CN104946242B

CN104946242B - 用于检测β‑半乳糖苷酶的荧光探针及制备方法和应用

Info

Publication number: CN104946242B
Application number: CN201510313482.0A
Authority: CN
Inventors: 吴水珠; 胡清华; 曾鈁
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2015-06-09
Filing date: 2015-06-09
Publication date: 2017-04-12
Anticipated expiration: 2035-06-09
Also published as: CN104946242A

Abstract

本发明属于分析检测技术领域，公开了一种用于检测β‑半乳糖苷酶的荧光探针及其制备方法和应用。该探针的底物为2‑(2‑(二甲氨基)乙基)‑6‑(((3R,4S,5R,6R)‑3,4,5‑三羟基‑6‑(羟甲基)四氢化‑2H‑吡喃‑2‑基)氧化)‑1H‑苯并异喹啉二酮，具有如下结构式：本发明荧光探针的底物以萘二甲酸酐作为荧光团，并接上能对β‑半乳糖苷酶特异性响应的半乳糖基团，利用双荧光信号的比值I₅₅₄/I₄₄₅作为检测信号，具有更好的检测准确性，1U/L的酶浓度即检测到明显的荧光变化，检测下限可达到0.35U/L，其在可见光区域被激发(418nm)，能消除背景干扰达到更好的检测效果。

Description

用于检测β-半乳糖苷酶的荧光探针及制备方法和应用

技术领域

本发明属于分析检测技术领域，特别涉及一种用于检测β-半乳糖苷酶的荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

β-半乳糖苷酶(β-gal)是一种能够将β-半乳糖苷水解成半乳糖和糖苷的酶。随着科学技术的快速发展，β-半乳糖苷酶在环境、生物、医学、化学、等领域的应用越来越多。在食品工业领域，利用β-半乳糖苷酶能够水解乳糖的性质来降低乳制品中的乳糖含量。在生物领域，β-半乳糖苷酶是一种被广泛应用的基因标记酶，可用来研究基因的转录调控和基因表达等。β-半乳糖苷酶基因是基因工程中最常用的报告基因，利用其表达产物β-半乳糖苷酶来研究目的基因的表达调控。最近报道的文献发现β-半乳糖苷酶与动物细胞的衰老有密切的关系。因此，在医学研究、基因诊断、生物免疫等方面，检测β-半乳糖苷酶活性显得十分重要。

截止目前，已有多种方法用于检测β-半乳糖苷酶活性，包括核磁技术、比色法、荧光技术等。采用核磁共振成像方法检测β-半乳糖苷酶活性(如Bioconjugate Chem.,2012,23,596-603)，报道了一系列具有双重¹H/¹⁹F核磁共振成像能力的β-半乳糖苷酶基因报告分子，并测试了接种在小鼠上的人移植肿瘤中β-半乳糖苷酶的活性。比色法用于测定β-半乳糖苷酶(如美国专利US005491069A)，主要是利用显色底物5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-吡喃半乳糖苷在β-半乳糖苷酶的催化作用下产生蓝色产物，通过测定蓝色产物的含量从而达到测定衰老细胞内β-半乳糖苷酶含量的目的。但是此方法操作复杂而且定量测试准确度比较差。荧光检测方法在分析检测上具有灵敏度高、响应快、专一性好、使用方便、选择性高等特点；而且荧光探针在化学结构上易于设计、修饰和改进，能满足不同检测样品的需要，所以荧光探针越来越多地被用来检测β-半乳糖苷酶活性。然而，目前常规的检测β-半乳糖苷酶的荧光检测方法主要是荧光增强型探针，这些方法易受激发光强、样品浓度、样品中存在的背景荧光等干扰，因此难以保证检测的准确性。例如，荧光增强型检测β-半乳糖苷酶的方法(如Mol.BioSyst.,2013,9,3001-3008)，合成了一种基于Cy7染料作为荧光团的荧光探针，该探针分子未与β-半乳糖苷酶作用前是没有荧光的，当加入β-半乳糖苷酶之后，探针分子释放出荧光染料Cy7荧光团，在684nm处出现一个很强的荧光发射峰，根据荧光强度的增强幅度来对半乳糖苷酶进行定量检测。由上实例可见，本领域急需发展抗干扰能力强、准确度高的、简便的β-半乳糖苷酶荧光探针。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种用于检测β-半乳糖苷酶的荧光探针。本发明的荧光探针以萘二甲酸酐作为荧光团，通过β-半乳糖苷酶选择性脱去半乳糖基团来实现对β-半乳糖苷酶比率型荧光检测。

