CN104922317B

CN104922317B - 灯心草菲类有效部位及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN104922317B
Application number: CN201410106877.9A
Authority: CN
Inventors: 黄建梅; 李贵云; 段天璇; 詹雪艳; 王杨
Original assignee: Beijing University of Chinese Medicine
Current assignee: Beijing University of Chinese Medicine
Priority date: 2014-03-21
Filing date: 2014-03-21
Publication date: 2020-09-25
Anticipated expiration: 2034-03-21
Also published as: CN104922317A

Abstract

本发明涉及灯心草菲类有效部位及其制备方法和其在制备抗焦虑药物中的用途，所述有效部位包含高于50%的厄弗酚、去氢厄弗酚、灯心草酚和去氢灯心草酚，所述制备方法包括如下步骤：取灯心草茎髓部，用乙醇水溶液回流提取；将得到的提取液合并并且浓缩，随后用乙酸乙酯超声萃取，合并提取液，将合并后的提取液浓缩，干燥，得到干燥乙酸乙酯粗提物；取干燥乙酸乙酯粗提物，经过硅胶柱色谱或者高速逆流色谱分离，即可获得菲类有效部位。

Description

灯心草菲类有效部位及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及灯心草菲类有效部位及其制备方法和其在制备抗焦虑药物中的用途，属于医药技术领域。

背景技术

灯心草是灯心草属植物灯心草（Juncus effuses L.）的干燥茎髓，味甘、淡，微寒。归心、肺、小肠经。能清心火，利小便。用于心烦失眠等症。灯心草含有菲类、黄酮类、萜类、甾体及挥发油等成分，其中，菲类化合物为其主要成分之一。20世纪90年代，主要是国外学者Della Greca及Asakawa等对灯心草的化学成分和抗肿瘤、细胞毒性、抗氧化、抗微生物以及灭藻活性进行研究。近年来，杨光忠、单承莺等研究团队也开始致力于对灯心草的化学成分及抗菌活性的研究。

灯心草活性成分的制备方法主要是溶剂提取法。灯心草提取物的具体成分随提取工艺分离的不同而不同，因此不同的提取分离工艺得到的提取物的活性并不相同。例如，中国专利申请No.201110111208.7公开了采用水、含水低级醇、低级醇、乙酸乙酯、石油醚或它们的混合溶剂提取灯心草所得到的提取物可以用于制备抗肿瘤或抑制血管生成药物、保健食品或化妆品。另外，另一项研究表明了灯心草的95%乙醇（v/v）提取物的乙酸乙酯萃取部位具有明显的镇静催眠作用，而乙醚萃取部位和水萃取部位无镇静催眠作用（王衍龙等人，北京中医药大学学报，第29卷，第3期:181-183，2006）。

药材灯心草所含的成分复杂，大量的研究集中在对其化学成分及结构的研究方面。在对灯心草的提取物进行进一步分离时，通常是采用经典柱色谱法对灯心草提取物进行系统分离，目标是获得单一成分，从而对分离出所获得成分的结构进行研究鉴定。

上述单一成分的制备方法常用于基础研究，并不适用于制备中药产品。主要原因在于，一方面，单一成分的制备方法通常涉及复杂的工艺，从而导致生产成本高昂；另一方面，单一成分制备过程不仅复杂，而且制备过程中常将中药中具有相同生物活性的其他成分去除，造成资源浪费。

另外，如果利用现有的提取方法对灯心草进行提取，则所得到的粗提物中含有大量杂质。这种情况不利于对灯心草提取物的质量进行控制，而且，大量杂质的存在引入更多不可控因素，例如可能引起一些毒副作用等。

因此，本领域技术人员希望制备得到一种灯心草的提取物，该提取物不仅含有灯心草的主要有效成分，而且去除了粗提物中的大量杂质。同时，本领域技术人员也希望建立制备上述提取物的方法。

发明内容

本发明人通过对灯心草进行的大量实验研究工作，提出了一种灯心草菲类有效部位，同时提供了制备该灯心草菲类有效部位的方法，并且还发现了灯心草菲类有效部位在制备抗焦虑药物中的用途。

因此，根据一个方面，本发明提供了一种灯心草菲类有效部位，其是从灯心草经提取分离获得的一种提取物，包含总含量高于50%的厄弗酚(effusol)、去氢厄弗酚(dehydroeffusol)、灯心草酚(juncusol)和去氢灯心草酚(dehydrojuncusol)，结构分别见图1中的式A、B、C和D。

