CN104928270B

CN104928270B - 一组耐螯合剂乙二胺四乙酸的重组碱性木聚糖酶及其构建方法

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Publication number: CN104928270B
Application number: CN201410115520.7A
Authority: CN
Inventors: 马延和; 邢霞; 王钦宏; 涂然; 彭彦峰
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2014-03-21
Filing date: 2014-03-21
Publication date: 2018-04-17
Anticipated expiration: 2034-03-21
Also published as: CN104928270A

Abstract

本发明公开了一组耐EDTA的碱性木聚糖酶和编码基因及其构建方法。采用定点诱变技术将碱性木聚糖酶酶编码基因xynA突变，得到突变基因xynA‑M‑W19Y、xynA‑M‑W19F和xynA‑M‑W19H，将其在E.coli BL21(DE3)进行诱导、表达、纯化，将纯化后的酶进行酶活测定，得到的木聚糖酶突变体XynA‑M‑W19Y、XynA‑M‑W19F和XynA‑M‑W19H具有较好的耐EDTA能力，其中在pH9.2，60℃，5mM EDTA的条件下，突变体W20Y的酶活比野生型XynA高近20％。这为碱性木聚糖酶的广泛应用奠定了良好的基础。

Description

一组耐螯合剂乙二胺四乙酸的重组碱性木聚糖酶及其构建方法

技术领域

本发明属于工业酶开发利用领域，特别涉及一组耐螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)的重组碱性木聚糖酶和其编码基因，及其构建方法。

技术背景

造纸工业是世界上六大污染工业之一，我国造纸行业年排放废水量达40万吨，占全国工业废水排放量的1/6。多年来，人们不懈地努力，试图开发出无污染和高效率的制浆造纸新工艺，以减少污染，保护环境。造纸工艺中的制浆和漂白工序是污染物产生的主要工序。生物技术可以帮助解决这些问题，其中最具吸引力和挑战性的是生物制浆和生物漂白。因为造纸工业废水主要由蒸煮黑液和漂白废液组成，采用生物制浆和生物漂白可以有效减少这些废液的产生。传统的化学漂白法是采用多段的氯/二氧化氯漂白及碱提取来去掉木质素，在废水中会含有大量含氯的、致癌致畸的物质，如呋喃、二噁英等，造成严重的环境污染和生态破坏。80年代初，西方工业国家工业污染控制战略出现了重大变革，以污染预防取代了污染治理。芬兰率先将生物漂白技术引进纸浆造纸工业中。用木聚糖酶对纸浆进行预漂白，可以减少随后的化学漂白用氯量30％-40％，废液中有机氯化物与毒化物含量显著减少。酶法助漂新工艺在欧洲和北美的30余家大型纸厂得到应用，成为生物技术在造纸工业应用最成功的一例。采用基因工程与蛋白质工程手段获得性质优良的耐热耐碱耐化学试剂的木聚糖酶已成为各相关实验室的研究热点。

木聚糖是一种多聚五碳糖，是植物细胞中主要的半纤维素成分。木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚木糖和木糖的水解酶，它在饲料、造纸、食品、能源工业和环境科学上有着广阔的应用前景。目前一些国家已经开展使用木聚糖酶漂白纸浆，如欧洲、北美、南美、日本等，将酶作为工业漂白预漂剂。木聚糖酶助漂新工艺已成为发达国家造纸工业中较为成熟的生物技术，在加拿大有超过10％的硫酸盐漂白浆采用了木聚糖酶漂白。1986年，在国际造纸工艺生物技术研讨会上，芬兰人Viikari等首次报道，松木和桦木Kraft浆经过木聚糖酶预处理后可以降低漂白氯耗，提高白度。

本发明前期研究的碱性木聚糖酶基因xynA来源于短小芽孢杆菌Bacilluspumilus，含有687bp的开放阅读框，编码228个氨基酸，通过信号肽预测工具SignalP分析，显示该氨基酸序列含有27个氨基酸的信号肽。将该基因的成熟片段xynA-M在大肠杆菌中进行了表达，表达所得成熟木聚糖酶经纯化后进行酶学性质的研究表明，这种碱性木聚糖酶在pH9.2、60℃和5mM EDTA条件下，酶活显著降低。

在工业应用中，大部分碱性木聚糖酶不具备耐螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)的能力，在造纸漂白工艺中，据芬兰统计，其国内超过1/2的化学浆厂和2/3的机械浆厂在使用螯合剂。随着TCF(Total Chlorine Free)和ECF(Elemental Chlorine Free)漂白流程以及水封闭循环的更广泛应用，EDTA在全世界的用量有不断增加的趋势，对螯合剂的研究也得到更多地重视，因此，获得更多高效、稳定的耐EDTA的碱性木聚糖酶有利于推动木聚糖酶在溶解纸浆和漂白纸浆生产中发挥重要作用。

