CN104962577A - 芽胞杆菌一锅法分子育种方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种芽胞杆菌一锅法分子育种技术及其应用，该方法利用酵母体内重组系统，不需要额外的连接酶即可将几个DNA片段连接在一起形成环状。这些DNA片段需要经过特异的引物，利用PCR技术扩增而成。功能可分为靶基因片段、复制因子片段及筛选标记等，以便于在几个不同的宿主中复制繁殖。该方法可以一次性获得靶基因的多个拷贝数或者同时将几个不同的功能区域进行排列组合，使重组菌获得多功能性。此方法快速可靠，操作简单，节约成本，重复性好，尤其适合于实验室内的芽胞杆菌分子育种工作，对于快速的改造目标菌株，使其获得优良性状具有重要的指导意义及应用价值。

Description

芽胞杆菌一锅法分子育种方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物与新医药技术领域，具体涉及一种芽胞杆菌一锅法分子育种方法及其应用。

背景技术

组合生物合成(Combinatorial Biosynthesis)是近年发展起来的一种扩展天然产物结构多样性、以满足药物发现和发展的新方法。它以微生物作为“细胞工厂，”通过对天然产物代谢途径的遗传控制来生物合成新型复杂化合物，并采用微生物发酵的方式达到大量生产的目的：一方面特异性地遗传修饰天然产物的生物合成途径，以此获得基因重组菌株，生产所需要的天然产物及其结构类似物；另一方面，将不同来源的天然产物生物合成基因进行重组，在微生物体内建立组合的新型代谢途径，由此重组微生物库所产生的新型天然产物构成的类似物库，有利于从中发现和发展更具有应用价值的药物。与化学合成相比，目的代谢产物可以由获得的重组菌株发酵大量生产，因而可以降低生产成本和减少环境污染。近年来国际上针对抗生素代谢途径的组合生物合成取得了显著进展，一些重要抗生素的产量获得明显提高，大量复杂药物的结构类似物作为新型的微生物代谢产物被生物合成。作为一种发现和发展新药的新途径，组合生物合成的巨大影响力无论是在学术研究还是工业领域，正逐渐为科学家们所认同。它的成功运用，关键是在基因和蛋白功能水平上认识和理解复杂抗生素的生物合成及其调控机制，这是在微生物体内针对代谢途径进行遗传操作的分子和生化基础。而将这种技术应用到微生物的分子育种中已成为目前研究的热点。

芽胞杆菌常规育种包括物理诱变、化学诱变、分子诱变等，由于筛选工作量巨大、筛选时间长、效果不显著，急需要更加快捷、目的明确、功能多样的新的育种方法。一锅法分子育种技术利用了组合生物合成的原理，在芽胞杆菌种群内实现了表达，对于增加芽胞杆菌杀虫基因的拷贝数、拓宽杀虫谱及提高杀虫活性具有非常重要的应用前景。

发明内容

本发明的目的是针对上述现状，旨在提供一种芽胞杆菌一锅法分子育种方法，该方法能够快速增加芽胞杆菌目的基因的拷贝数，在转入杀虫基因的情况下，可拓宽杀虫谱及提高杀虫活性。快速可靠，操作简单，节约成本，重复性好。

本发明的另一个目的在提供一种芽胞杆菌一锅法分子育种方法在制备多拷贝杀虫基因芽胞杆菌中的应用。

本发明的最后一个目的在提供一种芽胞杆菌一锅法分子育种方法在制备多种杀虫功能芽胞杆菌中的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

芽胞杆菌一锅法分子育种方法，包括：

①特异引物的设计。

每条引物数量在50-60个碱基，正义链引物起始序列需要为上游片段的尾端序列35-40个碱基，剩余的碱基数为目的片段自身前端序列20-25个碱基；反义链引物序列为下游片段的前端序列35-40个碱基，剩余的碱基数为目的片段自身尾端序列约为20-25个碱基，每条引物间保持G+C％值相等或相差不超过5℃。