在一个实施方案中，所述去氢厄弗酚的含量为50%-62%（此处的百分比为质量百分比，下同）。在另一个实施方案中，所述去氢厄弗酚的含量为60%。在另一个实施方案中，所述去氢厄弗酚的含量为62%。

根据另一个方面，本发明提供了一种制备上述灯心草菲类有效部位的方法，包括如下步骤：

（1）取灯心草茎髓部，用乙醇水溶液回流提取；

（2）将步骤（1）中得到的提取液合并并且浓缩，随后用乙酸乙酯超声萃取，合并提取液，将合并后的提取液浓缩，干燥，得到干燥乙酸乙酯粗提物；

（3）取步骤（2）中得到的干燥乙酸乙酯粗提物，经过硅胶柱色谱或者高速逆流色谱分离(HSCCC)，即可获得菲类有效部位；

其中，所述硅胶柱色谱的分离条件为：样品量与硅胶的重量比为1:20-100，硅胶柱的径高比为1:4-10；流动相为体积比为5:0.4-5:2的石油醚:乙酸乙酯，紫外检测波长为270nm；

所述高速逆流色谱的分离条件为：以体积比为5:3:5:3的环己烷-乙酸乙酯-甲醇-水为两相溶剂系统，样品以两相系统静置分层的下相溶解，高速逆流色谱仪参数为：流速2ml/分钟，转速800-850转/分钟，紫外检测波长：270nm。

在该方法的一个实施方案中，所述步骤（1）中是以15-35倍重量的体积比为80-95%的乙醇水溶液回流提取2-3次，每次提取时间为1-2小时。在另一个实施方案中，所述步骤（1）中采用体积比为80%的乙醇水溶液回流提取2次，第一次以25倍重量体积比为80%的乙醇回流提取1.5小时，第二次以15倍重量体积比为80%的乙醇回流提取1小时。在另一个实施方案中，所述步骤（2）中在乙酸乙酯超声萃取前将浓缩的提取液用分散剂拌样并干燥。在另一个实施方案中，所述分散剂为硅胶或硅藻土。在另一个实施方案中，所述乙酸乙酯超声萃取是采用40倍重量的乙酸乙酯进行2次，每次30分钟。

根据又一个方面，本发明提供了上述灯心草菲类有效部位在制备抗焦虑药物中的用途。

在本发明中，灯心草菲类有效部位是指介于灯心草粗提取物和单一成分之间的一类物质，其中主要成分为菲类。与单一成分相比，灯心草菲类有效部位中含有多种菲类有效成分，而与灯心草粗提取物相比，灯心草菲类有效部位中的主要成分为菲类，不含粗提取物中大部分除菲类之外的其他成分。

因此，相比现有的灯心草类制剂，本发明的灯心草菲类有效部位更好地确保了灯心草类制剂的疗效和安全性，使含灯心草制剂的质量控制更简单易行。同时，相对于灯心草中包含的一些单一的化学成分，本发明的灯心草菲类有效部位包含了更多的有效成分，且制备工艺更加简便易行，生产成本更低。

附图说明

图1示出了四种菲类成分的结构式。

图2示出了实施例1中的目标成分阴性样品（A）、乙酸乙酯粗提物（B）、菲类有效部位（C）的HPLC图。

图3A示出了实施例3中的灯心草乙酸乙酯粗提物的快速制备图。

图3B示出了实施例3中分离所得阴性样品的HPLC图。

图3C示出了实施例3中分离所得菲类有效部位的HPLC图。

图4示出了实施例4中的灯心草乙酸乙酯粗提物的快速制备图。

图5示出了实施例5中的灯心草乙酸乙酯粗提物的快速制备图。

图6示出了实施例6中的灯心草乙酸乙酯粗提物的快速制备图。

图7示出了实施例7中的灯心草乙酸乙酯粗提物的快速制备图。

图8示出了实施例8中的灯心草乙酸乙酯粗提物的快速制备图。

图9示出了实施例9中的灯心草乙酸乙酯粗提物的快速制备图。

图10A示出了实施例10中的灯心草乙酸乙酯粗提物的HSCCC图。

图10B示出了实施例10中的分离所得阴性样品的HPLC图。

图10C示出了实施例10中的分离所得菲类有效部位的HPLC图。

图11示出了实施例11中的灯心草乙酸乙酯粗提物的HSCCC图。

图12示出了实施例12中的灯心草乙酸乙酯粗提物的HSCCC图。

图13示出了实施例13中的菲类有效部位中厄弗酚、去氢厄弗酚、灯心草酚和去氢灯心草酚四个菲类成分的HPLC图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