本发明另一目的在于提供一种上述用于检测β-半乳糖苷酶的荧光探针的制备方法。

本发明再一目的在于提供上述荧光探针的应用。

本发明的目的通过下述方案实现：

一种用于检测β-半乳糖苷酶的荧光探针，该探针的底物为2-(2-(二甲氨基)乙基)-6-(((3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟甲基)四氢化-2H-吡喃-2-基)氧化)-1H-苯并异喹啉二酮(NG-GAL)，具有如下结构式：

本发明还提供了一种上述用于检测β-半乳糖苷酶的荧光探针的制备方法，包含以下步骤：

(1)将4-溴-1,8-萘二甲酸酐溶于溶剂中，搅拌下滴加N,N-二甲基乙二胺，加热反应，冷却析出沉淀，得到6-溴-2-(2-(二甲氨基)乙基)-苯并异喹啉-二酮；

(2)将6-溴-2-(2-(二甲氨基)乙基)-苯并异喹啉-二酮、甲醇钠溶于甲醇中并加入催化剂，加热反应，得到6-甲氧基-2-(2-(二甲氨基)乙基)-苯并异喹啉-二酮；

(3)将步骤(2)的6-甲氧基-2-(2-(二甲氨基)乙基)-苯并异喹啉-二酮溶于氢碘酸溶液中，加热反应，冷却，调节pH析出，得到6-羟基-2-(2-(二甲氨基)乙基)-苯并异喹啉-二酮；

(4)将步骤(3)的6-羟基-2-(2-(二甲氨基)乙基)-苯并异喹啉-二酮、2,3,4,6-四-邻乙酰-α-溴化半乳糖吡喃和氧化银加入到溶剂中，搅拌反应，得到2-(2-(二甲氨基)乙基)-6-(((3R,4S,5R,6R)-3,4,5-乙酰基-6-(乙酰甲基)四氢化-2H-吡喃-2-基)氧化)-1H-苯并异喹啉二酮；

(5)将步骤(4)的2-(2-(二甲氨基)乙基)-6-(((3R,4S,5R,6R)-3,4,5-乙酰基-6-(乙酰甲基)四氢化-2H-吡喃-2-基)氧化)-1H-苯并异喹啉二酮和甲醇钠加入到溶剂中，搅拌反应，得到2-(2-(二甲氨基)乙基)-6-(((3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟甲基)四氢化-2H-吡喃-2-基)氧化)-1H-苯并异喹啉二酮(NG-GAL)。

步骤(1)中所用4-溴-1,8-萘二甲酸酐和N,N-二甲基乙二胺的摩尔比优选为1:1.1～1:1.2。

步骤(1)中所述加热反应优选指加热至80～85℃反应6～8h。

步骤(1)中所述的溶剂用于提供溶液反应环境，可为乙醇、DMF、乙二醇单甲醚等。

步骤(1)中每1mmol的4-溴-1,8-萘二甲酸酐优选使用10～15mL的溶剂。

步骤(1)中析出的沉淀优选通过过滤收集后利用乙醇重结晶，得到纯化后的产物。

步骤(2)中所用6-溴-2-(2-(二甲氨基)乙基)-苯并异喹啉-二酮和甲醇钠的摩尔比优选为1:8～1:10。

步骤(2)中所述的催化剂优选为五水硫酸铜，其用量为催化量即可，优选为6-溴-2-(2-(二甲氨基)乙基)-苯并异喹啉-二酮摩尔的量的5％。

步骤(2)中所述的加热反应优选指加热至66～72℃反应10～12h。

步骤(2)中甲醇用于提供溶液反应环境，每1mmol 6-溴-2-(2-(二甲氨基)乙基)-苯并异喹啉-二酮优选使用5～8mL的甲醇。

步骤(2)中所述加热反应后的体系可通过纯化得到6-甲氧基-2-(2-(二甲氨基)乙基)-苯并异喹啉-二酮，优选将加热反应后体系冷却至室温，加水，用乙酸乙酯进行萃取；收集有机相，干燥后过滤；旋转蒸发有机相除去有机溶剂，所得固体经硅胶层析柱，得到纯化后的6-甲氧基-2-(2-(二甲氨基)乙基)-苯并异喹啉-二酮。

