CN104962481B - 一种桦褐孔菌菌核培养基及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种桦褐孔菌菌核培养基及其制备方法，属于微生物工程技术领域。本发明的培养基由以下原料组成：桦木屑85‑95％、蛋白胨0‑5％、葡萄糖2‑8％、硫酸镁0.05‑1.5％、石膏1‑3％、每100克桦木屑添加0.5‑5ml的鸡蛋清和一定量的水。本发明的培养基能解决桦褐孔菌菌核培养过程中步骤繁琐、培养条件苛刻以及培养时间长的问题，大大缩短了桦褐孔菌菌丝生长和菌核生成的时间。

Description

一种桦褐孔菌菌核培养基及其制备方法

技术领域

本发明属于微生物工程技术领域，涉及真菌培养技术，尤其涉及一种桦褐孔菌菌核培养基及其制备方法。

背景技术

桦褐孔菌(Inonotus obliguus)属于担子菌亚门、层菌纲、非褐菌目、多孔菌科、褐卧孔菌属，是一种珍贵的药用真菌。近年来的研究发现，桦褐孔菌对多种肿瘤细胞有明显的抑制作用，同时具有抗氧化、抗病毒、降血糖等作用，具有巨大的经济价值、营养价值和研究前景。因桦褐孔菌十分珍贵，美国、日本、韩国已加大了对桦褐孔菌的研究力度，美国也把它列为“特殊天然物”作为宇宙人的未来饮品。

桦褐孔菌主要分布于东欧、俄罗斯、波兰等地，我国主要分布于大、小兴安岭和长白山地区等高寒地区，在野生条件下主要以菌核形式存在，生长极为缓慢，因此野生桦褐孔菌资源已远远不能满足日益增长的市场需求。研究人工培养菌核的培养条件具有重要的意义。为了更好的开发和利用这一宝贵资源，人工培养菌丝体及人工培养菌核已获得初步成功，但仍然存在很多亟待解决的问题，如过程繁琐(一般要经历母种培养，原种培养、代料栽培培养的步骤)、培养条件要求苛刻(需要控制光照强度、空气相对湿度、CO²浓度以及防止杂菌污染等)、培养时间长(从母种培养到菌核形成一般需要80-100天的时间)。因此研制新的更好的培养基以解决桦褐孔菌菌核培养中的各种问题成为当下最关键同时也是最难突破的问题。

发明内容

本发明的目的是解决上述桦褐孔菌菌核培养中的问题，提供一种可缩短桦褐孔菌菌丝生长和菌核生成时间的桦褐孔菌菌核培养基及其制备方法。

本发明采用的技术方案是：一种桦褐孔菌菌核培养基，制备桦褐孔菌菌核培养基的原料包括桦木屑、葡萄糖、硫酸镁、石膏、鸡蛋清和水。

上述的一种桦褐孔菌菌核培养基，制备桦褐孔菌菌核培养基的原料还包括蛋白胨。

上述的一种桦褐孔菌菌核培养基，制备桦褐孔菌菌核培养基的原料中，干物质按重量百分比组成为：桦木屑85-95％、蛋白胨0-5％、葡萄糖2-8％、硫酸镁0.05-1.5％、石膏1-3％；鸡蛋清的加入量为每100克桦木屑添加0.5-5ml的鸡蛋清；水的加入量为使培养基的含水率为120-200％。

上述的一种桦褐孔菌菌核培养基，所述的鸡蛋清的制备方法如下：

1)将鸡蛋表面用70-75％酒精擦拭，然后于70-75％酒精中浸泡2-5min，再于200lx光照强度下紫外照射15-20min，最后再用酒精擦拭表面；

2)用灭菌的器具在鸡蛋上敲开0.5-2cm的口，所述的器具包括：接种铲、接种环、镊子、钢丝；用无菌注射器或者移液枪吸取鸡蛋清。

一种桦褐孔菌菌核培养基的制备方法，包括如下步骤：

1)将桦木枝粉碎成颗粒，制成桦木屑；

2)将石膏研磨成粉末，制成石膏粉；

3)按上述的配比取原料，将石膏粉加入到粉碎好的桦木屑中，再依次加入蛋白胨、葡萄糖和硫酸镁，充分混合后，加入蒸馏水至含水量为120-200％，闷料10-14h，得混合料；