发明内容

本发明的目的是提出一组高效、稳定的耐乙二胺四乙酸(EDTA)的重组碱性木聚糖酶及编码基因，及其构建方法。

本发明是这样实现的。在GenBank收录号EU421717.1中含有的木聚糖酶基因xynA，对应木聚糖酶XynA的氨基酸序列收录号为ACA00160.1，除去N-段的27个氨基酸信号肽，剩下的201个氨基酸是该木聚糖酶的成熟片段XynA-M，对应的木聚糖酶基因成熟片段是xynA-M。针对xynA-M，分别设计点突变引物(FP1：、RP1、FP2、RP2、FP3和RP3，序列如下)进行定点诱变。利用突变引物FP1和RP1将公布的基因56、57位的鸟嘌呤G分别变成腺嘌呤A和胸腺嘧啶T，利用突变引物FP2和RP2将公布的基因将56、57位的鸟嘌呤G分别变成胸腺嘧啶T和胞嘧啶C，利用突变引物FP3和RP3将公布的基因将55、56和57位的胸腺嘧啶T、鸟嘌呤G分别变成胞嘧啶C、腺嘌呤A和胞嘧啶C，使得编码的木聚糖酶的成熟肽第19位的色氨酸W分别突变成酪氨酸Y、苯丙氨酸F和组氨酸H，获得一组耐5～10mM EDTA的重组碱性木聚糖酶基因xynA-M-W19Y、xynA-M-W19F和xynA-M-W19H。

重组碱性木聚糖酶基因xynA-M-W19Y的氨基酸序列具体如下：

其G、G分别变A、T的DNA序列如下：

重组碱性木聚糖酶基因xynA-M-W19的氨基酸序列具体如下：

其G、G分别变T、C的DNA序列如下：

重组碱性木聚糖酶基因xynA-M-W19H的氨基酸序列具体如下：

其T、G、G分别变C、A、C的DNA序列如下：

本发明的重组碱性木聚糖酶蛋白质XynA-M-W19Y、XynA-M-W19F和XynA-M-W19H构建方法，具体包括如下步骤：

1)采用化学全合成或PCR方法克隆得到xynA(收录号ACA00160.1)，其氨基酸序列如下面SEQ NO.1所示：

SEQ No.1

其中，该酶基因编码201个氨基酸，N端27个氨基酸为信号肽序列如下面SEQ NO.3所示：

SEQ No.3

1MNLKRLRLLF VMCIGFVLTL TAVPAHA27

因此，成熟的碱性木聚糖酶XynA-M理论分子量为22KDa，其氨基酸序列如下面SEQNO.2所示：

SEQ No.2

设计引物FP和RP，并分别引入BamHI、HindIII酶切位点，采用PCR方法分离克隆了成熟木聚糖酶基因xynA-M，全长606个碱基(包括终止密码子)，将基因xynA-M用限制性内切酶BamHI和HindIII酶切处理，琼脂糖凝胶电泳胶回收，得到酶切产物xynA-M；

FP：CGCGGATCCGAGACAATCTACGACAACCG

RP：CCCAAGCTTCTGCAGTTATCTGCCGATC

2)将步骤1)获得的酶切产物xynA-M连接到用两种同样限制性内切酶酶切过的大肠杆菌表达载体pET28a(+)上，得到重组载体pET28a-xynA-M；

3)分别设计将成熟肽的第19位氨基酸W突变成Y的点突变引物FP1和RP1，将第19位氨基酸W突变成F的点突变引物FP2和RP2，以及将第19位氨基酸W突变成H的点突变引物FP3和RP3：

FP1：5′CTTCGAGCTGTATAAGGACTACGGCAACACGAGCATGACGCTG3′

RP1：5′TCATAGCCGCTGTGCGTGCCGATGCGGTTG3′

FP2：5′CTTCGAGCTGTTCAAGGACTACGGCAACACGAGCATGACGCTG3′

RP2：5′TCATAGCCGCTGTGCGTGCCGATGCGGTTG3′

FP3：5′CTTCGAGCTGCACAAGGACTACGGCAACACGAGCATGACGCTG3′

RP3：5′TCATAGCCGCTGTGCGTGCCGATGCGGTTG3′

将步骤2)获得的重组载体pET28a-xynA-M作为模板进行全质粒反向PCR，体系为：5×Fast Pfu Buffer，10μl；dNTP，5μl；模板pET28a-xynA，0.3μl；10μM的点突变引物FP(FP1、FP2、FP3)和RP(RP1、RP2、RP3)各1.5μl，Fastpfu，0.5μl，加灭菌ddH₂O至50μl。(空白对照：将以上体系中的DNA模板换成ddH₂O，其他不变)