步骤(3)中所述的加热反应优选指加热至130～135℃反应4～6h。

步骤(3)中每1mmol 6-甲氧基-2-(2-(二甲氨基)乙基)-苯并异喹啉-二酮优选使用4～5mL的氢碘酸溶液。

步骤(3)中所述氢碘酸溶液的浓度优选为45～57％，更优选为57％。

步骤(3)中所述的调节pH优选调节pH至3～5。

步骤(3)中所述的调节pH优选使用3～5mol/L的NaOH溶液进行调节。

步骤(4)中所用6-羟基-2-(2-(二甲氨基)乙基)-苯并异喹啉-二酮、2,3,4,6-四-邻乙酰-α-溴化半乳糖吡喃和氧化银的摩尔比优选为1:(1～1.2):(1～1.2)。

步骤(4)中所述的搅拌反应优选指室温下搅拌反应8～10h。

步骤(4)中所述的溶剂用于提供溶液反应环境，可为乙腈、四氢呋喃等。

步骤(4)中每1mmol 6-羟基-2-(2-(二甲氨基)乙基)-苯并异喹啉-二酮优选使用15～20mL乙腈。

步骤(4)中反应后体系优选通过利用硅藻土过滤、旋蒸去除溶剂，过硅胶层析柱得到纯化后的产物。

步骤(5)中所用2-(2-(二甲氨基)乙基)-6-(((3R,4S,5R,6R)-3,4,5-乙酰基-6-(乙酰甲基)四氢化-2H-吡喃-2-基)氧化)-1H-苯并异喹啉二酮和甲醇钠的摩尔比优选为1:3～1:5。

步骤(5)中所述搅拌反应优选指室温下搅拌反应8～10h。

步骤(5)中所述的溶剂用于提供溶液反应环境，可为甲醇、乙醇等。

步骤(5)中每1mmol 2-(2-(二甲氨基)乙基)-6-(((3R,4S,5R,6R)-3,4,5-乙酰基-6-(乙酰甲基)四氢化-2H-吡喃-2-基)氧化)-1H-苯并异喹啉二酮优选使用4～6mL甲醇。

步骤(5)中所述搅拌反应后体系可通过中和后、旋蒸去除溶剂，过硅胶层析柱得到纯化的产品。所述的中和优选使用2～4％稀盐酸进行。

本发明所得探针底物2-(2-(二甲氨基)乙基)-6-(((3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟甲基)四氢化-2H-吡喃-2-基)氧化)-1H-苯并异喹啉二酮(NG-GAL)，分子式为C₂₂H₂₆N₂O₈，相对分子质量为446.17，为浅黄色无味固体粉末，溶于水，易溶于乙醇，氯仿等溶剂。该化合物光稳定性好，无毒，也具有良好的生物相容性。在418nm的激发光照射下，在445nm左右发射蓝色荧光。而识别基团在可见光区无吸收、也不发射荧光。当识别基团与β-半乳糖苷酶作用后，其半乳糖分子在酶的作用下水解成羟基，在418nm的激发光照射下，在554nm左右发射出黄绿色荧光，可用于食品、生物、化工、医药等领域中β-半乳糖苷酶的定量分析。

本发明的机理为：

本发明的用于检测β-半乳糖苷酶的荧光探针，其底物为2-(2-(二甲氨基)乙基)-6-(((3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟甲基)四氢化-2H-吡喃-2-基)氧化)-1H-苯并异喹啉二酮(NG-GAL)，结构以萘二甲酸酐作为荧光团，在4号位键接上能对β-半乳糖苷酶特异性响应的半乳糖基团，利用ICT效应，当探针化合物未与β-半乳糖苷酶作用时以418nm作为激发光，在445nm处有强烈的荧光发射峰，当与β-半乳糖苷酶作用后，在554nm处出现一个强烈的发射峰，同时445nm处的发射峰随之成比例降低。利用两处荧光的强度比值这一荧光性质可以对β-半乳糖苷酶浓度进行定量检测。本发明制备的探针使用过程操作简便、灵敏度高、成本低廉便于推广应用。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：