4)于混合料中再补充10-30％的水，然后，将混合料装入聚丙烯袋中，将混合料夯实，封口，在温度121℃，压力0.1MPa下，灭菌60-75分钟；

5)冷却后，在无菌条件下，加入鸡蛋清。

上述的一种桦褐孔菌菌核培养基的制备方法，将桦木枝粉碎成颗粒，过10目筛，取筛下物为桦木屑。

上述的一种桦褐孔菌菌核培养基的制备方法，将石膏研磨成粉末，过200目筛,取筛下物为石膏粉。

上述的一种桦褐孔菌菌核培养基的制备方法，步骤5)中鸡蛋清的加入方法是：在步骤4)中，将混合料装入聚丙烯袋中时，同时均匀插入若干根桦木枝；灭菌后，在无菌超净台内，将桦木枝用无菌镊子取出；然后将鸡蛋清，均匀加入到桦木枝留下的孔洞中。

本发明的有益效果是：本发明，在培养基中添加了鸡蛋清，鸡蛋清中富含多种蛋白质、矿物质丰富、含有维生素、核黄素、叶酸、脂肪和葡萄糖等物质，使用此培养基大大缩短了桦褐孔菌菌丝生长和菌核生成的时间，从母种培养到菌核生成只需35天左右。

附图说明

图1是利用本申请的培养基培养的桦褐孔菌菌核处菌丝显微结构图。

图2是利用本申请的培养基培养的桦褐孔菌菌核体视显微结构图。

图3是桦褐孔菌三萜化合物TLC结果图，A是普通培养基培养的桦褐孔菌三萜化合物TLC结果图，B是利用本申请的培养基培养的桦褐孔菌三萜化合物TLC结果图。

具体实施方式

下面的实施例是对本发明的进一步说明，但并不因此而限制本发明。

实施例1一种桦褐孔菌菌核培养基及其制备方法

(一)配比

制备桦褐孔菌菌核培养基的原料组成为：干物质按重量百分比：桦木屑94.93％、蛋白胨2％、葡萄糖2％、硫酸镁0.08％、石膏1％。鸡蛋清4ml、水。

(二)制备方法

1)用剪刀将桦木枝剪成细小的颗粒，过10目筛，制成桦木屑，备用；

2)用研钵将石膏研磨成粉末状，过200目筛，制成石膏粉，备用；

3)称量桦木屑514g、蛋白胨10.8g、葡萄糖10.8g、硫酸镁0.43g、石膏5.4g，加蒸馏水搅拌均匀，使含水量约为150％，闷料12h，得混合料；

4)将闷好的混合料重新补水，按混合料的重量，重新补充20％(w/w)的水，然后将混合料分装到12cm×24cm可高温高压灭菌的聚丙烯袋中，并插入5根桦木枝(其中4枝沿菌袋的边缘均匀排布，用于加入鸡蛋清，1枝插入菌袋的中部，用于接种桦褐孔菌菌丝)。将混合料夯实，使料面距袋口7-10cm，用棉塞和绳扎紧袋口，再用聚丙烯膜包在棉塞外，防止水分的散失；于121℃，压力0.1MPa下，高温高压灭菌25min，冷却至室温,重复灭菌3次；

5)灭菌后，在无菌超净台内，打开棉塞，将桦木枝用无菌镊子取出；

6)在无菌超净台内，将鸡蛋表面用75％酒精擦拭，然后于75％酒精中浸泡2min，再于200lx的光照强度下紫外灯照射20min，最后再用酒精擦拭表面；然后用灭过菌的接种铲在鸡蛋一侧敲开1cm的口，用无菌移液枪吸取4ml鸡蛋清，均匀加入到桦木枝留下的4个位于边缘的孔洞中，制得桦褐孔菌菌核培养基。

(三)效果实验

1)接种：将桦褐孔菌菌丝体，按1％的接入量，接入桦褐孔菌菌核培养基中，位于中部的孔洞中；27℃培养。

2)同时做两组对比实验，对比培养基1，组成同上，不加蛋白胨；对比培养基2，组成同上，不加鸡蛋清。结果显示，使用本实施例中的培养基，菌丝长满菌袋只需21天，而对比培养基1菌丝长满菌袋需要25天，对比培养基2菌丝长满菌袋则需要31天。

3)采用本实施例的培养基，接种后，第35天，即可观察到有菌核形成，22天后观察菌核变硬。菌核颜色由白色到褐色。用显微镜观察菌核处的菌丝发现菌丝呈褐色，菌丝最宽可达7μm，菌丝壁厚0.75μm,而普通培养基培养的桦褐孔菌菌丝最宽为3.35μm,菌丝壁厚0.54μm。

4)采用本发明的培养基培养的桦褐孔菌菌核，经提取，1g菌丝可得17.5mg的三萜化合物。而使用对比培养基1和对比培养基2培养的菌核，用同样的方法提取，1g菌丝分别得到9.21mg和1.60mg的三萜化合物。将提取得到的三萜化合物与普通情况下培养的桦褐孔菌菌丝体提取得到的三萜化合物分别点样于硅胶层析板上，展层后显色，结果如图3所示。由图可知，所得三萜类化合物的组成成分基本相同。