PCR扩增条件为95℃/2分钟；95℃/30秒，55℃/30秒，72℃/3分钟，35个循环；72℃/10分钟，4℃/∞。

4)将步骤3)获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用PCR产物回收试剂盒回收PCR片段，用限制性内切酶DpnI和T4多聚核苷酸激酶(PNK)对回收的PCR片段进行模板消解和磷酸化，体系为：DpnI，1μl；PNK，1μl，10×Ferments Digest Buffer，2μl；dATP2μl；PCR片段，10μl，加灭菌ddH₂O至20μl。37℃处理12小时，70℃处理15分钟灭活后，向上述体系中加入T4Ligase Buffer，1μl；PEG4000，1μl；T4Ligase，1μl。置于22℃金属浴保温30分钟后，直接转化到大肠杆菌BL21(DE3)表达感受态细胞中，各挑选两个转化子经测序验证后，分别得到含点突变的重组载体的重组菌株BL21(DE3)/pET28a-xynA-M-W19Y、BL21(DE3)/pET28a-xynA-M-W19F和BL21(DE3)/pET28a-xynA-M-W19H；

5)将重组菌株BL21(DE3)/pET28a-xynA-M-W19Y、BL21(DE3)/pET28a-xynA-M-W19F和BL21(DE3)/pET28a-xynA-M-W19H按照常规的大肠杆菌诱导表达重组蛋白方法，获得重组蛋白XynA-M-W19Y、XynA-M-W19F和XynA-M-W19H，测定木聚糖酶的活性。

本发明采用定点突变技术将短小芽孢杆菌Bacillus pumilus的碱性木聚糖酶成熟肽编码基因xynA-M进行定点突变并克隆连接到大肠杆菌表达载体pET28a(+)上，转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)感受态中，筛选重组子表达菌株，经诱导表达、破菌、纯化获得突变体蛋白XynA-M-W19Y、XynA-M-W19F和XynA-M-W19H(附图1)，测定突变体蛋白的活性，发现突变体是一组耐EDTA、酶活稳定的碱性木聚糖酶，该重组木聚糖酶突变体在0mM、1mM、5Mm、10mM EDTA(pH9.2，60℃)条件下，酶活有明显的递增趋势，而原始酶XynA-M酶活有下降趋势(附图2)。其中，10mM EDTApH9.260℃条件下XynA-M-W19Y比酶活比XynA-M高接近20％，这为碱性木聚糖酶的广泛应用奠定了良好的基础。

本发明通过定点诱变技术提高了碱性木聚糖酶的耐EDTA的活性。这种碱性木聚糖酶的推广应用，不仅在工业生产发展中产生可观的经济效益和社会效益，同时也可产生巨大的生态效益。例如在造纸工业的生物助漂中，利用高效的，耐EDTA的碱性木聚糖酶，可减少漂白用化学助剂的使用，节约大量工艺用水、生产时间、能耗、原料及对废水的处理费用，减少对环境排放水中的盐含量及COD，最大程度的保护生态环境。

附图说明：

附图1：重组木聚糖酶纯化的SDS-PAGE电泳检测。M：蛋白质分子量标准；1-4：分别是XynA-M、XynA-M-W19Y、XynA-M-W19F和XynA-M-W19H纯化后酶液；5-8：分别是XynA-M、XynA-M-W19Y、XynA-M-W19F和XynA-M-W19H发酵粗酶液；

附图2：XynA-M、XynA-M-W19Y、XynA-M-W19F和XynA-M-W19H蛋白在pH为9.2、60℃及不同EDTA浓度下的相对酶活。

具体实施方式

以下为列举的实施例，以便于更好地理解本发明。

实施例一

本发明公开了一组耐EDTA的碱性木聚糖酶和编码基因，其特征在于在GenBank收录号EU421717.1中含有的碱性木聚糖酶基因xynA，对应木聚糖酶xynA的氨基酸序列收录号为ACA00160.1，除去N-段的27个氨基酸信号肽，剩下的201个氨基酸是该木聚糖酶的成熟片段XynA-M，对应的木聚糖酶基因成熟片段是xynA-M。针对xynA-M，分别设计点突变引物(FP1、RP1、FP2、RP2、FP3、RP3)进行定点诱变，将公布的基因56、57位的鸟嘌呤G分别变成腺嘌呤A和胸腺嘧啶T，将56、57位的鸟嘌呤G分别变成胸腺嘧啶T和胞嘧啶C，将55、56和57位的胸腺嘧啶T、鸟嘌呤G分别变成胞嘧啶C、腺嘌呤A和胞嘧啶C，使得其编码氨基酸序列成熟肽的第19位的色氨酸W(TGG)分别突变成酪氨酸Y(TAT)、苯丙氨酸F(TTC)、组氨酸H(CAC)，获得一组耐5～10mM EDTA的重组碱性木聚糖酶基因xynA-M-W19Y、xynAW-M-19F和xynA-M-W19H。