(1)本发明的探针化合物能对β-半乳糖苷酶实施荧光比率检测，即利用双荧光信号的比值作为检测信号，因而比以往发现的单增强型探针有更好的检测准确性。

(2)本发明的探针化合物具有很高的灵敏度，在1U/L的酶浓度条件下就能检测到明显的荧光变化，同时其检测下限可达到0.35U/L。

(3)本发明的探针化合物能在可见光区域被激发(418nm)，较大程度消除背景干扰达到更好的检测效果。

附图说明

图1为本发明探针化合物的合成路线图。

图2为实施例1中6-溴-2-(2-(二甲氨基)乙基)-苯并异喹啉-二酮的核磁共振氢谱图。

图3为实施例1中6-溴-2-(2-(二甲氨基)乙基)-苯并异喹啉-二酮的质谱图。

图4为实施例1中6-甲氧基-2-(2-(二甲氨基)乙基)-苯并异喹啉-二酮的核磁共振氢谱图。

图5为实施例1中6-甲氧基-2-(2-(二甲氨基)乙基)-苯并异喹啉-二酮的质谱图。

图6为实施例1中6-羟基-2-(2-(二甲氨基)乙基)-苯并异喹啉-二酮的核磁共振氢谱图。

图7为实施例1中6-羟基-2-(2-(二甲氨基)乙基)-苯并异喹啉-二酮的质谱图。

图8为实施例1中2-(2-(二甲氨基)乙基)-6-(((3R,4S,5R,6R)-3,4,5-乙酰基-6-(乙酰甲基)四氢化-2H-吡喃-2-基)氧化)-1H-苯并异喹啉二酮的核磁共振氢谱图。

图9为实施例1中2-(2-(二甲氨基)乙基)-6-(((3R,4S,5R,6R)-3,4,5-乙酰基-6-(乙酰甲基)四氢化-2H-吡喃-2-基)氧化)-1H-苯并异喹啉二酮的质谱图。

图10为实施例1中2-(2-(二甲氨基)乙基)-6-(((3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟甲基)四氢化-2H-吡喃-2-基)氧化)-1H-苯并异喹啉二酮的核磁共振氢谱图。

图11为实施例1中2-(2-(二甲氨基)乙基)-6-(((3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟甲基)四氢化-2H-吡喃-2-基)氧化)-1H-苯并异喹啉二酮的质谱图。

图12为探针化合物在加入β-半乳糖苷酶前后荧光光谱的变化图。

图13为β-半乳糖苷酶催化反应探针化合物的线性关系图。

图14为不同浓度β-半乳糖苷酶催化反应探针化合物的荧光比率变化图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：探针化合物NG-GAL的制备

合成路线如图1所示，将1035mg的4-溴-1,8-萘二甲酸酐(3.75mmol)溶于56mL乙醇中，搅拌条件下，在氮气保护下滴加396mg的N,N-二甲基乙二胺(4.50mmol)，将混合溶液加热至80℃回流，冷却至室温后，过滤并收集析出物，将析出物用乙醇重结晶，得到固体6-溴-2-(2-(二甲氨基)乙基)-苯并异喹啉-二酮1066mg(产率为82.2％)；通过核磁共振氢谱(图2)对该产物进行表征，¹H NMR(CDCl₃,400MHz,ppm):2.36(s,6H),2.65(t,J＝6.4Hz,2H),4.34(t,J＝6.8Hz,2H),7.86(t,J＝6.8Hz,1H),8.03(d,1H),8.42(d,1H),8.56(d,1H),8.67(d,1H).其中，8.67ppm、8.56ppm、8.42ppm、8.03ppm以及7.86ppm对应的是萘环上质子的特征峰，4.34ppm处对应的是靠近萘环上亚甲基的质子特征峰，而2.65ppm处对应的是第二个亚甲基的质子特征峰、2.36ppm则对应了二甲氨两个甲基质子的特征峰。另外，通过质谱(图3)进行了辅助证明，MS(ESI):m/z 348.5[M+H]⁺。通过核磁和质谱的分析可以确定所合成的产物为目标中间体。

将692mg上述白色固体(2.0mmol)与864mg甲醇钠(16mmol)溶于16mL甲醇中，加入68mg CuSO₄·5H₂O，搅拌条件下，溶液加热至70℃回流，并保持12小时；冷却至室温，加入去离子水，然后用乙酸乙酯进行萃取；收集有机相，将有机相用1200mg无水硫酸镁干燥，过滤，旋转蒸发除去有机溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化(淋洗剂为二氯甲烷/甲醇，V/V＝20:1)，得到白色固体6-甲氧基-2-(2-(二甲氨基)乙基)-苯并异喹啉-二酮478mg(产率为80.2％)。通过核磁共振氢谱(图4)对该产物进行了表征，¹H NMR(CDCl₃,400MHz,ppm):2.42(s,6H),2.74(t,J＝6.4Hz,2H),4.13(s,3H),4.35(t,J＝6.8Hz,2H),7.04(d,1H),7.70(t,J＝7.2Hz,1H),8.54-8.58(m,3H).其中，8.54-8.58ppm、7.70ppm及7.04ppm分别对应萘环上质子的特征峰，4.35ppm和2.74ppm分别对应两个亚甲基质子的特征峰，4.13ppm对应的是甲氧基上甲基的质子特征峰，2.42ppm对应的是甲氨基上两个甲基的特征质子峰。另外，通过质谱(图5)进行了辅助证明，MS(ESI):m/z＝299.0[M+H]⁺。通过核磁和质谱的分析可以确定所合成的产物为目标中间体。