②PCR反应。

根据设计好的引物，分别扩增每个功能片段。

③各片段的纯化。

④酵母菌的转化与重组子的筛选。

将PCR片段混合物进行酵母菌的电转化，并通过双抗平板及验证PCR反应进行重组子的筛选鉴定。

⑤芽胞杆菌的转化与重组子的筛选与鉴定。

提取质粒，进行芽胞杆菌的电转化，并通过抗性平板和PCR进行重组子的鉴定。

以上所述方案中，优选的，步骤③中，将PCR扩增获得的产物利用PCR产物回收试剂盒回收纯化后，按照载体片段：外源目的片段＝1:3的体积比进行混合，混合物终浓度为20μg/mL，混合物进行除盐纯化。

以上所述方案中，优选的，步骤⑤中，芽胞杆菌的步骤包括：

将芽胞杆菌单菌落过夜活化，按1/100(V/V)的接种量转接至50mL新鲜的LB培养液，于30℃以200r/min的转速振荡培养至对数生长中期，培养液冰浴20-30min后4 000r/min离心5min收集菌体，并用预冷的EP缓冲液洗涤菌体3-4次，最后1次重悬于1mL预冷的SG缓冲液中。SG buffer：272mM蔗糖+15％甘油。EP buffer：SG buffer+0.5mM MgCl2+磷酸钾缓冲液(pH 7.0)。在预冷的转化杯中，加入上述感受态细胞100μL，再加入一定的供体质粒DNA(5-10μL，供体质粒浓度是5-10μg/μL)，混匀后在冰上放置10min，用电脉冲仪进行电脉冲。电击条件为2.0-2.5kV，电击1次。电脉冲完毕后，加入0.8mL LB培养液于电转化杯中，并在30℃以150r/min恢复培养2h后，涂布LB抗性平板，每皿涂100-200μL置30℃培养，以观察抗性菌落的出现。通过抗性平板和PCR进行重组子的验证，即得转化了重组子的芽胞杆菌。

芽胞杆菌一锅法分子育种方法在制备多拷贝杀虫基因芽胞杆菌中的应用，优选的利用本发明提供的方法将多拷贝的cry1Ac基因转入苏云金芽胞杆菌NBIC-380；优选的，将多拷贝的cry5B基因(SEQ ID NO.1所示)转入苏云金芽胞杆菌NBIN-863。

芽胞杆菌一锅法分子育种方法在制备多种杀虫功能芽胞杆菌中的应用，优选的，利用本发明提供的方法将cry1Ac基因和vip3A基因转入枯草芽胞杆菌168。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1)本发明所述技术为国际首创，在不使用任何连接酶的情况下，能够快速增加芽胞杆菌目的基因的拷贝数，在转入杀虫基因的情况下，可拓宽杀虫谱及提高杀虫活性。快速可靠，操作简单，节约成本，重复性好，尤其适合于实验室内的芽胞杆菌分子育种工作，对于快速的改造目标菌株，使其获得优良性状具有重要的指导意义及应用价值。

2)利用本发明提供引物设计方案，方案合理，设计的引物容易成环，方便操作。

3)由于芽胞杆菌自身排异系统的存在，将质粒尤其是较大的质粒转化进野生型芽胞杆菌菌株中是比较困难的，本发明针对这一问题，提供了将较大质粒转化进芽胞杆菌的方法，该方法成功率高，适合推广。

4)本发明提供的方法利用酵母体内重组系统，不需要额外的连接酶即可将几个DNA片段连接在一起形成环状。这些DNA片段需要经过特异的引物，利用PCR技术扩增而成。功能可分为靶基因片段、复制因子片段及筛选标记等，以便于在几个不同的宿主中复制繁殖。该方法可以一次性获得靶基因的多个拷贝数或者同时将几个不同的功能区域进行排列组合，使重组菌获得多功能性。此方法快速可靠，操作简单，节约成本，重复性好，尤其适合于实验室内的芽胞杆菌分子育种工作，对于快速的改造目标菌株，使其获得优良性状具有重要的指导意义及应用价值。

附图说明

图1为一锅法分子育种方法引物设计示意图。

图2为pHBERC029质粒图谱。

图3为PCR验证图。

A：各片段PCR扩增图。M：λHindIII/DL2000 marker；1-4：cry1Ac基因片段；5-6：芽胞杆菌复制子及筛选标记；7-8：酵母载体。B：质粒pHBERC029 HindIII和BamHI双酶切凝胶电泳图。