我们通过对灯心草指纹图谱的研究发现，灯心草中含量较高的菲类成分包括厄弗酚（effusol）、去氢厄弗酚（dehydroeffusol）、灯心草酚（juncusol）和去氢灯心草酚（dehydrojuncusol）四种。本发明人通过反复的实验摸索，最终确立了主要含有上述四种成分的灯心草菲类有效部位适合采用硅胶柱色谱法或高速逆流色谱法进行分离制备。

在制备本发明的灯心草菲类有效部位时，首先取灯心草茎髓部，用乙醇水溶液回流提取，优选用15-35倍重量的体积比为80-95%的乙醇水溶液提取2-3次，每次提取时间为1-2小时；接着将步骤（1）中得到的提取液合并并且浓缩，随后用乙酸乙酯超声萃取，合并提取液，将合并后的提取液浓缩，干燥，得到干燥乙酸乙酯粗提物；最后取步骤（2）中得到的干燥乙酸乙酯粗提物，优选采用40倍重量的乙酸乙酯超声萃取2次，每次30分钟，然后将干燥的乙酸乙酯粗提物经过硅胶柱色谱或者高速逆流色谱分离，即可获得菲类有效部位，其中，所述硅胶柱色谱的分离条件为：样品量与硅胶的重量比为1:20-100，硅胶柱的径高比为1:4-10；流动相为体积比为5:0.4-5:2的石油醚:乙酸乙酯，紫外检测波长为270nm；所述高速逆流色谱的分离条件为：以体积比为5:3:5:3的环己烷-乙酸乙酯-甲醇-水为两相溶剂系统，样品以两相系统静置分层的下相溶解，高速逆流色谱仪参数为：流速2ml/分钟，转速800-850转/分钟，紫外检测波长：270nm。

在采用乙醇溶液提取的步骤中，进一步优选采用体积比为80%的乙醇水溶液回流提取2次，第一次以25倍重量体积比为80%乙醇回流提取1.5小时，第二次以15倍重量体积比为80%的乙醇回流提取1小时。在该提取条件下，所实现的对灯心草中菲类有效部分的提取效率最高，提取最为充分。

为了使乙醇水溶液提取物的浓缩液均匀分散以利于后续的乙酸乙酯超声萃取，可以在乙酸乙酯超声萃取前将浓缩的提取液用分散剂拌样。适合的分散剂可以是硅胶或硅藻土。

另外，对于所述的乙酸乙酯超声萃取，为了在尽可能短的萃取时间下获得最佳的萃取率，以40倍重量的乙酸乙酯超声萃取2次。

通过本发明的上述制备方法，可以获得一种灯心草菲类有效部位，其包含高于50%的厄弗酚、去氢厄弗酚、灯心草酚和去氢灯心草酚，可以用于制备抗焦虑药物。

以下通过具体实施例对本发明进行更进一步的详细说明。

实施例1:

取1.5kg灯心草茎髓部，以体积比为80%的乙醇溶液回流提取两次，第一次以25倍量体积比为80%的乙醇溶液回流提取1.5h，第二次以15倍量体积比为80%的乙醇溶液回流提取1h，合并提取液，浓缩，干燥，得到干燥乙醇提取物90g。乙醇提取物经3倍量硅胶拌样，用40倍量乙酸乙酯超声萃取两次，每次各30分钟，合并提取液，浓缩，干燥，得到干燥乙酸乙酯粗提物18g。

取上述干燥乙酸乙酯粗提物400mg，溶于甲醇，1.2g硅胶（60-80目）干法拌样，上样于硅胶柱（直径3cm、高度30cm的玻璃色谱柱填装60-80目硅胶20g），以石油醚:乙酸乙酯（5:0.8）洗脱，以配有紫外检测器的流份收集器跟踪收集有紫外吸收的样份，回收溶剂即得菲类有效部位，没有紫外吸收的为阴性样品。得到菲类有效部位112mg、阴性样品225mg（见图2）。按实施例13及14的高效液相色谱法测定，菲类有效部位中去氢厄弗酚的含量为54.2%，厄弗酚、去氢厄弗酚、灯心草酚、去氢灯心草酚的面积比为1:8.5:0.2:0.8。

