗大剂量的消毒药物。常规消毒剂是化学作用杀菌，如果喷洒到奶牛身体，会对奶牛的身体健康造成威胁，也可能会污染牛奶，在牛奶中残留从而影响牛奶品质。

蛭弧菌是寄生于其他细菌，并能导致宿主细菌裂解的一类细菌；比一般细菌小，能通过细菌滤器，有类似噬菌体的作用；单细胞，呈弧形或逗点状，有时呈螺旋状，大小0.2～0.6×0.8～1.2微米，端生鞭毛，多为一根；革兰氏染色呈阴性，可以裂解革兰氏阴性菌。我们的最新研究表明，有些蛭弧菌可以裂解包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、停乳链球菌等一些常见奶牛乳腺炎致病菌。蛭弧菌的生活史分两个阶段：自由生活，能运动，不进行增殖的游泳体阶段和在特定宿主细菌的周质空间内进行生长繁殖的蛭质体阶段。蛭弧菌在游泳体阶段，识别并与宿主发生不可逆结合，然后侵入宿主。蛭弧菌进入宿主菌细胞周质空间后，主要通过降解宿主细胞的大分子成为单体，然后摄入并用于其自身的生物大分子的合成。随着细胞增殖和水解酶产生，使宿主细胞壁膜被破坏，从而裂解释放出蛭弧菌。

蛭弧菌蛭质体是蛭弧菌在特定宿主细菌的周质空间内进行生长繁殖的形式。与游泳体相比，蛭质体具有制备、保存更为方便，环境耐受力强，杀菌作用时间虽略慢但更久等特点。这些特性使得蛭弧菌蛭质体同样适合作为抑止或清除生物体及其环境中致病菌的生物净化因子，从而克服了抗生素滥用带来的副作用和常规消毒剂对奶牛和牛奶品质的不利影响。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种防治乳腺炎的蛭弧菌菌株。

本发明的另一目的在于提供所述蛭弧菌菌株的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种防治乳腺炎的蛭弧菌菌株，为蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDS01，于2009年8月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 209169。

对所述蛭弧菌BDS01进行负染后于电子显微镜下形态观察(见图1)：BDS01呈单细胞，弧形，大小为0.9×0.25μm，端生鞭毛，鞭毛长度为4μm；所述蛭弧菌BDS01以双层平板法于28℃培养四天可形成直径1～2mm的透明圆形噬菌斑；

所述蛭弧菌BDS01在pH值为6.5～7.7的范围具有良好的生长活性，其最佳pH为7.1；其对环境中的盐度变化敏感，适应范围在0％～0.5％之间，最佳生长盐度为0％；其温度生长范围为15～40℃，最适温度为30℃；

所述蛭弧菌BDS01的16S-ITS rDNA序列如下(序列表SEQ ID：No.1所示)： CAGGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGGGTAGCAATACCTAGTGGCGCACGGGTGAGTAACGCGTGGATAATCTGCCTTAGAGTGGGGGATAACTAGTC G AAAGATTAGCTAATACCGCATAAGACCACAAGAGCTGCGGCTCAAGGGGTCAAAGGTTTTTCGCTCTAAGATGAGTCCGCGTAAGATTAGCTAGTTGG TG AGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCTTTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAG CAG TAGGGAATATTGCACAATGGAGGAAACTCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCTTCGGGTCGTAAAGCTCTGTCGCAGGGGAATAAC ACAA TGAATGTACCCTGTAAGAAAGGATCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAAGACGAGGGATCCTAGCGTTGTTCGGAATCATTGGGCGTAAA GCGGG TGTAGGTGGCTTTGTAAGTCAGGTGTGAAAGCCTAGGGCTCAACCCTAGAAGTGCATTTGATACTGCGAAGCTTGAGTGCTAGAGAGGTTACTA GAATTG TTGGTGTAGTGGTGAAATACGTAGATATCAACAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGGTAACTGGCTAGACACTGACACTCAGACCCGAAAGCGT GGGGATC AAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGGATACTTGTTGTTGGAGGTATTGACCCCTTCAGTGWCGAAGCTAACGCGT TAAGTATC CCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGAAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAA CGCGAAGAA CCTTACCTAGGCTTGACATGTACTGGAAGATTGGCAGAAATGTCGTCGCCCGCAAGGGTCGGTACACAGGTGCTGCACGGCTGTCGTCAG CTCGTGTCGT AAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTGCATTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAGATGGACTGCCGGTGTT

一种防治乳腺炎的微生物制剂，包含所述的蛭弧菌BDS01蛭质体；

所述的微生物制剂还含有蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDS02蛭质体；

所述蛭弧菌BDS02于2009年8月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 209170；将所述蛭弧菌BDS02进行负染后于电子显微镜下形态观察：BDS02呈单细胞，弧形，大小为0.65×0.2μm，端生鞭毛，鞭毛长度至少1.8μm；所述蛭弧菌BDS02以双层平板法于28℃培养四天可形成直径1～2mm的透明圆形噬菌斑；

所述的蛭质体通过以下方法得到：在含有宿主菌的DNB(dilute nutrientbroth)液体培养基(营养肉汤0.8g，酪蛋白酸水解物0.5g，酵母精提物0.1g，溶于1000ml蒸馏水中，pH值为7.2～7.6)中接入蛭弧菌，于20～35℃、150～300rpm培养36～48h，培养液经4℃6000～8000rpm离心15～20min后，去除含蛭弧菌游泳体的上清，沉淀即是蛭质体；

所述蛭质体优选用DNB液体培养基(营养肉汤0.8g，酪蛋白酸水解物0.5g，酵母精提物0.1g，溶于1000ml蒸馏水中，pH值为7.2～7.6)、水、生理盐水或0.2mol/L pH值为7.2～7.6的磷酸盐缓冲液悬浮；

所述宿主菌为乳腺炎致病菌，优选奶牛乳腺炎致病菌；

所述奶牛乳腺炎致病菌包括能引起奶牛乳腺炎的大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)和停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)；

所述微生物制剂优选蛭弧菌BDS01蛭质体和蛭弧菌BDS02蛭质体按细菌数1∶1混合；

所述微生物制剂应用于防治乳腺炎，是通过消除乳腺炎致病菌达到防治乳腺炎的目的；

所述乳腺炎优选为奶牛乳腺炎；

所述微生物制剂用于防治乳腺炎时，奶牛为健康奶牛，是要在每次挤奶前后以浸泡冲洗、或喷洒的方法处理奶牛的乳腺，若浸泡冲洗，时间为1min；若喷洒，将奶牛乳腺均匀喷洒两遍，要做到不留死角；挤奶后用蛭弧菌液浸泡或喷洒乳腺能及时封闭处于开张状态的乳头孔，防止细菌的进入；其中的蛭弧菌蛭质体浓度至少达到10³pfu/ml，其优选范围为10⁵～10⁸pfu/ml；

所述微生物制剂用于防治乳腺炎，可将所述微生物制剂处理奶牛养殖环境、奶牛饲料和饮用水等；

所述微生物制剂是以喷洒方式处理奶牛养殖环境包括牛舍，地面及牛床粪尿沟等；其中的蛭弧菌蛭质体的浓度至少达到10²pfu/ml，其优选范围为10³～10⁶pfu/ml；

所述微生物制剂加入到奶牛饲料和奶牛饮用水中；蛭弧菌蛭质体的使用浓度应大于10²pfu/ml；直接用于饲料时，其使用量至少达到15ml/kg，优选使用量范围为20～35ml/kg；应用于饮用水，其使用量至少达到100ml/m³。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

1、本发明所述防治乳腺炎的微生物制剂在防治奶牛的乳腺炎的效果显著。

如表3所示，本发明中所述防治乳腺炎的微生物制剂对奶牛乳腺炎的发病率有良好的控制效果。

2、本发明所述防治乳腺炎的微生物制剂在防治乳腺炎应用中安全性好。

微生物制剂中蛭弧菌蛭质体通过裂解而消除可引起奶牛乳腺炎致病菌的方法是生物方法。蛭弧菌蛭质体可侵染、裂解宿主细菌的特性使之适合作为抑止或清除生物体及其环境中致病菌的生物净化因子，且其在裂解完宿主细菌后，会因饥饿而自动消亡，从而克服了抗生素滥用带来的副作用和常规消毒剂对奶牛和牛奶品质的不利影响。