本发明的重组木聚糖酶及其编码基因的构建方法包括如下步骤：

1)采用化学全合成或PCR方法克隆得到xynA，设计引物FP、RP，并引入限制性内切酶BamHI、HindIII酶切位点，采用PCR方法分离克隆了成熟木聚糖酶基因xynA-M，全长606个bp，将xynA基因用限制性内切酶BamHI和HindIII酶切处理，琼脂糖凝胶电泳胶回收，得到酶切产物xynA；

FP：CGCGGATCCGAGACAATCTACGACAACCG

RP：CCCAAGCTTCTGCAGTTATCTGCCGATC

2)将步骤1)获得的酶切产物xynA-M连接到用两种同样限制性内切酶酶切过的大肠杆菌表达载体pET28a(+)上，得到重组载体pET28a-xynA-M，转化大肠杆菌Trans5α，提取质粒，用限制性内切酶BamHI、HindIII酶切验证；

3)分别设计将碱性木聚糖酶成熟肽的第19位氨基酸W突变成Y的点突变引物FP1和RP1，将第19位氨基酸W突变成F的点突变引物FP2和RP2，以及将第19位氨基酸W突变成H的点突变引物FP3和RP3：

FP1：5′CTTCGAGCTGTATAAGGACTACGGCAACACGAGCATGACGCTG3′

RP1：5′TCATAGCCGCTGTGCGTGCCGATGCGGTTG3′

FP2：5′CTTCGAGCTGTTCAAGGACTACGGCAACACGAGCATGACGCTG3′

RP2：5′TCATAGCCGCTGTGCGTGCCGATGCGGTTG3′

FP3：5′CTTCGAGCTGCACAAGGACTACGGCAACACGAGCATGACGCTG3′

RP3：5′TCATAGCCGCTGTGCGTGCCGATGCGGTTG3′

将步骤2)获得的重组载体pET28a-xynA-M作为模板进行全质粒反向PCR，体系为：5×Fast Pfu Buffer，10μl；dNTP，5μl；模板pET28a-xynA-M，0..3μl；10μM的点突变引物FP(FP1、FP2、FP3)和RP(RP1、RP2、RP3)各1.5μl；FastPfu，0.5μl；加灭菌ddH₂O至50μl。(空白对照：将以上体系中的模板换成ddH₂O，其他不变)

4)将步骤3)获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用TIANGEN的PCR产物回收试剂盒回收PCR片段，用限制性内切酶DpnI和T4多聚核苷酸激酶(PNK)对回收的PCR片段进行模板消解和磷酸化，体系为：DpnI，1μl；PNK，1μl，10×Ferments Digest Buffer，2μl；dATP2μl；PCR片段，10μl，加灭菌ddH₂O至20μl。37℃处理12小时，70℃处理15分钟灭活后，向上述体系中加入T4Ligase Buffer，1μl；PEG4000，1μl；T4Ligase，1μl。置于22℃金属浴保温30分钟后，直接转化到大肠杆菌BL21(DE3)表达感受态细胞中，各挑选两个转化子经测序验证后，分别得到含点突变的重组载体的重组菌株BL21(DE3)/pET28a-xynA-M-W19Y、BL21(DE3)/pET28a-xynA-M-W19F和BL21(DE3)/pET28a-xynA-M-W19H；

实施例二

培养基：LB抗性培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl10g/L，卡那霉素50μg/mL；

培养方法：将实施例1的重组菌株BL21(DE3)/pET28a-xynA-M-W19Y、BL21(DE3)/pET28a-xynA-M-W19F和BL21(DE3)/pET28a-xynA-M-W19H在LB抗性平板上活化制备种子后，以1：100的接种量转入液体LB培养基中，37℃，200rpm条件下培养至OD₆₀₀为0.6～0.8，加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.5mM，再于18℃，200rpm条件下培养8小时。

