CN104450650B - 一种碱性木聚糖酶突变体及其应用 - Google Patents

一种碱性木聚糖酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明的目的是提供一种碱性木聚糖酶突变体及其应用，通过对来源于芽孢杆菌的木聚糖酶进行蛋白质工程改造，获得了突变体蛋白，其耐热性、最适反应pH得到显著提高，有利于其在造纸领域的广泛应用。本发明的木聚糖酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO：3。本发明提供的木聚糖酶突变体XynT6最适pH值为9.0，在pH7.0‑10.0范围内能保持75％以上的酶活，且突变体在碱性条件下的酶活性水平明显高于野生型；木聚糖酶突变体XynT6的最适作用温度为60℃，且在65℃条件下仍能保持80％左右的酶活，比野生型具有更强的耐热性。本发明提供的木聚糖酶突变体XynT6，能有效提高纸浆的白度，有利于造纸企业改进纸浆漂白工艺，减少化学漂白剂的使用，减轻环境污染，应用前景广阔。

Description

一种碱性木聚糖酶突变体及其应用
技术领域
本发明属于功能基因改造技术领域，具体涉及一种碱性木聚糖酶突变体及其应用。
技术背景
木聚糖酶(Xylanase)是指能专一降解半纤维素木聚糖为低聚木糖和木糖的一组酶的总称。它在饲料、烘焙、啤酒、造纸、纺织、医药及能源等领域得到了日益广泛的应用。特别在纸浆漂白工艺中，木聚糖酶的应用能够降低含氯化合物的用量，促使纸浆中残余木质素的降解和溶解性木质素的抽除，不但可以提高纸浆的白度和白度稳定性，改善纤维的滤水性和造纸性能，而且可以降低后续工艺化学物质的用量，减少富含氯化物的工业废水的排放，对有效降低环境污染，解决严重困扰造纸业的污染问题具有极大的现实意义。
目前，以无元素氯和全无氯漂白工艺为代表的纸浆漂白已经成为世界各国造纸业纸浆漂白发展的必然趋势，木聚糖酶酶法助漂新工艺已在欧洲和北美的30余家大型纸厂得到应用，丹麦诺维信公司等多家酶制剂厂商，纷纷推出了专门用于纸浆漂白的木聚糖酶和纤维素酶新产品。但目前为止，工业上用的木聚糖酶主要来自细菌和真菌，报道较多及产酶活力较高的微生物主要是黑曲霉、木霉和青霉等真菌，它们所产的酶大多为中性偏酸的木聚糖酶，最适反应温度大多在50℃以下。而在造纸工业中，纸浆蒸煮和漂白工艺基本都是在高温和强碱的条件下进行，使得现有的酸性或中性木聚糖酶产品受到了极大的限制。因此，研究开发具有优良特性的碱性木聚糖酶具有重大经济效益和社会效益，具有更广的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种碱性木聚糖酶突变体及其应用。本发明通过对来源于芽孢杆菌(Bacillus Sp.)的木聚糖酶进行蛋白质工程改造，获得了突变体蛋白，其耐热性、最适反应pH得到显著提高，有利于其在造纸领域的广泛应用。
申请人对芽孢杆菌木聚糖酶进行突变，经过大量的筛选，发现Q65R、F80Y、E82T、K162H、A218S、L332H这六个突变位点能引起木聚糖酶耐热性、最适反应pH的改变，从而促成本发明。
本发明一方面提供了一种木聚糖酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO：1的木聚糖酶的第65位氨基酸由Gln变为Arg，第80位氨基酸由Phe变为Tyr，第82位氨基酸由Glu变为Thr，第162位氨基酸由Lys变为His，第218位氨基酸由Ala变为Ser，第332位氨基酸由Leu变为His。
上述木聚糖酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：3，其一种编码基因的核酸序列为SEQ ID NO：4。
本发明另一方面提供了携带有编码序列为SEQ ID NO：4的木聚糖酶突变体基因的质粒。
将上述质粒转入毕赤酵母中进行重组表达，获得的木聚糖酶突变体耐热性、最适反应pH得到很大提高。
本发明提供的木聚糖酶突变体XynT6最适pH值为9.0，在pH7.0-10.0范围内能保持75％以上的酶活，且突变体在碱性条件下的酶活性水平明显高于野生型；木聚糖酶突变体XynT6的最适作用温度为60℃，且在65℃条件下仍能保持80％左右的酶活，比野生型具有更强的耐热性。本发明提供的木聚糖酶突变体XynT6，能有效提高纸浆的白度，有利于造纸企业改进纸浆漂白工艺，减少化学漂白剂的使用，减轻环境污染，应用前景广阔。
附图说明
图1为SDS-PAGE电泳图；
其中：M为蛋白分子量Marker，泳道1为转空载体对照菌，泳道2为毕赤酵母XynT6发酵粗酶液；
图2为木聚糖酶突变体XynT6的发酵曲线；
图3为木聚糖酶突变体XynT6与野生型XynA1的最适作用pH比较图；
图4为木聚糖酶突变体XynT6与野生型XynA1的最适作用温度比较图。
具体实施方式
本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,3nd Ed.(Sambrook,2001)和CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。
下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述。
实施例1 木聚糖酶基因的扩增
根据公共基因数据库中的基因序列，优化了合成基因的密码子并人工合成碱性木聚糖酶基因XynA1(序列为SEQ ID NO：2)，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。