实施例2:

按照与实施例1相同的方法制备干燥乙酸乙酯粗提物。

取上述干燥乙酸乙酯粗提物209mg，溶于甲醇，0.6g硅胶（200-300目）干法拌样，上样于硅胶柱（直径1.5cm，高度15cm的玻璃色谱柱填装200-300目硅胶20g），以石油醚:乙酸乙酯（5:2）洗脱，以配有紫外检测器的流份收集器跟踪收集有紫外吸收的样份，回收溶剂即得菲类有效部位，没有紫外吸收的为阴性样品。得到菲类有效部位46mg、阴性样品121mg。按实施例13及14的高效液相色谱法测定，菲类有效部位中去氢厄弗酚的含量为59%，厄弗酚、去氢厄弗酚、灯心草酚、去氢灯心草酚的面积比为1:9:0.2:0.8。

实施例3:

按照与实施例1相同的方法制备干燥乙酸乙酯粗提物。

取上述干燥的乙酸乙酯提取物236mg，用乙醇溶解，0.7g硅胶（200-300目）拌样，10gbiotage色谱柱，用快速制备色谱（Isolera One）分离，流动相:石油醚:乙酸乙酯（5:2）等度洗脱；平衡流速:10ml/分钟，平衡体积15ml；洗脱流速10ml/分钟；检测波长270nm，分离得到色谱图见图3A-图3C。0-14分钟合并得到菲类有效部位66mg，14-35分钟以及色谱柱里面未洗脱的剩余其他样品用乙酸乙酯超声萃取合并得到阴性样品117mg。按实施例13及14的高效液相色谱法测定，菲类有效部位中去氢厄弗酚的含量为53.4%，厄弗酚、去氢厄弗酚、灯心草酚、去氢灯心草酚的面积比为1:8.6:0.2:0.7。

实施例4:

按照与实施例1相同的方法制备干燥乙酸乙酯粗提物。

取上述干燥的乙酸乙酯提取物302mg，用乙醇溶解，1g硅胶（200-300目）拌样，10gbiotage色谱柱，用快速制备色谱（Isolera One）分离，流动相:石油醚:乙酸乙酯（5:0.8）等度洗脱；平衡流速:10ml/分钟，平衡体积100ml；洗脱流速2ml/分钟；检测波长270nm，分离得到色谱图见图4。30-240分钟合并得到菲类有效部位70mg，0-30分钟以及色谱柱里面未洗脱的剩余其他样品用乙酸乙酯超声萃取合并得到阴性样品171mg。按实施例13及14的高效液相色谱法测定，菲类有效部位中去氢厄弗酚的含量为56%，厄弗酚、去氢厄弗酚、灯心草酚、去氢灯心草酚的面积比为1:9:0.3:0.7。

实施例5:

按照与实施例1相同的方法制备干燥乙酸乙酯粗提物。

取上述干燥的乙酸乙酯提取物298mg，用乙醇溶解，0.9g硅胶（200-300目）拌样，10gbiotage色谱柱，用快速制备色谱（IsoleraOne）分离，流动相:石油醚:乙酸乙酯（5:0.8）等度洗脱；平衡流速:10ml/分钟，平衡体积100ml；洗脱流速3ml/分钟；检测波长270nm，分离得到色谱图见图5。0-140分钟合并得到菲类有效部位70mg，色谱柱里面未洗脱的剩余其他样品用乙酸乙酯超声萃取合并得到阴性样品165mg。按实施例13及14的高效液相色谱法测定，菲类有效部位中去氢厄弗酚的含量为60%，厄弗酚、去氢厄弗酚、灯心草酚、去氢灯心草酚的面积比为1:9.6:0.2:0.7。

实施例6:

按照与实施例1相同的方法制备干燥乙酸乙酯粗提物。

取上述干燥的乙酸乙酯提取物113mg，用乙醇溶解，0.4g硅胶（200-300目）拌样，10gbiotage色谱柱，用快速制备色谱（Isolera One）分离，流动相:石油醚:乙酸乙酯（5:2）等度洗脱；平衡流速：2ml/分钟，平衡体积15ml；洗脱流速2ml/分钟；检测波长270nm，分离得到色谱图见图6。0-24分钟合并得到菲类有效部位28mg，24-66分钟以及色谱柱里面未洗脱的剩余其他样品用乙酸乙酯超声萃取合并得到阴性样品52mg。按实施例13及14的高效液相色谱法测定，菲类有效部位中去氢厄弗酚的含量为60%，厄弗酚、去氢厄弗酚、灯心草酚、去氢灯心草酚的面积比为1:9.6:0.2:0.9