实施例2一种桦褐孔菌菌核培养基及其制备方法

(一)配比

制备桦褐孔菌菌核培养基的原料组成为：干物质按重量百分比：桦木屑90.83％、蛋白胨3.03％、葡萄糖4.04％、硫酸镁0.09％、石膏2.01％。鸡蛋清7ml、水。

(二)制备方法：同实施例1。

1)用剪刀将桦木枝剪成细小的颗粒，过10目筛，制成桦木屑，备用；

2)用研钵将石膏研磨成粉末状，过200目筛，制成石膏粉，备用；

3)称量桦木屑798g、葡萄糖35.5g，蛋白胨26.6g、石膏17.7g、硫酸镁0.8g，加蒸馏水搅拌均匀，含水量为约120％，闷料12h，得混合料；

4)将闷好的混合料再补充30％(w/w)的水，然后将混合料分装到12cm×24cm可高温高压灭菌的聚丙烯袋中，并均匀插入5根桦木枝，将混合料夯实，使料面距袋口7-10cm，用棉塞和绳扎紧袋口，再用聚丙烯膜包在棉塞外，防止水分的散失；于121℃，压力0.1MPa下，高温高压灭菌25min，冷却至室温，重复灭菌3次；

5)灭菌后，在无菌超净台内，打开棉塞，将桦木枝用无菌镊子取出；

6)在无菌超净台内，将鸡蛋表面用75％酒精擦拭，然后于75％酒精中浸泡3min，再于200lx光照强度下紫外灯照射20min；然后用灭过菌的接种铲在鸡蛋一侧敲开1cm的口，用无菌移液枪吸取7ml鸡蛋清，均匀加入到桦木枝留下的5个位于边缘的孔洞中，制得桦褐孔菌菌核培养基。

Claims (7)

1.一种桦褐孔菌菌核培养基，其特征在于：制备桦褐孔菌菌核培养基的原料中，干物质按重量百分比组成为：桦木屑85-95%、蛋白胨大于0小于5%、葡萄糖2-8%、硫酸镁0.05-1.5%、石膏1-3%；鸡蛋清的加入量为，每100克桦木屑添加0.5-5ml的鸡蛋清；水的加入量为使培养基的含水率为120-200%。

2.根据权利要求1所述的一种桦褐孔菌菌核培养基，其特征在于：所述的鸡蛋清的制备方法如下：

1）将鸡蛋表面用70-75%酒精擦拭，然后于70-75%酒精中浸泡2-5min，再于200lx光照强度下紫外照射15-20min，最后再用酒精擦拭表面；

2）用灭菌的器具在鸡蛋上敲开0.5-2cm的口，用无菌注射器或者移液枪吸取鸡蛋清。

3.一种桦褐孔菌菌核培养基的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1）将桦木枝粉碎成颗粒，制成桦木屑；

2）将石膏研磨成粉末，制成石膏粉；

3）按权利要求1所述的桦褐孔菌菌核培养基的配比取原料，将石膏粉加入到粉碎好的桦木屑中，再依次加入蛋白胨、葡萄糖和硫酸镁，充分混合后，加入蒸馏水至含水量为120-200%，闷料10-14h，得混合料；

4）于混合料中再补充10%-30%的水，然后，将混合料装入聚丙烯袋中，将混合料夯实，封口，在温度121℃，压力0.1MPa下，灭菌60-75分钟；

5）冷却后，在无菌条件下，加入鸡蛋清。

4.根据权利要求3所述的一种桦褐孔菌菌核培养基的制备方法，其特征在于：将桦木枝粉碎成颗粒，过10目筛，取筛下物为桦木屑。

5.根据权利要求3所述的一种桦褐孔菌菌核培养基的制备方法，其特征在于：将石膏研磨成粉末，过200目筛，取筛下物为石膏粉。

6.根据权利要求3所述的一种桦褐孔菌菌核培养基的制备方法，其特征在于：步骤5）中鸡蛋清的加入方法是：在步骤4）中，将混合料装入聚丙烯袋中时，同时均匀插入若干根桦木枝；灭菌后，在无菌超净台内，将桦木枝用无菌镊子取出；然后将鸡蛋清，均匀加入到桦木枝留下的孔洞中。

7.根据权利要求3所述的一种桦褐孔菌菌核培养基的制备方法，其特征在于：所述的鸡蛋清的制备方法如下：

1）将鸡蛋表面用70-75%酒精擦拭，然后于70-75%酒精中浸泡，2-5min，再于200lx光照强度下紫外照射15-20min，最后再用酒精擦拭表面；

2）用灭菌的器具在鸡蛋上敲开0.5-2cm的口，用无菌注射器或者移液枪吸取鸡蛋清。