将298mg上述白色固体(1.0mmol)溶于5mL 57％的氢碘酸中，溶液加热至130℃回流，并保持6小时；冷却至室温，用5mol/L的NaOH溶液调节pH至3～5之间，过滤收集沉淀，真空干燥得亮黄色固体6-羟基-2-(2-(二甲氨基)乙基)-苯并异喹啉-二酮207mg(产率为73.4％)。通过核磁共振氢谱(图6)对该产物进行了表征，¹H NMR(d6-DMSO,400MHz,ppm):2.91(s,6H),3.47(t,J＝5.2Hz,2H),4.35(t,J＝4.8Hz,2H),7.21(d,1H),7.80(t,J＝7.6Hz,1H),8.42(d,1H),8.53(d,1H),8.60(d,1H).其中，8.60ppm、8.53ppm、8.42ppm、7.80ppm及7.21ppm分别对应萘环上质子的特征峰，4.35ppm和3.47ppm分别对应两个亚甲基质子的特征峰，2.91ppm对应的是甲氨基上两个甲基的特征质子峰。另外，通过质谱(图7)进行了辅助证明，MS(ESI):m/z＝282.87[M-H]^-。通过核磁和质谱的分析可以确定所合成的产物为目标中间体。

将141mg上述亮黄色固体(0.5mmol)、247mg的2,3,4,6-四-邻乙酰-α-溴化半乳糖吡喃(0.6mmol)和139mg氧化银(0.6mmol)加入到10mL乙腈中，溶液在室温的条件下搅拌反应10小时；用硅藻土过滤，旋转蒸发除去有机溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化(淋洗剂为二氯甲烷/甲醇，V/V＝30:1)，得到白色固体2-(2-(二甲氨基)乙基)-6-(((3R,4S,5R,6R)-3,4,5-乙酰基-6-(乙酰甲基)四氢化-2H-吡喃-2-基)氧化)-1H-苯并异喹啉二酮238mg(产率为77.5％)。通过核磁共振氢谱(图8)对该产物进行了表征，¹H NMR(CDCl₃,400MHz,ppm):2.05(d,6H),2.10(s,3H),2.22(s,3H),2.38(s,6H),2.68(t,J＝4.7Hz,2H),4.24(m,J＝4.2Hz,3H),4.33(t,J＝4.8Hz,2H),5.24(m,J＝4.4Hz,1H),5.38(d,1H),5.54(d,1H),5.76(m,J＝4.7Hz,1H),7.24(d,1H),7.75(t,J＝7.7Hz,1H),8.44(d,1H),8.54(d,1H),8.61(d,1H).其中，8.61ppm、8.54ppm、8.44ppm、7.75ppm及7.24ppm分别对应萘环上质子的特征峰，4.33ppm和2.68ppm分别对应两个亚甲基质子的特征峰，2.38ppm对应的是甲氨基上两个甲基的特征质子峰，5.76ppm、5.54ppm、5.38ppm、5.22ppm对应的是半乳糖吡喃环上的4个质子特征峰，4.24ppm对应的是吡喃环上的一个特征质子峰和与吡喃环相连的亚甲基的两个特征质子峰，2.22ppm、2.10ppm、2.05ppm对应的是半乳糖部分的四个乙酰基的特征质子峰。另外，通过质谱(图9)进行了辅助证明，MS(ESI):m/z＝615.01[M-H]^-。通过核磁和质谱的分析可以确定所合成的产物为目标中间体。