图4为重组菌NBIC-381上清液的SDS-PAGE图谱。M：宽分子量蛋白marker；1：重组菌NBIC-381上清液蛋白。

图5为pHBERC-8630质粒图谱。

图6为PCR验证图。

A：各片段PCR扩增图。M：λHindIII marker；1-3：cry5B基因片段；4：BAC片段；5：pYES2片段。B：cry5B基因拷贝数验证图。M1：5kb ladder marker；M2：λHindIII marker；1：cry5B基因片段。

图7为pHBERC-VIP300质粒图谱。

图8为PCR验证图。

A：各片段PCR扩增图。M：λHindIII marker；1：vip3A基因片段；2：cry1Ac片段；3：BAc片段；4：pYES2片段。B：基因验证图。M：λHindIII marker；1：1：vip3A基因片段；2：cry1Ac片段。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂或原料或菌株，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

芽胞杆菌一锅法分子育种方法在制备多拷贝杀玉米螟基因芽胞杆菌中的应用，包括以下步骤：1)芽胞杆菌杀虫基因cry1Ac多拷贝表达载体pHBERC029的构建(图2)。

cry1Ac基因来源于苏云金芽胞杆菌NBIC-380菌株(田宇曦等，2014)，pYES2质粒购自Invitrogen公司，Erm和Ori60(在本申请中简称为BAC片段)来源于穿梭BAC质粒pEMB0557(Liu等，2009)。

2)PCR引物的设计

设计思路如下：

pYES2：正义链引物(pYES2-1)起始序列需要为上游片段cry1AY的尾端序列(3’端)39个碱基，剩余的碱基数为目的片段(pYES2)自身前端序列(5’端)20个碱基；反义链引物(pYES2-2)序列为下游片段BAC(主要包含Erm和Ori60两个基因片段)的前端序列39个碱基，剩余的碱基数为目的片段(pYES2)自身尾端序列约为20个碱基。

BAC：正义链引物(BAC-1)起始序列需要为上游片段pYES2的尾端序列39个碱基，剩余的碱基数为目的片段(BAC)自身前端序列20个碱基；反义链引物(BAC-2)序列为下游片段cry1A1的前端序列39个碱基，剩余的碱基数为目的片段(BAC)自身尾端序列约为20个碱基。

cry1A1：正义链引物(cry1A1-1)起始序列需要为上游片段BAC的尾端序列39个碱基，剩余的碱基数为目的片段(cry1A1)自身前端序列20个碱基；反义链引物(cry1A1-2)序列为下游片段cry1AN的前端序列39个碱基，剩余的碱基数为目的片段(cry1A1)自身尾端序列约为20个碱基。

cry1AN：正义链引物(cry1AN-1)起始序列需要为上游片段cry1A1的尾端序列39个碱基，剩余的碱基数为目的片段(cry1AN)自身前端序列20个碱基；反义链引物(cry1AN-2)序列为下游片段cry1AY的前端序列39个碱基，剩余的碱基数为目的片段(cry1AN)自身尾端序列约为20个碱基。

cry1AY：正义链引物(cry1AY-1)起始序列需要为上游片段cry1AN的尾端序列39个碱基，剩余的碱基数为目的片段(cry1AY)自身前端序列20个碱基；反义链引物(cry1AY-2)序列为下游片段pYES2的前端序列39个碱基，剩余的碱基数为目的片段(cry1AY)自身尾端序列约为20个碱基。

具体引物序列如下所示：

表1引物序列

3)各片段的PCR扩增。

每个片段均采用梯度PCR方法进行扩增，复性温度从50℃到60℃，30个循环，PCR酶选用KOD PLUS-NEO高保真酶(TOYOBO)，反应体系：总体积25μL，包括：10×buffter 2.5μL，2.5mM Mg²⁺2.5μL，2.5mM dNTP 3μL，引物1 1μL，引物2 1μL，模板DNA 1μL，KOD Taq酶0.2μL(1U)，灭菌去离子水13.8μL。反应条件：94℃5min，[94℃30sec，50℃-60℃30sec，72℃3-6min(根据不同片段大小决定，按照1min扩增1kb的原则选择)，30个循环]，72℃10min，4℃5min。最终获得了5个片段的PCR扩增产物，片段大小见表1。