3、含有本发明所述防治乳腺炎的微生物制剂适合推广应用于奶牛养殖过程

蛭弧菌蛭质体对人和奶牛无毒副作用。适合于奶牛大规模工厂化养殖，可以为牛奶的绿色加工生产提供保障并且为防治乳腺炎提供了一种新方法。

4、含有本发明所述防治乳腺炎的微生物制剂适用范围广，对人也可适用。

附图说明

图1是蛭弧菌BDS01于电镜下观察的形态图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(1)蛭弧菌BDS01的分离纯化

将宿主菌大肠杆菌(Escherichia coli，购自广东省微生物菌种保藏中心，编号GIM 1.137)接种于含100mL灭菌LB((Luria-Bertani))液体培养基(蛋白胨10g，酵母膏5g，蒸馏水1000mL，pH 7.2)的三角瓶中，置于转速为200rpm，温度为28℃的恒温摇床中培养14h，使其处于对数生长期。培养液在4℃温度条件下，以6000rpm速度离心20min，弃去上清液，沉淀下来的菌体用1mL DNB(dilute nutrient broth)液体培养基(营养肉汤0.8g，酪蛋白酸水解物0.5g，酵母精提物0.1g，溶于1000ml蒸馏水中，pH值为7.2～7.6)重新悬浮后(浓度约为3×10¹²cfu/mL)置于4℃冰箱，待用。

对采集的土壤进行预处理，取土壤泥样约3g加入到含50mL灭菌DNB液体培养基(营养肉汤0.8g，酪蛋白酸水解物0.5g，酵母精提物0.1g，溶于1000ml蒸馏水中，pH值为7.2～7.6)的三角瓶中，同时加入已制备好的增殖蛭弧菌的大肠杆菌菌悬液0.5mL，将三角瓶置于转速为200rpm，温度为28℃的恒温摇床中培养36h，培养液先在4℃，1500rpm离心15min离心去泥渣，后6000rpm离心20min去宿主，上清液再在4℃ 16000rpm速度离心20min，弃去上清液，沉淀物用1mL DNB液体培养基(营养肉汤0.8g，酪蛋白酸水解物0.5g，酵母精提物0.1g，溶于1000ml蒸馏水中，pH值为7.2～7.6)重新悬浮，成为样品浓缩液。

采用双层平板法：取0.5mL样品浓缩液和0.5mL大肠杆菌悬浮液混合，此混合液再与3-3.5mL 50℃的DNB上层培养基(蒸馏水500mL，pH7.2，琼脂粉3.5g)混合均匀，倾注于DNB下层平板(营养肉汤0.8g，酪蛋白酸水解物0.5g，酵母精提物0.1g，蒸馏水1000mL，pH7.2，琼脂粉17g)中并铺平。将双层平板置于28℃恒温培养箱中培养，每隔12h观测实验结果。待含宿主菌的双层琼脂平板上出现噬菌斑，挑取不断扩大的单斑，加入到含有50mL DNB液体培养基(营养肉汤0.8g，酪蛋白酸水解物0.5g，酵母精提物0.1g，溶于1000ml蒸馏水中，pH值为7.2～7.6)的三角瓶中悬浮，同时加入0.5mL相应的宿主菌悬浮液，置于转速为200rpm，温度为28℃的恒温摇床中连续培养30h。然后，培养液在4℃温度条件下，以6000rpm的速度离心20min，上清液在4℃温度条件下，再以16000rpm的速度离心20min，倾倒双层琼脂平板检验，再次挑取不断扩大的单斑，并重复若干次，至单噬菌斑传代形成形状、大小、透明度均一致的噬菌斑即为一株蛭弧菌纯菌株。挑选形状规则、透明度高且噬菌斑最大的噬菌斑，命名为蛭弧菌BDS01。将其进行负染后于电子显微镜下形态观察(图1)：蛭弧菌BDS01呈单细胞，弧形，大小为0.9×0.25μm，端生鞭毛，鞭毛长度为4μm。将蛭弧菌BDS01以双层平板法于28℃培养四天可形成直径1～2mm的透明圆形噬菌斑。根据伯杰氏手册(Bergey’s Manual)对蛭弧菌的描述：蛭弧菌是寄生于其他细菌上的细菌，在寄生阶段、细胞呈单个、小、弯曲、运动的杆状，极生鞭毛运动，鞭毛有鞘。据此可以得知，分离得到的蛭弧菌BDS01为Bdellovibrio sp.。应用DNA试剂盒提取蛭弧菌BDS01的基因组DNA，扩增其16S rDNA。通过测序和拼接后(见序列表SEQ ID No.1)在GenBank中进行同源性搜索，比对结果显示蛭弧菌BDS01的16S-ITS rDNA与其他已经公开的蛭弧菌16S rDNA序列相似度高，但不完全相同，说明蛭弧菌BDS01是首次分离得到。所述蛭弧菌BDS01于2009年8月7日在位于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 209169。