将184mg上述白色固体(0.3mmol)和65mg甲醇钠(1.2mmol)加入到2mL甲醇中，溶液在室温的条件下搅拌反应10小时；用3％的稀盐酸溶液调节pH至中性，旋转蒸发除去溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化所得固体经硅胶层析柱纯化(淋洗剂为二氯甲烷/甲醇，V/V＝4:1)，得到白色固体2-(2-(二甲氨基)乙基)-6-(((3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟甲基)四氢化-2H-吡喃-2-基)氧化)-1H-苯并异喹啉二酮(NG-GAL)89mg(产率为63.9％)。通过核磁共振氢谱(图10)对该产物进行了表征，¹H NMR(d6-DMSO,400MHz,ppm):2.25(s,6H),2.56(t,J＝5.2Hz,2H),3.54(m,J＝4.4Hz,2H),3.59(d,1H),3.76(t,J＝4.6Hz,1H),3.79(t,J＝5.4Hz,1H),3.84(m,J＝5.6Hz,1H),4.16(t,J＝7.6Hz,1H),4.65(d,1H),4.74(s,1H),5.02(d,1H),5.22(d,1H),5.50(d,1H),7.48(d,1H),7.86(t,J＝7.6Hz,1H),8.43(d,1H),8.51(d,1H),8.72(d,1H).其中，8.72ppm、8.51ppm、8.43ppm、7.86ppm及7.48ppm分别对应萘环上质子的特征峰，4.16ppm和2.56ppm分别对应两个亚甲基质子的特征峰，2.25ppm对应的是甲氨基上两个甲基的特征质子峰，5.50ppm、3.84ppm、3.79ppm、3.76ppm、3.59ppm对应的是半乳糖吡喃环上的5个特征质子峰，5.22ppm、5.02ppm、4.74ppm、4.65ppm对应的是半乳糖吡喃环上四个羟基的特征质子峰，3.54ppm对应的是与吡喃环相连的亚甲基的两个特征质子峰。另外，通过质谱(图11)进行了辅助证明，MS(ESI):m/z＝446.36[M-H]^-。通过核磁和质谱的分析可以确定所合成的产物为目标中间体。

实施例2：探针化合物NG-GAL的制备

将2070mg的4-溴-1,8-萘二甲酸酐(7.50mmol)溶于90mL乙醇中，搅拌条件下，在氮气保护下滴加760mg的N,N-二甲基乙二胺(8.62mmol)，将混合溶液加热至82℃回流，冷却至室温后，过滤并收集析出物，将析出物用乙醇重结晶，得到固体6-溴-2-(2-(二甲氨基)乙基)-苯并异喹啉-二酮1988mg(产率为76.6％)。

将1038mg上述白色固体(3.0mmol)与1620mg甲醇钠(30mmol)溶于21mL甲醇中，加入102mg CuSO₄·5H₂O，搅拌条件下，溶液加热至72℃回流，并保持11小时；冷却至室温，加入去离子水，然后用乙酸乙酯进行萃取；收集有机相，将有机相用1800mg无水硫酸镁干燥，过滤，旋转蒸发除去有机溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化(淋洗剂为二氯甲烷/甲醇，V/V＝20:1)，得到白色固体6-甲氧基-2-(2-(二甲氨基)乙基)-苯并异喹啉-二酮678mg(产率为75.8％)。

将450mg上述白色固体(1.5mmol)溶于7mL 57％的氢碘酸中，溶液加热至135℃回流，并保持5小时；冷却至室温，用5mol/L的NaOH溶液调节pH至3～5之间，过滤收集沉淀，真空干燥得亮黄色固体6-羟基-2-(2-(二甲氨基)乙基)-苯并异喹啉-二酮298mg(产率为69.6％)。

将282mg上述亮黄色固体(1mmol)、340mg的2,3,4,6-四-邻乙酰-α-溴化半乳糖吡喃(1.1mmol)和255mg氧化银(1.1mmol)加入到18mL乙腈中，溶液在室温的条件下搅拌反应9小时；用硅藻土过滤，旋转蒸发除去有机溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化(淋洗剂为二氯甲烷/甲醇，V/V＝30:1)，得到白色固体2-(2-(二甲氨基)乙基)-6-(((3R,4S,5R,6R)-3,4,5-乙酰基-6-(乙酰甲基)四氢化-2H-吡喃-2-基)氧化)-1H-苯并异喹啉二酮455mg(产率为74.1％)。

将307mg上述白色固体(0.5mmol)和81mg甲醇钠(1.5mmol)加入到2.5mL甲醇中，溶液在室温的条件下搅拌反应8小时；用4％的稀盐酸溶液调节pH至中性，旋转蒸发除去溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化所得固体经硅胶层析柱纯化(淋洗剂为二氯甲烷/甲醇，V/V＝4:1)，得到白色固体2-(2-(二甲氨基)乙基)-6-(((3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟甲基)四氢化-2H-吡喃-2-基)氧化)-1H-苯并异喹啉二酮(NG-GAL)190mg(产率为81.9％)。