4)PCR片段除盐。

将PCR产物纯化后，按照pYES2：BAC：cry1A1：cry1AN：cry1AY＝1:1:3:3:3的体积比进行混匀，在500uL离心管中加入溶好的0.1M葡萄糖+1％包埋块胶(即取500uL1M葡萄糖加入到4.5mL去离子水，再加入0.05g琼脂糖)，然后插入另一个新的500uL离心管，冷凝后拔出上面的离心管，将其放在紫外灯下晾干水分后，将连接产物加进小坑中，放于冰上1个小时。除盐后的混合物待做下一步的酵母菌的转化。

5)酵母菌的转化与重组子的筛选鉴定。

将PCR片段混合物进行酵母菌的电转化，并通过双抗平板进行重组子的筛选。详细步骤如下所述：

将酵母菌INVSc1(Invitrogen)单菌落接种于5mL YPD培养基中，30摄氏度过夜培养至饱和；转化前一天晚上，在装有50mL YPD培养基的250mL无菌烧瓶中接种适量的过夜培养液，于30℃剧烈振荡，直到细胞密度达到OD 600约为1.3～1.5。于4℃4000g离心收获培养细胞，细胞用10mL无菌水重悬。加入1mL，pH 7.5,10×TE缓冲液，摇晃均匀，再加10mL 10×乙酸锂，旋转摇匀，于30℃请摇晃45min.加入2.5mL 1mol/L DTT,并同时旋转摇动，于30℃轻轻摇动15min。将酵母菌悬液稀释在50mL无菌水中，洗涤3次，每次以4000～6000g于4℃离心沉淀细胞，以此重悬细胞，所用的溶液如下：第一次沉淀：25mL冰冷的水。第二次沉淀：2～3mL冰冷的1mol/L山梨醇。第三次沉淀：0.3mL冰冷的1mol/L山梨醇。最终的OD600应为约200。

电转化：在无菌冰冷的微量离心管中加入40μL酵母菌细胞和5μL 100ng待转化的混合物DNA，混匀。转移至冰冷的电转槽中往电击槽中加入1mL冰冷的1mol/L山梨醇，轻轻吹吸混匀，直接涂布在选择培养基平板上，于30℃培养3～6d，直到平板上出现菌落。

正确的重组子质粒命名为pHBERC029，含有氨苄青霉素(来源于pYES2片段)和红霉素(来源于BAC片段)两个抗生素筛选标记。抽提质粒pHBERC029，再进行PCR验证，确认本次重组质粒pHBERC029中含有cry1A片段的个数为2个，该质粒可以在大肠杆菌、酵母菌及芽胞杆菌三种宿主中进行复制(图3)。

按照酵母质粒提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，北京，中国)的操作说明进行质粒提取，用于转化苏云金芽胞杆菌。

6)pHBERC029转入苏云金芽胞杆菌NBIC-380中形成重组菌NBIC-381。

将cry1Ac多拷贝表达载体pHBERC029电转化进苏云金芽胞杆菌NBIC-380(田宇曦等，2014)。详细操作步骤如下：

将苏云金芽胞杆菌单菌落过夜活化，按1/100(V/V)的接种量转接至50mL新鲜的LB培养液，于30℃以200r/min的转速振荡培养至对数生长中期，培养液冰浴20-30min后4000r/min离心5min收集菌体，并用预冷的EP缓冲液洗涤菌体4次，最后1次重悬于1mL预冷的SG缓冲液中。SG buffer：272mM蔗糖+15％甘油。EP buffer：SG buffer+0.5mM MgCl2+磷酸钾缓冲液(pH 7.0)。

在预冷的转化杯(2cm，Bio-Rad产品)中，加入上述感受态细胞100μL，再加入一定的重组质粒pHBERC029(5μL，浓度是5μg/μL)，混匀后在冰上放置10min，用电脉冲仪进行电脉冲。电击条件为2.5kV，电击1次。电脉冲完毕后，加入0.8mL LB培养液于电转化杯中，并在30℃以150r/min恢复培养2h后，涂布LB抗性平板，每皿涂100-200μL置30℃培养，以观察抗性菌落的出现。通过抗性平板和PCR进行重组子的验证，获得的重组菌命名为NBIC-381。