实施例7:

按照与实施例1相同的方法制备干燥乙酸乙酯粗提物。

取上述干燥的乙酸乙酯提取物117mg，用乙醇溶解，0.4g硅胶（200-300目）拌样，10gbiotage色谱柱，用快速制备色谱（Isolera One）分离，流动相:石油醚:乙酸乙酯（5:0.4）等度洗脱；平衡流速：2ml/ 分钟，平衡体积15ml；洗脱流速2ml/分钟；检测波长270nm，分离得到色谱图见图7。0-280分钟合并得到菲类有效部位29mg，320-360分钟以及色谱柱里面未洗脱的剩余其他样品用乙酸乙酯超声萃取合并得到阴性样品59mg。按实施例13及14的高效液相色谱法测定，菲类有效部位中去氢厄弗酚的含量为60%，厄弗酚、去氢厄弗酚、灯心草酚、去氢灯心草酚的面积比为1:9:0.2:0.8。

实施例8:

按照与实施例1相同的方法制备干燥乙酸乙酯粗提物。

取上述干燥的乙酸乙酯提取物117mg，用乙醇溶解，0.4g硅胶（200-300目）拌样，10gbiotage色谱柱，用快速制备色谱（Isolera One）分离，流动相:石油醚:乙酸乙酯（5:0.8）等度洗脱；平衡流速：2ml/分钟，平衡体积15ml；洗脱流速2ml/分钟；检测波长270nm，分离得到色谱图见图8。0-108分钟合并得到菲类有效部位29mg，108-160分钟以及色谱柱里面未洗脱的剩余其他样品用乙酸乙酯超声萃取合并得到阴性样品64mg。按实施例13及14的高效液相色谱法测定，菲类有效部位中去氢厄弗酚的含量为60%，厄弗酚、去氢厄弗酚、灯心草酚、去氢灯心草酚的面积比为1:10:0.2:0.9。

实施例9:

按照与实施例1相同的方法制备干燥乙酸乙酯粗提物。

取上述干燥的乙酸乙酯提取物508mg，用乙醇溶解，1.5g硅胶（200-300目）拌样，10gbiotage色谱柱，用快速制备色谱（Isolera One）分离，流动相:石油醚:乙酸乙酯（5:2）等度洗脱；平衡流速：2ml/分钟，平衡体积15ml；洗脱流速2ml/分钟；检测波长270nm，分离得到色谱图见图9。0-60分钟合并得到菲类有效部位134mg，60-100分钟以及色谱柱里面未洗脱的剩余其他样品用乙酸乙酯超声萃取合并得到阴性样品260mg。按实施例13及14的高效液相色谱法测定，菲类有效部位中去氢厄弗酚的含量为56%，厄弗酚、去氢厄弗酚、灯心草酚、去氢灯心草酚的面积比为1:8:0.2:0.8。

实施例10:

按照与实施例1相同的方法制备干燥乙酸乙酯粗提物。

取上述干燥乙酸乙酯提取物50mg，以环己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（5:3:5:3）为两相溶剂系统，乙酸乙酯提取物以两相系统静置分层的下相4ml溶解，进样，用上海同田TBE-300B高速逆流色谱仪分离，条件如下：浙江智达N2000色谱工作站，流速2ml/分钟，转速850转/分钟，温度25℃，紫外检测波长：270nm。分离所得色谱图见图10A-10C，99-120分钟合并得到阴性样品32mg，120-240分钟合并得到菲类有效部位17mg。按实施例13及14的高效液相色谱法测定，菲类有效部位中去氢厄弗酚的含量为50%，厄弗酚、去氢厄弗酚、灯心草酚、去氢灯心草酚的面积比为1:9.4:0.2:0.8。

实施例11:

按照与实施例1相同的方法制备干燥乙酸乙酯粗提物。

取上述干燥乙酸乙酯提取物50mg，以环己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（5:3:5:3）为两相溶剂系统，乙酸乙酯提取物以两相系统静置分层的下相4ml溶解，进样，用上海同田TBE-300B高速逆流色谱仪分离，条件如下：浙江智达N2000色谱工作站，流速2ml/分钟，转速800转/分钟，温度25℃，紫外检测波长：270nm。分离所得色谱图见图11，77-97分钟合并得到阴性样品37mg，97-240分钟合并得到菲类有效部位11mg。按实施例13及14的高效液相色谱法测定，菲类有效部位中去氢厄弗酚的含量为60%，厄弗酚、去氢厄弗酚、灯心草酚、去氢灯心草酚的面积比为1:10:0.2:1。

实施例12:

按照与实施例1相同的方法制备干燥乙酸乙酯粗提物。

取上述干燥乙酸乙酯提取物50mg，以环己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（5:3:5:3）为两相溶剂系统，乙酸乙酯提取物以两相系统静置分层的下相4ml溶解，进样，用上海同田TBE-300B高速逆流色谱仪分离，条件如下：浙江智达N2000色谱工作站，流速2ml/分钟，转速850转/分钟，温度30℃，紫外检测波长：270nm。分离所得色谱图见图12，100-120分钟合并得到阴性样品39mg，120-280分钟合并得到菲类有效部位10mg。按实施例13及14的高效液相色谱法测定，菲类有效部位中去氢厄弗酚的含量为62%，厄弗酚、去氢厄弗酚、灯心草酚、去氢灯心草酚的面积比为1:10.4:0.1:0.7。

实施例13:

有效部位主要菲类成分的定性分析

配制菲类成分厄弗酚、去氢厄弗酚、灯心草酚和去氢灯心草酚标准品溶液和灯心草菲类有效部位溶液，应用高效液相色谱条件法分析获得色谱图，高效液相测定条件如下：岛津LC-20A型高效液相色谱仪，色谱柱Agilent HC-C18(4.6mm*250mm，5um)，柱温:23℃，进样量:10ul，流动相:甲醇:水（65:35）；流速:1mL/分钟，检测:PAD检测器，检测波长：270nm。通过对标准品和样品色谱峰保留时间的对比分析，厄弗酚的保留时间为10.1分钟、去氢厄弗酚的保留时间为10.8分钟、灯心草酚的保留时间为12.8分钟、去氢灯心草酚的保留时间为13.3分钟，初步确定菲类有效部位主要含有上述四种菲类成分（图13）。

采用液相色谱-质谱联用技术进一步定性分析，测定条件如下：色谱分析条件：色谱柱为Agilent HC-C18(4.6mm×150mm，5μm)，采用水与甲醇梯度洗脱(0分钟，65:35；10分钟，35:65；30分钟，15:85；35分钟，65:35)，流速1mL/分钟，采用柱后分流，以200μL/分钟的流速注入质谱系统，柱温：23℃，检测波长：269nm，进样量：10μL。质谱分析条件：ESI离子源，负离子模式检测，喷雾电压（Spray Voltage）:2500V，蒸发器温度（VaporizerTemperature）:400℃，鞘气（Sheath Gas Pressure）:10L/分钟，辅助气（Aux GasPressure）：5L/ 分钟，毛细管温度：350℃。采用一级全扫描和二级扫描（MS²），全扫描质量范围100-800，碰撞能量36V。菲类有效部位中含量较高的菲类成分与对应标准品产生相同的准分子离子峰，且二级质谱图一致，进一步确认四个菲类化合物结构。

实施例14:

有效部位菲类成分定量分析

采用高效液相色谱法测定菲类成分的含量，色谱条件同定性分析。由于有效部位中去氢厄弗酚含量较大，定量分析以其为代表测定菲类成分含量。配制菲类成分去氢厄弗酚不同浓度的标准品溶液，测定，绘制浓度和峰面积标准曲线。测定样品溶液菲类成分的峰面积，根据标准曲线计算含量。各实施例中菲类有效部位的菲类成分含量均大于50%。

实施例15:

灯心草菲类有效部位的抗焦虑实验

实验材料与方法

SPF级KM小鼠，♂，体重20±2g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司（合格证号:SCXK(京)2012-0001）。