对蛭弧菌BDS01的生理参数进行测定：A、蛭弧菌BDS01在pH值为6.5～7.7的范围具有良好的生长活性，其最佳pH为7.1；B、蛭弧菌BDS01对环境中的盐度变化敏感，其适应范围在0％～0.5％之间，最佳生长盐度为0％；C、蛭弧菌BDS01温度生长范围为15～40℃，最适温度为30℃。

(2)防治乳腺炎的微生物制剂的制备

分别在2个装有100mL LB液体培养基的锥形瓶中接种大肠杆菌(购自广东省微生物菌种保藏中心，编号GIM 1.137)，200rpm、28℃摇床培养18小时，培养液分别于4℃、5000rpm离心15min，弃上清。分别将沉淀加入到2个装有100mL DNB液体培养基(营养肉汤0.8g，酪蛋白酸水解物0.5g，酵母精提物0.1g，溶于1000ml蒸馏水中，pH值为7.2～7.6)的锥形瓶中，再分别加入从双层平板上挑取的蛭弧菌BDS01的噬菌斑和蛭弧菌BDS02的噬菌斑。恒温摇床250rpm、28℃培养36h。培养液分别于4℃6000rpm离心20min，去除含蛭弧菌游泳体的上清，保留沉淀(即蛭弧菌蛭质体)，加入DNB液体培养基(营养肉汤0.8g，酪蛋白酸水解物0.5g，酵母精提物0.1g，溶于1000ml蒸馏水中，pH值为7.2～7.6)重新悬浮蛭弧菌蛭质体。

微生物制剂A由浓度为10²pfu/ml的蛭弧菌BDS01蛭质体和浓度为10²pfu/ml的蛭弧菌BDS02蛭质体按细菌数1∶1混合组成。

微生物制剂B由浓度为10³pfu/ml的蛭弧菌BDS01蛭质体和浓度为10³pfu/ml的蛭弧菌BDS02蛭质体按细菌数1∶1混合组成。

(2)防治乳腺炎的微生物制剂预防奶牛乳腺炎发生的效果：

100头奶牛为一组进行实验。

一组用步骤(1)制备的微生物制剂A消毒养殖环境，每个月喷洒两次。设置对照组，对照组(也是由100头奶牛组成)用常规消毒剂(质量百分比4％甲酚皂)消毒，每个月消毒两次。一个月后观察奶牛乳腺炎的发病率。

一组用步骤(1)制备的微生物制剂A消毒养殖环境且每次挤奶前后均用步骤(1)制备的微生物制剂B均匀喷洒乳腺两遍，对养殖环境消毒时，每个月喷洒两次。设置对照组，对照组(也是由100头奶牛组成)中用常规消毒剂(质量百分比4％甲酚皂)消毒养殖环境时每个月消毒两次，且每次挤奶前后均用体积百分比75％的酒精擦拭乳腺。一个月后观察奶牛乳腺炎的发病率。