探针化合物NG-GAL的中间体以及最终的探针化合物表征与实施例1中的结果是相同的。

实施例3：探针化合物NG-GAL的制备

将552mg的4-溴-1,8-萘二甲酸酐(2.0mmol)溶于30mL乙醇中，搅拌条件下，在氮气保护下滴加194mg的N,N-二甲基乙二胺(2.2mmol)，将混合溶液加热至85℃回流，冷却至室温后，过滤并收集析出物，将析出物用乙醇重结晶，得到固体6-溴-2-(2-(二甲氨基)乙基)-苯并异喹啉-二酮535mg(产率为76.7％)。

将346mg上述白色固体(1.0mmol)与486mg甲醇钠(9mmol)溶于9mL甲醇中，加入34mg CuSO₄·5H₂O，搅拌条件下，溶液加热至68℃回流，并保持11小时；冷却至室温，加入去离子水，然后用乙酸乙酯进行萃取；收集有机相，将有机相用1000mg无水硫酸镁干燥，过滤，旋转蒸发除去有机溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化(淋洗剂为二氯甲烷/甲醇，V/V＝20:1)，得到白色固体6-甲氧基-2-(2-(二甲氨基)乙基)-苯并异喹啉-二酮201mg(产率为70.5％)。

将150mg上述白色固体(0.5mmol)溶于2.5mL 57％的氢碘酸中，溶液加热至132℃回流，并保持4小时；冷却至室温，用5mol/L的NaOH溶液调节pH至3～5之间，过滤收集沉淀，真空干燥得亮黄色固体6-羟基-2-(2-(二甲氨基)乙基)-苯并异喹啉-二酮95mg(产率为67.6％)。

将70mg上述亮黄色固体(0.25mmol)、90mg的2,3,4,6-四-邻乙酰-α-溴化半乳糖吡喃(0.29mmol)和68mg氧化银(0.29mmol)加入到4mL乙腈中，溶液在室温的条件下搅拌反应8小时；用硅藻土过滤，旋转蒸发除去有机溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化(淋洗剂为二氯甲烷/甲醇，V/V＝30:1)，得到白色固体2-(2-(二甲氨基)乙基)-6-(((3R,4S,5R,6R)-3,4,5-乙酰基-6-(乙酰甲基)四氢化-2H-吡喃-2-基)氧化)-1H-苯并异喹啉二酮105mg(产率为68.3％)。

将92mg上述白色固体(0.15mmol)和40mg甲醇钠(0.75mmol)加入到1mL甲醇中，溶液在室温的条件下搅拌反应9小时；用2％的稀盐酸溶液调节pH至中性，旋转蒸发除去溶剂，所得固体经硅胶层析柱纯化所得固体经硅胶层析柱纯化(淋洗剂为二氯甲烷/甲醇，V/V＝4:1)，得到白色固体2-(2-(二甲氨基)乙基)-6-(((3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟甲基)四氢化-2H-吡喃-2-基)氧化)-1H-苯并异喹啉二酮(NG-GAL)55mg(产率为79.1％)。

实施例4：NG-GAL荧光探针的荧光光谱测试性质

用pH为7.4的PBS缓冲液将NG-GAL探针配成浓度为10μM的溶液，加入浓度为50U/L的β-半乳糖苷酶溶液，以418nm作为激发波长测试不同时间荧光光谱的变化，结果见图12。

实施例5：NG-GAL荧光探针对β-半乳糖苷酶检测的线性关系测试

以418nm作为激发波长，测定相同时间内一系列不同浓度的β-半乳糖苷酶对探针响应的荧光光谱，以554nm处的荧光强度与445nm处的荧光强度的比值I₅₅₄/I₄₄₅为纵坐标，以β-半乳糖苷酶的浓度为横坐标绘制线性曲线，其结果见图13。

实施例6：NG-GAL荧光探针对不同浓度β-半乳糖苷酶的检测

用pH为7.4的PBS缓冲液将NG-GAL探针配成浓度为10μM的溶液，加入浓度为1U/L、2U/L、5U/L、10U/L、20U/L、30U/L、40U/L、50U/L、60U/L、70U/L、80U/L、100U/L的β-半乳糖苷酶溶液，以418nm作为激发波长测试其反应60min后554nm与445nm处的荧光强度的比值I₅₅₄/I₄₄₅，以荧光强度比值I₅₅₄/I₄₄₅为纵坐标，以β-半乳糖苷酶的浓度为横坐标绘制曲线，结果见图14。