采用PCR反应克隆碱性木聚糖酶基因XYNA1片段，引物和反应条件如下：
引物1(F)：GCGCGAATTCGCTATTACTTCTAACGAGAT
引物2(R)：TAAAGCGGCCGCTTATCTAATTTCCAAGTAAT
反应条件为：94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸1min，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖电泳结果显示，XynA1基因为大小984bp的片段。
实施例2 木聚糖酶突变体的构建及筛选
为了提高来源于芽孢杆菌的木聚糖酶XynA1的耐热性及最适反应pH，通过定向进化技术对该酶进行了大量突变的筛选。
以XynA1基因为模板，以引物1、2用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒(Stratagene)进行PCR扩增，胶回收PCR产物，EcoRI、NotI进行酶切处理后与经同样酶切后的pET21a载体连接，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于LB+Amp平板，37℃倒置培养，待转化子出现后，用牙签逐个挑至96孔板，每个孔中加入150ul含有0.1mM IPTG的LB+Amp培养基，37℃220rpm培养6h左右，离心弃上清，菌体用pH 8.0的缓冲液重悬，反复冻融破壁，获得含有木聚糖酶的大肠杆菌细胞裂解液。
分别取出30μl裂解液至两块新的96孔板，其中一块于60℃处理10min后，稀释到pH9.0的缓冲液中，另一块不处理稀释到pH 8.0的缓冲液中，分别加入相同pH值的30μl底物，于37℃反应30min后，DNS法测定生成的还原糖，不同的突变子经过高温处理后保持的活性不同，在不同pH值下保持的活性不同。结果发现有些突变对木聚糖酶的活性没有影响，有些突变甚至使其活性降低了，对依然保持高活性的突变子进行DNA测序，最终，申请人获得了能提高木聚糖酶耐热性、最适反应pH的突变组合Q65R、F80Y、E82T、K162H、A218S、L332H。
含Q65R、F80Y、E82T、K162H、A218S和L332H六点突变的木聚糖酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO：3，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO：4。
将木聚糖酶突变体基因命名为XynT6，用引物1、2进行PCR扩增，引物两端引入EcoRI、Not I位点。PCR反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸1min，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖凝胶电泳结果显示，XynT6基因为大小984bp的片段。
实施例3 毕赤酵母工程菌株的构建
将上述克隆得到的木聚糖酶突变体基因XynT6片段，通过EcoR I和Not I位点与表达载体pPIC9K相连接，构建表达载体pPIC9K-XynT6。
将表达质粒pPIC9K-XynT6用Sal I进行线性化，表达质粒线性化片段通过电穿孔法转化毕赤酵母GS115，在MD平板上筛选得到毕赤酵母重组菌株GS115/pPIC9K-XynT6，然后在含不同浓度遗传霉素的YPD平板上筛选多拷贝的转化子。
将一个转化子命名为毕赤酵母XynT6(Pichia pastoris XynT6)，转接于BMGY培养基中，30℃、250rpm振荡培养1d；再转入BMM培养基中，30℃、250rpm振荡培养；每天添加0.5％的甲醇，诱导表达4d；离心去除菌体，得到含木聚糖酶XynT6的发酵上清液；将其进行SDS-PAGE电泳检测分析，结果如图1所示：发酵上清液中重组木聚糖酶突变体XynT6的分子量大小约为36kDa，与预期一致。
通过上述同样的酶切连接方法将野生型木聚糖酶基因XynA1克隆到毕赤酵母GS115宿主中，构建得到重组表达野生型木聚糖酶的毕赤酵母工程菌，命名为毕赤酵母XynA1(Pichia pastoris XynA1)。摇瓶水平发酵毕赤酵母XynA1，30℃、250rpm振荡培养；每天添加0.5％的甲醇，诱导表达4d；离心去除菌体，得到含重组野生型木聚糖酶XynA1的发酵上清液。
(1)木聚糖酶活单位的定义
在50℃、pH值为8.0的条件下，每分钟从浓度为5mg/ml的木聚糖溶液中释放1μmol还原糖所需要的酶量即为一个酶活力单位U。
(2)酶活测定方法
取2ml浓度为1％的木聚糖底物(pH8.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制)，加入到比色管中，50℃平衡10min，再加入2ml经pH8.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液适当稀释并经50℃平衡好的碱性木聚糖酶酶液，混匀于50℃精确保温反应30min。反应结束后，加入5ml DNS试剂，混匀以终止反应。然后沸水浴煮沸5min，用自来水冷却至室温，加水定容至25ml，混匀后，以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光值AE。