一组用微生物制剂消毒养殖环境、饲料、饮用水以及乳腺：用步骤(1)制备的微生物制剂A对环境消毒时，每个月喷洒两次；奶牛喂食前24h用步骤

(1)制备的微生物制剂A分别按30ml/kg的量加入到饲料中以及按10ml/100ml的量加入到奶牛饮用水用中；每次挤奶前后均用步骤(1)制备的微生物制剂B均匀喷洒乳腺两遍。设置对照组(也是由100头奶牛组成)，用常规消毒剂(质量百分比4％甲酚皂)消毒养殖环境时每个月消毒两次；奶牛喂食前24h在饲料中加入抗生素添加剂杆菌肽锌(商品名：雅来益力素，原粉，1kg/袋，购于济南鑫源兽药原料有限公司)1000g/吨以及在饮用水中按10mg/100ml加入二氧化氯消毒粉；每次挤奶前后用体积百分比75％的酒精擦拭乳腺。一个月后观察奶牛乳腺炎的发病率。

一组为空白组，即不做任何处理，一个月后观察奶牛乳腺炎的发病率。

养殖环境消毒应包括牛棚地面、牛栏、牛床、饲养用具和粪尿沟等。

显性乳腺炎的检测通过观察，奶牛泌乳量下降、乳房肿胀和乳房的炎症反应，乳中有凝块或颜色改变，乳区肿胀，成捏粉样，并伴有异常分泌；或表现为乳区发炎、肿胀、坚实等。

隐性乳房炎的检测采用国际乳业联合会(IDF)推荐采用的体细胞计数法来快速、简便、准确地判断。牛乳体细胞数推荐分级标准的具体规定见表1。具体测试过程：首先用体积百分比75％酒精清洗每一个乳头端，并弃去第1-2把乳汁，取每一个乳头所挤的2-5mL乳放入相应的小平皿中。在每一个小平皿中加入定量检测试剂，即可根据反应现象和美国加利福尼亚乳房测试法(CMT法)判定标准进行判断。CMT法判定标准见表2。

表1牛乳体细胞数分级标准

表2CMT法判定标准

注：分娩后1周内或泌乳后期的母牛都会出现强阳性反应，即初乳期和泌乳末期乳中体细胞数均出现生理性升高，故该法不适于检查初乳期和泌乳末期的乳样。

结果如表3所示，微生物制剂消毒组预防奶牛乳腺炎的效果要明显好于常规消毒组。使用微生物制剂同时处理养殖环境和奶牛乳腺，奶牛乳腺炎发病率大幅下降，说明奶牛乳腺上的致病菌是导致奶牛乳腺炎的最主要原因。总体来说，如果奶牛养殖环境、乳腺和饲料乃至饮用水均用蛭弧菌液处理，则可以较好地控制奶牛乳腺炎的发生。不做任何处理组的发病率达到了28％。说明奶牛乳腺炎的防治关键在于预防，要始终贯彻“以防为主”的观念，防患于未然。而实验表明蛭弧菌蛭质体对乳腺炎致病菌有很强的裂解能力，预防效果明显。

表3不同消除层次，微生物制剂控制奶牛乳腺炎发病率的效果

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110>华南理工大学

<120>一种防治乳腺炎的蛭弧菌菌株及其应用

<130>5

<160>1

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>1838

<212>DNA

<213>蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)

<220>

<221>misc_feature

<222>(778)..(778)