对重组菌NBIC-381的上清液进行蛋白提取后，SDS-PAGE凝胶电泳显示cry1Ac表达了分子量大小约为100kDa的蛋白，如图4所示。

7)重组菌NBIC-381对玉米螟幼虫的杀虫活性比较。

将重组菌NBIC-381以及野生菌株NBIC-380分别做玉米螟幼虫的杀虫活性测定。生测结果显示：重组菌NBIC-381对玉米螟幼虫的LC₅₀值为3.65μg/mL，NBIC-380对玉米螟幼虫的LC₅₀值为10.42μg/mL，杀虫活性提高了3倍(见表2)。生测步骤如下：将发酵液冻干粉按照不同稀释浓度加入玉米螟的养虫饲料中，随机挑取玉米螟幼虫加入24孔板中，每孔接1-2头，每个样品10次重复，盖上铺有吹塑纸垫板的盖子，在25℃，RH＝70％，L：D＝14.5小时：9.5小时的条件下，感染7天后，检查结果，用牙签触动无反应者为死虫(死虫一般均变为黑褐色)。LC₅₀值计算利用LD50数据处理软件(蓝宙工作室Version 1.01，http://biodrug.51.net)。

表2不同菌株对玉米螟幼虫的活性测定

实施例2：

芽胞杆菌一锅法分子育种方法在制备多拷贝杀线虫基因芽胞杆菌中的应用，包括以下步骤：

1)芽胞杆菌杀线虫基因cry5B多拷贝表达载体pHBERC-8630的构建(图5)。

cry5B基因序列为SEQ ID NO.1所示。

2)PCR引物的设计

根据图5所示的载体图谱，按照实施例1所示的引物设计思路进行，具体PCR引物序列见表3。

表3引物序列

3)各片段的PCR扩增、PCR片段除盐、酵母菌的转化与重组子的筛选鉴定操作方法见实施例1中的3)～5)。经验证，获得的重组质粒pHBERC-8630含有3个杀线虫cry5B基因(图6)。

4)pHBERC8630转入苏云金芽胞杆菌NBIN-863中形成重组菌NBIN-8630。

将cry5B多拷贝表达载体pHBERC8630经过除盐纯化后，电转化进野生型高效杀线虫苏云金芽胞杆菌NBIN-863(该菌株已申请中国专利，专利申请号：201410137036.4)。详细操作步骤如下：

将苏云金芽胞杆菌单菌落过夜活化，按1/100(V/V)的接种量转接至50mL新鲜的LB+2％甘氨酸培养液，于30℃以200r/min的转速振荡培养至对数生长中期，培养液冰浴30min后4000r/min离心5min收集菌体，并用预冷的SG缓冲液洗涤菌体3-4次，最后1次重悬于1mL预冷的SG缓冲液中。

在预冷的转化杯(2cm，Bio-Rad产品)中，加入上述感受态细胞200μL，再加入10μL纯化后的质粒pHBERC8630 DNA(浓度是10μg/μL)，混匀后在冰上放置30min，用电脉冲仪进行电脉冲。电击条件为2.5kV，电击1次。电脉冲完毕后，加入0.8mL LB培养液于电转化杯中，并在30℃以150r/min恢复培养2h后，涂布LB抗性平板，每皿涂100-200μL置30℃培养，以观察抗性菌落的出现。通过抗性平板和PCR进行重组子的验证，获得的重组菌命名为NBIN-8630。

5)重组菌NBIN-8630对秀丽隐杆线虫的杀虫活性。

将重组菌NBIN-8630以及野生菌株NBIN-863分别做秀丽隐杆线虫的杀虫活性测定。生测结果显示：重组菌NBIN-8630对秀丽隐杆线虫的LC₅₀值为0.31μg/mL，NBIN-863对秀丽隐杆线虫的LC₅₀值为1.30μg/mL，杀虫活性提高了5倍(见表4)。生测步骤如下：200μL测试总体积：10μL样品+10uL大肠杆菌OP50+180μL线虫悬浮液(每μL3-4头虫)。将发酵液冻干粉稀释成2倍、4倍、8倍、16倍、32倍的浓度梯度，取10μL稀释液加入到96孔板中，再加入10μL大肠杆菌OP50和180μL线虫悬浮液(每μL 2-4头虫)，对照组加入10μL水+10μL大肠OP50+180μL线虫悬浮液，48h后解剖镜下观察线虫死活情况。LC₅₀值计算利用LD50数据处理软件(蓝宙工作室Version 1.01，http://biodrug.51.net)。