实施例7：NG-GAL荧光探针对β-半乳糖苷酶检测的酶促反应动力学测试

固定β-半乳糖苷酶的浓度为50U/L，用pH为7.4的PBS缓冲液将NG-GAL探针配成不同浓度的溶液，反应相同时间后测定不同浓度的探针荧光光谱，然后利用米氏方程求得酶促反应的最大反应速度V_max为1.923μΜ/min和米氏常数Km为70.495μΜ。

本发明的探针化合物由萘二甲酸酐作为荧光团，在4号位键接上对β-半乳糖苷酶特异性响应的半乳糖基团，利用ICT效应，当探针化合物未与β-半乳糖苷酶作用时以418nm作为激发光，在445nm处有强烈的荧光发射峰，当加入β-半乳糖苷酶后，随着反应时间的进行，在554nm处出现一个强烈的发射峰，同时445nm处的发射峰随之成比率降低。利用这一荧光性质可以对β-半乳糖苷酶浓度进行定量检测。

本发明采用的是比率型探针检测方法，该方法采用的是探针反应前后的荧光强度比值对酶浓度进行检测，可以更大程度消除被检测体系的背景干扰，从而达到更准确的检测效果，本发明的检测体系使用方便，便于推广应用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种用于检测β-半乳糖苷酶的荧光探针，其特征在于该探针的底物为2-(2-(二甲氨基)乙基)-6-(((3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟甲基)四氢化-2H-吡喃-2-基)氧化)-1H-苯并异喹啉二酮，具有如下结构式：

2.一种根据权利要求1所述的用于检测β-半乳糖苷酶的荧光探针的制备方法，其特征在于包含以下步骤：

(5)将步骤(4)的2-(2-(二甲氨基)乙基)-6-(((3R,4S,5R,6R)-3,4,5-乙酰基-6-(乙酰甲基)四氢化-2H-吡喃-2-基)氧化)-1H-苯并异喹啉二酮和甲醇钠加入到溶剂中，搅拌反应，得到2-(2-(二甲氨基)乙基)-6-(((3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟甲基)四氢化-2H-吡喃-2-基)氧化)-1H-苯并异喹啉二酮。

3.根据权利要求2所述的用于检测β-半乳糖苷酶的荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所用4-溴-1,8-萘二甲酸酐和N,N-二甲基乙二胺的摩尔比为1:1.1～1:1.2；

步骤(2)中所用6-溴-2-(2-(二甲氨基)乙基)-苯并异喹啉-二酮和甲醇钠的摩尔比为1:8～1:10；

步骤(4)中所用6-羟基-2-(2-(二甲氨基)乙基)-苯并异喹啉-二酮、2,3,4,6-四-邻乙酰-α-溴化半乳糖吡喃和氧化银的摩尔比为1:(1～1.2):(1～1.2)；

步骤(5)所用2-(2-(二甲氨基)乙基)-6-(((3R,4S,5R,6R)-3,4,5-乙酰基-6-(乙酰甲基)四氢化-2H-吡喃-2-基)氧化)-1H-苯并异喹啉二酮和甲醇钠的摩尔比为1:3～1:5。

4.根据权利要求2所述的用于检测β-半乳糖苷酶的荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤(3)中每1mmol所述6-甲氧基-2-(2-(二甲氨基)乙基)-苯并异喹啉-二酮使用4～5mL的氢碘酸溶液；所述氢碘酸溶液的浓度为45～57％。

5.根据权利要求2所述的用于检测β-半乳糖苷酶的荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述加热反应指加热至80～85℃反应6～8h。

6.根据权利要求2所述的用于检测β-半乳糖苷酶的荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的加热反应指加热至66～72℃反应10～12h。

7.根据权利要求2所述的用于检测β-半乳糖苷酶的荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的加热反应指加热至130～135℃反应4～6h。

8.根据权利要求2所述的用于检测β-半乳糖苷酶的荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述的搅拌反应指室温下搅拌反应8～10h。

9.根据权利要求2所述的用于检测β-半乳糖苷酶的荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤(5)中所述搅拌反应指室温下搅拌反应8～10h。

10.根据权利要求1所述的用于检测β-半乳糖苷酶的荧光探针在食品、化工领域中β-半乳糖苷酶的定量分析中的应用。