<223>w＝a或t

<400>1

caggcctaac acatgcaagt cgaacggggt agcaatacct agtggcgcac gggtgagtaa 60

cgcgtggata atctgcctta gagtggggga taactagtcg aaagattagc taataccgca 120

taagaccaca agagctgcgg ctcaaggggt caaaggtttt tcgctctaag atgagtccgc 180

gtaagattag ctagttggtg aggtaatggc tcaccaaggc gacgatcttt aactggtctg 240

agaggatgat cagtcacact ggaactgaga cacggtccag actcctacgg gaggcagcag 300

tagggaatat tgcacaatgg aggaaactct gatgcagcga cgccgcgtga gtgatgaagg 360

ccttcgggtc gtaaagctct gtcgcagggg aataacacaa tgaatgtacc ctgtaagaaa 420

ggatcggcta acttcgtgcc agcagccgcg gtaagacgag ggatcctagc gttgttcgga 480

atcattgggc gtaaagcggg tgtaggtggc tttgtaagtc aggtgtgaaa gcctagggct 540

caaccctaga agtgcatttg atactgcgaa gcttgagtgc tagagaggtt actagaattg 600

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tggctagaca ctgacactca gacccgaaag cgtggggatc aaacaggatt agataccctg 720

gtagtccacg ccgtaaacga tggatacttg ttgttggagg tattgacccc ttcagtgwcg 780

aagctaacgc gttaagtatc ccgcctgggg agtacggtcg caagattaaa actcaaagaa 840

attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgatgca acgcgaagaa 900

ccttacctag gcttgacatg tactggaaga ttggcagaaa tgtcgtcgcc cgcaagggtc 960

ggtacacagg tgctgcacgg ctgtcgtcag ctcgtgtcgt aagatgttgg gttaagtccc 1020

gcaacgagcg caacccctgc atttagttgc cagcattcag ttgggcactc tagatggact 1080

gccggtgtta aaccggagga aggtggggat gacgtcaagt cctcatggcc cttatgccta 1140

gggctacaca cgtgctacaa tggtagtcac agagcgaagc taagccgcga ggtagagcaa 1200

atcgcttaaa agctatctaa gttcagattg atctctgcaa ctcgagatca tgaagttgga 1260

atcgctagtg atcgcggatc agaatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac 1320

cgcccgtcac accatgaaag tcggctgtac cagaagtcgc tgcgctaacc gtaaggaggc 1380

aggcgcccaa ggtatgatcg atgattgggg tgaagtcgta acaaggtagc cgtaggggaa 1440

cctgcggctg gatcacctcc tttctaagga ttatccggtc aatcttcact aagacttgtt 1500

cttagtaagt taaaatgacc caatcttagg tcagcttact cttcccgagt aagtgagtcc 1560

caaaaatcta tctagctgtt tagttttgag agagtgaagc ctaacgggcc tgtagctcag 1620

ttggttagag cacacgcttg ataagcgtgg ggtcggaagt tcgagtcttc ccaggcctac 1680

caagttctac tgacggttga atgcggtgta agttagtgtt ttacgtgaac aagtttttgt 1740

tctttgacaa ttgaatagat tgatttagtt gatttttagc gaggttagtt ccattttttt 1800

aagctacaaa gggcttacgg tggatgcctt ggcagtca 1838

Claims

1.一种防治乳腺炎的蛭弧菌菌株，其特征在于：所述蛭弧菌菌株为蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDS01，于2009年8月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 209169。

2.一种防治乳腺炎的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂含有权利要求1所述的蛭弧菌BDS01蛭质体。

3.根据权利要求2所述的微生物制剂，其特征在于：所述的微生物制剂还含有蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDS02蛭质体；所述蛭弧菌BDS02于2009年8月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M 209170。

4.根据权利要求3所述的微生物制剂，其特征在于：所述微生物制剂中蛭弧菌BDS01蛭质体和蛭弧菌BDS02蛭质体按细菌数1∶1混合。

5.根据权利要求2～4任一项所述的微生物制剂，其特征在于：所述的蛭质体通过以下方法制备得到：在含有宿主菌的DNB液体培养基中接入蛭弧菌，于25～35℃、150～300rpm培养36～48h，培养液经4℃6000～8000rpm离心15～20min后，去除含蛭弧菌游泳体的上清，沉淀即是蛭质体；

所述DNB液体培养基通过以下步骤得到：营养肉汤0.8g，酪蛋白酸水解物0.5g和酵母精提物0.1g，溶于1000ml蒸馏水中，pH值为7.2～7.6。