表4不同菌株对秀丽隐杆线虫的活性测定

实施例3：

芽胞杆菌一锅法分子育种方法在制备多种杀虫功能芽胞杆菌中的应用，包括以下步骤：

1)芽胞杆菌营养期杀虫基因vip3A，cry1Ac表达载体pHBERC-VIP300的构建(图7)。

vip3A和cry1Ac基因来源于苏云金芽胞杆菌NBIC-380菌株。

2)PCR引物的设计

根据图7所示的载体图谱，按照实施例1所示的引物设计思路进行，具体PCR引物序列见表5。

表5引物序列

3)各片段的PCR扩增、PCR片段除盐、酵母菌的转化与重组子的筛选鉴定操作方法见实施例1中的3)～5)。经验证，质粒pHBERC-VIP300含有1个vip3A基因和1个cry1Ac基因(图8)。

4)pHBERC-VIP300转入枯草芽胞杆菌168中形成重组菌HBERC-VIP300。

将vip3A多拷贝表达载体pHBERC-VIP300经过除盐纯化后，电转化进枯草芽胞杆菌168(Harwood CR和Wipat A，Sequencing and functional analysis of the genome of Bacillus subtilis strain 168，1996，FEBS Letters，389：84-87)。详细操作步骤如下：

将枯草芽胞杆菌单菌落过夜活化，按1/100(V/V)的接种量转接至50mL新鲜的LB培养液，于30℃以200r/min的转速振荡培养至对数生长中期，培养液冰浴30min后4 000r/min离心5min收集菌体，并用预冷的SG缓冲液洗涤菌体3-4次，最后1次重悬于1mL预冷的SG缓冲液中。

在预冷的转化杯(2cm，Bio-Rad产品)中，加入上述感受态细胞200μL，再加入10μL纯化后的质粒pHBERC-VIP300 DNA(质粒浓度是10μg/μL)，混匀后在冰上放置30min，用电脉冲仪进行电脉冲。电击条件为2.5kV，电击1次。电脉冲完毕后，加入0.8mLLB培养液于电转化杯中，并在30℃以150r/min恢复培养2h后，涂布LB抗性平板，每皿涂100-200μL置30℃培养，以观察抗性菌落的出现。通过抗性平板和PCR进行重组子的验证，获得的重组菌命名为HBERC-VIP300。

5)重组菌HBERC-VIP300对小菜蛾和棉铃虫幼虫的杀虫活性。

将重组菌HBERC-VIP300以及枯草芽胞杆菌168分别做小菜蛾和棉铃虫幼虫的杀虫活性测定。生测结果显示：重组菌HBERC-VIP300对小菜蛾幼虫的LC₅₀值为110.28μg/mL，对棉铃虫幼虫的LC₅₀值为316.39μg/mL(见表6)，168菌株对小菜蛾和棉铃虫幼虫没有杀虫活性，从而增加了枯草芽胞杆菌168菌株的杀虫活性，拓宽了杀虫谱，使枯草芽胞杆菌168菌株除了可以高效抑制病原真菌生长的活性外，还具备了杀虫的活性。生测步骤如下：将发酵液冻干粉按照不同稀释浓度加入小菜蛾/棉铃虫的养虫饲料中，随机挑取小菜蛾/棉铃虫幼虫加入24孔板中，每孔接1-2头，每个样品10次重复，25℃培养，7天后，检查结果，用牙签触动无反应者为死虫。LC₅₀值计算利用LD50数据处理软件(蓝宙工作室Version 1.01，http://biodrug.51.net)。

表6不同菌株对棉铃虫和小菜蛾幼虫的杀虫活性

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  湖北省生物农药工程研究中心

 

<120>  芽胞杆菌一锅法分子育种方法及其应用

 

<130>  芽胞杆菌一锅法分子育种方法及其应用

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.1

 

<210>  1

<211>  3906

<212>  DNA

<213>  芽孢杆菌

 

<400>  1

ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atgggcagca gccatcatca tcatcatcac     60

 

agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat atggctagca tgactggtgg acagcaaatg    120

 

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ggttgggaag aatggggaaa aacaggacaa aaaaaacttt ttgaagacca tcttacgatt    300

 