将诱导得到的菌体超声波破菌，过HIS柱进行纯化浓缩，得到纯化的木聚糖酶突变体XynA-M-W19Y、XynA-M-W19F和XynA-M-W19H。

实施例三

木聚糖酶酶活测定方法：取稀释酶液20μl，加入380μl1％木聚糖(山毛榉木聚糖，pH9.2甘氨酸-NaOH缓冲液配置)溶液，混匀，置于60℃保温10分钟，立即加入600μl3，5——二硝基水杨酸(DNS)，煮沸7分钟，测定OD₅₄₀nm值。空白对照为先失活的酶液(即：先取20μl酶液于100℃水浴失活5分钟，再加入底物反应10分钟)。以每分钟催化生成1μmol木糖所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。

酶活计算公式：A＝(M*V1*C)/(V2*T)

式中：A——酶活(U/ml)

M——酶液稀释倍数

V1——酶反应体积(ml)

C——木糖浓度(μmol/ml)，可根据木糖标准曲线和测定的OD540计算得出

V2——酶液体积(ml)

T——反应时间(min)

碱性木聚糖酶耐EDTA性能测定：分别配置含0mM、1mM、5mM、10mM、20mM EDTA的1％木聚糖底物(山毛榉木聚糖，pH9.2甘氨酸-NaOH缓冲液配置)，取稀释酶液20μl，分别加入380μl含不同浓度EDTA的上述已配置好的1％木聚糖底物，于60℃保温10分钟，立即加入600μl DNS(3，5——二硝基水杨酸)，煮沸7分钟，测定OD₅₄₀nm值。实验做3个平行，以xynA-M酶液在0mM EDTA，pH9.2，60℃条件下测得的酶活为100％，测定如图2所示的酶活结果，实验数据用Microsoft Excel分析。

以未突变的菌株作为对照，通过蛋白电泳(SDS-PAGE)得到一条分子量大小约为22kDa的蛋白条带(附图1)，蛋白条带纯度达90％以上。对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明权利要求的保护范围。

Claims

1.一种耐 EDTA 的重组碱性木聚糖酶，其特征在于：在 GenBank 收录号 EU421717.1中含有的碱性木聚糖酶基因xynA，对应成熟木聚糖酶基因 xynA-M，分别设计点突变引物FP1和RP1，进行定点诱变，将公布的基因第56、57 位的鸟嘌呤G分别变成腺嘌呤A和胸腺嘧啶T，使得其编码氨基酸序列成熟肽的第19位的色氨酸W突变成酪氨酸Y，获得耐5～ 10mMEDTA 的重组碱性木聚糖酶XynA-M-W19Y。

2.一种耐 EDTA 的重组碱性木聚糖酶的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

1）PCR 方法克隆得到权利要求1中所述的碱性木聚糖酶基因xynA；

2）设计引物FP、RP，并引入BamHI、HindIII 酶切位点，采用PCR方法分离克隆了成熟木聚糖酶基因xynA-M，全长606个bp，将xynA-M基因用限制性内切酶BamHI和HindIII 酶切处理，琼脂糖凝胶电泳胶回收，得到酶切产物xynA-M；

FP：CGCGGATCCGAGACAATCTACGACAACCG

RP：CCCAAGCTTCTGCAGTTATCTGCCGATC

3）将步骤2）获得的成熟木聚糖酶基因xynA-M连接到大肠杆菌表达载体pET28a上，得到重组载体pET28a-xynA-M；

4）设计将成熟肽的第19位氨基酸W突变成Y的点突变引物FP1和RP1：

FP1：5’CTTCGAGCTGTATAAGGACTACGGCAACACGAGCATGACGCTG 3’；

RP1：5’TCATAGCCGCTGTGCGTGCCGATGCGGTTG 3’；

将步骤 3）获得的重组载体pET28a-xynA-M作为模板进行全质粒反向PCR；

5）将步骤 4）获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收PCR片段，用DpnI、PNK对回收的PCR片段进行去模板消解和磷酸化，体系为：1μl DpnI，1μl PNK，2μl 10×FD buffer，2μldATP，10μl PCR片段，加灭菌ddH₂O至20μl；37℃处理12小时，70℃处理15 分钟灭活后，向上述体系中加入1μl T4Ligase Buffer，1μl PEG4000，1μl T4Ligase，置于22℃金属浴保温30分钟后，直接转化到大肠杆菌 BL21(DE3) 表达感受态细胞中，挑选两个转化子经测序得到含点突变的重组载体的重组菌株BL21(DE3)／ ET28a-xynA-M-W19Y ；

6）将重组菌株BL21(DE3)／pET28a-xynA-M-W19Y按照常规的大肠杆菌诱导表达重组蛋白方法，获得重组蛋白XynA-M-W19Y，测定木聚糖酶的活性。