酶活计算公式：
X D = [ ( A E - A B ) × K + C 0 ] M × t × N × 1000
式中：XD为稀释酶液中木聚糖酶的活力，U/ml；AE为酶反应液的吸光度；AB为酶空白液的吸光度；K为标准曲线的斜率；C0为标准曲线的截距；M为木糖的摩尔质量，150.2g/mol；t为酶解反应时间，min；N为酶液稀释倍数；1000为转化因子，1mmol＝1000μmol。
(3)酶活测定结果
按照上述方法测定毕赤酵母XynA1发酵上清液的酶活为260U/ml，而毕赤酵母XynT6发酵上清液的酶活达到329U/mL。
实施例4 发酵验证
在10升发酵罐上分别进行毕赤酵母XynPF和毕赤酵母XynT6的发酵，发酵使用的培养基配方为：硫酸钙1.1g/L、磷酸二氢钾5.5g/L、磷酸二氢铵55g/L、硫酸钾20.3g/L、硫酸镁16.4g/L、氢氧化钾1.65g/L、消泡剂0.05％。
发酵生产工艺：pH值5.0、温度30℃、搅拌速率300rpm、通风量1.0-1.5(v/v)、溶氧控制在20％以上。
整个发酵过程分为三个阶段：第一阶段为菌体培养阶段，按7％比例接入种子，30℃培养24-26h，以补完葡萄糖为标志；第二阶段为饥饿阶段，当葡萄糖补完之后，不流加任何碳源，当溶氧上升至80％以上表明该阶段结束，为期约30-60min；第三阶段为诱导表达阶段，流加甲醇诱导，并且保持溶氧在20％以上，培养时间在150-180h之间。发酵结束后，发酵液通过板框过滤机处理后获得粗酶液。
采用实施例3所述木聚糖酶酶活测定方法对粗酶液进行检测，结果如图2所示，重组表达木聚糖酶突变体的毕赤酵母XynT6最终的发酵酶活高达1984U/ml。
实施例5 酶学性质分析
1、最适作用pH分析
采用pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的缓冲液，将发酵的粗酶液进行稀释测定，木聚糖底物也分别用对应pH值的缓冲液配制，在37℃下进行木聚糖酶活力测定，计算酶活，以最高酶活为100％，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线。结果如图3所示，野生型木聚糖酶XynA1的最适反应pH值为8.0，木聚糖酶突变体XynT6的最适反应pH值为9.0，并且在pH7.0-10.0范围内能保持75％以上的活性。
2、最适作用温度分析
分别在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃，pH8.0条件下，测定发酵粗酶液的木聚糖酶活力，以最高酶活为100％，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线。结果如图4所示，野生型木聚糖酶XynA1的最适反应温度为50℃，在60℃条件下相对酶活低于30％，而木聚糖酶突变体XynT6的最适反应温度为60℃，且在65℃条件下仍能保持80％左右的酶活。
实施例6 木聚糖酶突变体XynT6在纸浆漂白中的应用
1、材料
1)碱性木聚糖酶：本发明所述木聚糖酶突变体XynT6，酶活10000IU/mL。
2)纸浆样品：西安奥辉纸业有限公司未漂麦草浆。
2、方法
将从纸厂生产线上采集的麦草纸浆用蒸馏水稀释至5％浆浓，调整pH值为9.0-10.0，取500mL稀释后的纸浆，放入塑料袋中，按20IU/g绝干浆的比例向纸浆中加入本发明所述碱性木聚糖酶突变体XynT6，充分混合好密封，放入50℃恒温水浴锅中处理1h，处理过程中每隔10min揉动。同时设定对照组，对照组纸浆中不添加碱性木聚糖酶，其他操作同上。反应结束后，对塑料袋中的纸浆分别进行卡伯值和白度的测定。其中卡伯值的测定按GBT1546-2004进行，纸浆白度测定按GB T7974-2002进行。
经检测，对照组纸浆的卡白值为17.2，白度为5.6％D65，而经碱性木聚糖酶突变体XynT6处理后的纸浆卡白值为13.1，比对照组降低了4.1，白度为6.6％D65，比对照组提高了1％D65。从而说明本发明提供的碱性木聚糖酶突变体XynT6，能有效提高纸浆的白度，有利于造纸企业改进纸浆漂白工艺，减少化学漂白剂的使用，减轻环境污染。

Claims (7)

1.一种木聚糖酶突变体，其特征在于，所述的突变体是氨基酸序列为SEQ ID NO：1的木聚糖酶的第65位氨基酸由Gln变为Arg，第80位氨基酸由Phe变为Tyr，第82位氨基酸由Glu变为Thr，第162位氨基酸由Lys变为His，第218位氨基酸由Ala变为Ser，第332位氨基酸由Leu变为His。
2.如权利要求1所述的木聚糖酶突变体，所述的突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：3。
3.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的木聚糖酶突变体。
4.如权利要求3所述的基因，所述基因的核酸序列为SEQ ID NO：4。
5.一种重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒携带有权利要求3所述的基因。
6.权利要求1所述的木聚糖酶突变体在造纸领域中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的应用是用于提高纸浆的白度。
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