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tcaaaatcat ccgtaaatgc ttataaccgt tatgtccgca atatgactgt taactgttta   1080

 

gatattgctg ctacatggcc tacatttgat acacataatt atcatcaagg tggtaaatta   1140

 

gatttaactc gtattattct ttcagataca gcaggaccaa tagaagaata tactactggc   1200

 

gacaaaactt caggacctga acatagtaac attacaccaa ataatattct agatacacca   1260

 

tctccaacat atcagcactc atttgtatct gttgattcta ttgtatattc tagaaaagaa   1320

 

ttacaacaat tagacatagc tacttatagt acaaataata gtaataattg tcacccttat   1380

 

ggattacgac tttcatatac agatggaagc agatatgatt atggagataa tcaacctgat   1440

 

tttactactt ccaataacaa ttattgtcat aatagctata ctgcccctat tacacttgtg   1500

 

aatgcacgac atttatataa tgcaaaaggc tctttacaaa atgtagaatc tttagtggtt   1560

 

agtactgtaa atggtggaag tggttcatgc atttgtgatg catggattaa ttatttacgt   1620

 

cctcctcaaa caagtaaaaa tgaatcacgt cctgatcaaa aaattaatgt tttgtatcca   1680

 

ataacagaaa ctgtaaataa ggggactgga ggaaatttag gagttatttc tgcctatgtt   1740

 

ccaatggaac ttgtaccaga aaacgttatt ggagatgtta atgctgatac taaattgcca   1800

 

cttacacaat taaagggctt tccatttgaa aaatatggtt ctgagtataa taatcggggt   1860

 

atctctcttg ttcgcgaatg gataaatggt aacaatgcag ttaaactttc taatagtcaa   1920

 

tctgttggca tacaaattac gaatcaaacc aaacaaaaat atgaaatacg ttgccgttat   1980

 

gcgagtaaag gagataataa tgtttatttt aatgtggatt taagtgaaaa tccatttaga   2040

 

aattccattt cttttggatc tactgaaagt tctgttgtag gagtacaagg tgaaaatgga   2100

 

aagtatatat tgaaatcaat cacaacggta gaaatacctg ctggaagttt ctatgttcat   2160

 

ataacaaacc aaggttcttc agatctcttt ttagatcgta ttgagtttgt tccaaaaatc   2220

 

caattccaat tctgtgataa taataatctt cactgtgatt gtaataaccc tgttgacacc   2280

 

gattgtacat tttgttgcgt ttgcactagt cttactgatt gtgattgtaa taaccctcgt   2340

 

ggcctagatt gtacgctatg ttgtcaggta gaaaatcagc taccttcttt tgtgacactt   2400

 

acagatttac aaaatattac gacacaagta aatgcattag ttgcatcgag cgaacatgat   2460

 

acacttgcaa cagacgtgag tgattatgag attgaagaag ttgtactgaa agtagatgca   2520

 

ttatctggtg aagtgtttgg aaaagagaaa aaagcattgc gtaaattggt aaatcacaca   2580

 

aaacgtttaa gcaaagcgcg taacctcttg ataggaggaa attttgataa cttggatgct   2640

 

tggtacagag gccgaaatgt agtaaacgta tctgatcatg aactatttaa gagtgatcat   2700

 

gtattattgc caccaccaac actgtactca tcttatatgt tccaaaaagt agaggaatcg   2760

 

aaattaaaag cgaatacacg ttatactgtg tctggtttta ttgcacatgc agaagattta   2820

 

gaaattgttg tgtctcgtta tgggcaagaa gtgaagaaag tggttcaagt tccatatgga   2880

 

gaagcattcc cattgacatc gaggggagcg atttgttgcc ctccacgttc tacatgtaat   2940

 

ggaaaacctg ctgatccaca tttctttagt tacagtattg atgtgggaac attagatgta   3000

 

gaagcaaacc ctggtatcga attgggtctt cgtattgtag aacgaactgg aatggcacgt   3060

 

gtaagtaatt tagaaattcg tgaagatcgt ccattaaaga aaaatgaact ccgcaatgta   3120

 

caacgtgcag caagaaattg gagaacagca tatgaccaag aacgtgcaga agtaacggcc   3180

 

ttgattcaac ctgtattaaa tcaaatcaat gcgttgtatg aaaatgaaga ttggaatcga   3240

 