小鼠高架十字迷宫（Elevated plus–maze，EPM）:由两个开放臂（open arms，30cm*5cm）、两个闭合臂(enclosed arms，30cm*5cm*20cm)以及一个连接四个臂的中央平台（central platform，10cm*10cm）组成一个类似“十”字形的迷宫（即:开放臂-中央平台-开放臂或闭合臂-中央平台-闭合臂，二者互相垂直形成“十”字形）。本迷宫聚丙烯材料制成，四个臂及中央平台底部均为黑色，闭合臂四周为黑色，整体固定于一个铝制的“十”字形支架上，使迷宫高于实验室地面50cm。

小鼠随机分为:溶剂空白组（0.5%CMC-Na）、阳性对照组（地西泮1mg/kg）、菲类有效部位组（含去氢厄弗酚5mg/kg）、等比例阴性样品组、全成分组（乙酸乙酯粗提物），用0.5%CMC-N_a溶液配制成相应浓度，灌胃给药，给药体积为0.1ml/10g，每组10只于给药30分钟后进行小鼠高架十字迷宫实验，将小鼠头朝向开放臂放入高架十字迷宫的中央平台中，同时点击仪器开始按钮，记录小鼠6分钟内在高架十字迷宫上进入开发臂的时间OT、进入开放臂次数OE。实验结果见表1。

表1菲类有效部位、阴性样品、全成分单次给药对小鼠高架十字迷宫试验行为的影响

注:①与溶剂空白组比较，^*为P<0.05，^**为P<0.01；

②各给药组的剂量以其在乙酸乙酯提取物中的比例，按去氢厄弗酚的剂量为5mg/kg折算。

小鼠高架十字迷宫试验结果显示：以OT为指标，菲类有效部位组、全成分组与空白组比较均具有高度的统计学意义(p<0.01)；以OE为指标，菲类有效部位组、全成分组与空白组均具有统计学意义(p<0.05)。单次给药后，阳性组、菲类有效部位组、全成分组均能提高小鼠开放臂停留时间和小鼠进入开放臂的次数，全成分、菲类有效部位具有明显的抗焦虑作用，且作用强度相似，而阴性样品无抗焦虑作用，这表明了菲类有效部位为灯心草抗焦虑作用的有效部位，可以用于治疗抗焦虑药物。

最后需要说明的是：上述实施例仅仅是为清楚的说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

Claims

1.一种灯心草菲类有效部位，其是从灯心草经提取分离获得的一种提取物，其中厄弗酚、去氢厄弗酚、灯心草酚和去氢灯心草酚的总含量超过50％。

2.如权利要求1所述的灯心草菲类有效部位，其特征在于，所述去氢厄弗酚的含量为50-62％。

3.如权利要求1或2所述的灯心草菲类有效部位，其特征在于，所述去氢厄弗酚的含量为60％。

4.如权利要求1或2所述的灯心草菲类有效部位，其特征在于，所述去氢厄弗酚的含量为62％。

5.如权利要求1-4中任一项所述的灯心草菲类有效部位的制备方法，包括如下步骤：

(1)取灯心草茎髓部，用乙醇水溶液回流提取；

(2)将步骤(1)中得到的提取液合并并且浓缩，随后用乙酸乙酯超声萃取，合并提取液，将合并后的提取液浓缩，真空干燥，得到干燥乙酸乙酯粗提物；

(3)取步骤(2)中得到的干燥乙酸乙酯粗提物，经过硅胶柱色谱或者高速逆流色谱分离，即可获得菲类有效部位；

其中，所述硅胶柱色谱的分离条件为：样品量与硅胶的重量比为1:20-100，硅胶柱的径高比为1:4-10；流动相为体积比为5:0.4-5:2的石油醚:乙酸乙酯；

所述高速逆流色谱的分离条件为：以体积比为5:3:5:3的环己烷-乙酸乙酯-甲醇-水为两相溶剂系统，样品以两相系统静置分层的下相溶解，高速逆流色谱仪参数为：流速2ml/分钟，转速800-850转/分钟。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中采用体积比为80％的乙醇水溶液回流提取2次，第一次以25倍重量体积比为80％的乙醇回流提取1.5小时，第二次以15倍重量体积比为80％的乙醇回流提取1小时。

7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中在乙酸乙酯超声萃取前将浓缩的提取液用分散剂拌样并干燥。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述分散剂为硅胶或硅藻土。

9.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述乙酸乙酯超声萃取是采用40倍重量的乙酸乙酯进行2次，每次30分钟。

10.权利要求1-4中任一项所述的灯心草菲类有效部位在制备抗焦虑药物中的用途。