gcaattcgtt ctggagtttc ttatcatgac ttagaagcaa ttgttttacc aacattacca   3300

 

aaattaaatc attggtttat gtctgatatg ttaggggaac aaggttccat tttagctcaa   3360

 

tttcaagaag cattagatcg tgcgtatacg caactcgaag aaagtacaat tctgcataat   3420

 

ggtcatttca caacagatgc agcaaattgg acgatagaag gcgatgcaca tcatgcgata   3480

 

ttagaagatg gtagacgcgt attacgtctt ccagattggt cttctagcgt ttcacaaacc   3540

 

attgaaatag aaaattttga tccagataaa gaatatcagt tagttttcca tgcacaagga   3600

 

gaaggaacgg tctcccttca acatggtgaa gaaggagaat atgtggaaac acacccgcat   3660

 

aagtctgcga attttacaac ttcacaccgt caaggagtca catttgaaac aaataaagta   3720

 

acagttgaaa ttacctcaga agatggagaa ttcctagtcg atcatattgc gcttgtggaa   3780

 

gctcctcttc ctacagatga ccaaagttca gatggaaata cgacttccaa tacgaatagc   3840

 

aatacaagta tgaataataa tcaaaagctt gcggccgcac tcgagcacca ccaccaccac   3900

 

cactga                                                              3906

 

 

Claims (8)

1.芽胞杆菌一锅法分子育种方法，包括：

特异引物的设计

每条引物数量在50-60个碱基，正义链引物起始序列需要为上游片段的尾端序列35-40个碱基，剩余的碱基数为目的片段自身前端序列20-25个碱基；反义链引物序列为下游片段的前端序列35-40个碱基，剩余的碱基数为目的片段自身尾端序列约为20-25个碱基，每条引物间保持G+C%值相等或相差不超过5℃；

PCR反应

根据设计好的引物，分别扩增每个功能片段；

各片段的纯化

酵母菌的转化与重组子的筛选

将PCR片段混合物进行酵母菌的电转化，并通过双抗平板进行重组子的筛选；

芽胞杆菌的转化与重组子的筛选与鉴定。

2.根据权利要求1所述的方法，步骤中，将PCR扩增获得的产物利用PCR产物回收试剂盒回收纯化后，按照载体片段：外源目的片段=1:3的体积比进行混合，混合物终浓度为20 mg/mL，混合物进行除盐纯化。

3.根据权利要求1所述的方法，步骤中，芽胞杆菌的转化步骤包括：

将芽胞杆菌单菌落过夜活化，按1/100的接种量转接至50 mL新鲜的 LB培养液，于30℃以200 r/min的转速振荡培养至对数生长中期，培养液冰浴20-30 min后4 000 r/min离心5 min收集菌体，并用预冷的EP缓冲液洗涤菌体3-4次，最后1次重悬于1 mL 预冷的SG缓冲液中；

SG buffer：272 mM蔗糖 + 15%甘油；EP buffer：SG buffer + 0.5 mM MgCl2 + 磷酸钾缓冲液pH 7.0；在预冷的转化杯中，加入上述感受态细胞100 μL，再加入一定的供体质粒DNA，混匀后在冰上放置10 min，用电脉冲仪进行电脉冲；电击条件为2.0-2.5 kV，电击1次；

电脉冲完毕后，加入0.8 mL LB培养液于电转化杯中，并在30℃以150 r/min恢复培养2 h后，涂布LB抗性平板，每皿涂100-200 μL置30℃培养，以观察抗性菌落的出现；通过抗性平板和PCR进行重组子的验证，即得转化了重组子的芽胞杆菌；

所述的供体质粒的加入量为5-10 μL，供体质粒浓度是5-10 μg/μL。

4.权利要求1所述的方法在制备多拷贝杀虫基因芽胞杆菌中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，为将多拷贝的cry1Ac基因转入苏云金芽胞杆菌NBIC-380。

6.根据权利要求4所述的应用，为将多拷贝的cry5B基因，SEQ ID NO.1所示，转入苏云金芽胞杆菌NBIN-863。

7.权利要求1所述的方法在制备多种杀虫功能芽胞杆菌中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，为将cry1Ac基因和vip3A基因转入枯草芽胞杆菌168。