CN104911233A - 一种酶法提取降血糖人参多糖及其在食品和药品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于中药植物多糖的生物活性领域，具体涉及一种多次提取人参多糖的方法及其在制备降血糖药物和食品中的应用。本发明极大的提高了人参多糖提取效率，本发明制备的人参多糖可以应用到降血糖药物或者保健食品中，制成口服制剂、针剂、粘膜吸收、透皮吸收等剂型。
Description
技术领域
本发明属于中药植物多糖的生物活性领域，具体涉及一种多次提取人参多糖的方法及其在制备降血糖药物和食品中的应用。
背景技术
随着社会的日益发展，人们的生活水平日益提高，我国糖尿病的发病率也在逐年上升，糖尿病用药市场规模达到数百亿人民币。降血糖药物的开发具有非常好的应用前景。
糖尿病主要分1型糖尿病（type1diabetes）和2型糖尿病(type2diabetes)，1型糖尿病和2型糖尿病均有不同程度的胰岛beta细胞损伤。现有的降血糖药物，比如胰岛素，格列本脲，罗格列酮，阿卡波糖等，均具有不同程度的副作用，并且不能从根本上改善胰腺功能。
人参被人们称为“百草之王”，是闻名遐迩的“东北三宝”（人参、貂皮、鹿茸）之一，是驰名中外、老幼皆知的名贵药材。多糖是人参的有效成分之一，现有的研究表明，人参多糖具有很好的降血糖活性，但是人参多糖的提取方法交杂乱，收率低，人参多糖的价值没有得到足够的开发。
发明内容
本发明旨在提高人参多糖的产率，发掘人参多糖的降血糖活性组分。本发明可以通过以下步骤实现：
1.一级人参多糖的提取：100℃条件下分别经蒸馏水煮提人参根4小时，3小时及2小时。提取物经4层纱布过滤，合并三次提取所得滤液，离心去除其中的不溶物。上清液加入4倍体积的95%乙醇沉淀过夜，离心，收集沉淀，干燥后得到一级人参多糖。
2.二级人参多糖的提取：上一步剩余人参根残渣首先加入蒸馏水，沸水煮沸30min，冷却至50℃后加入α-淀粉酶，保持50℃提取24小时。提取物经4层纱布过滤，收集提取液，用截留分子量为3500Da的透析膜透析。收集透析膜内液，浓缩，干燥后得到二级人参多糖。
3.三级人参多糖的提取：上一步剩余的人参根残渣中加入50mM的EDTA二钠盐水溶液，60℃提取3小时，按照相同条件共提取2次。提取物经4层纱布过滤，合并2次提取所得滤液，用截留分子量为3500Da的透析膜透析。收集透析膜内液，浓缩，干燥后得到三级人参多糖。
4.四级人参多糖的提取：上一步剩余的人参根残渣中加入0.05M Na2CO3水溶液，4℃提取16小时，提取物经4层纱布过滤，残渣接着25℃提取16小时。合并2次的提取液，50%盐酸中，截留分子量为3500Da的透析膜透析。收集透析膜内液，浓缩，干燥后得到四级人参多糖。
5.五级人参多糖的提取：上一步剩余的人参根残渣中加入1M KOH水溶液，25℃提取12小时。提取物经4层纱布过滤，所得提取液用50%盐酸中和，截留分子量为3500Da的透析膜透析后，收集透析膜内液，浓缩，干燥后得到五级人参多糖。
6.六级人参多糖的提取：上一步剩余的人参根残渣中加入4M KOH水溶液，25℃提取18小时。提取物经4层纱布过滤，所得提取液用50%盐酸中和，截留分子量为3500Da的透析膜透析后，收集透析膜内液，浓缩，干燥后得到六级人参多糖。
步骤2中，α-淀粉酶的使用剂量为终浓度50至250mg/L。
以上步骤中，干燥的方法是指乙醇沉淀常规干燥，冰冻干燥，或者喷雾干燥。
通过HPLC法检测单糖组成，各级人参多糖的收率以及单糖组成如表1所示。
表1各级人参多糖对beta胰岛细胞活力的影响(data=mean±S.D.)
Glc：葡萄糖；GalA：半乳糖醛酸；Gal：半乳糖；Ara：阿拉伯糖；Xyl：木糖；Rha：鼠李糖；Man：甘露糖；---，未检测到。
人参多糖改善beta胰岛细胞活力实验（细胞水平）
培养胰岛Beta细胞RIN-m5F，培养基RPMI1640，10%胎牛血清。铺96孔板，104个细胞/孔，24小时后，加不同浓度人参多糖样品，设4复孔。48小时后，MTT法检测细胞活力。应用SPSS统计软件，进行Dunnett's MultipleComparison Test，检验实验组与对照组（0mg/ml）统计显著性。实验结果见表1：
表2各级人参多糖对beta胰岛细胞活力的影响(data=mean±S.D.)
与0mg/ml对比，*表示P<0.05。
从表2可知，各级人参多糖均具有一定改善beta胰岛细胞活力的活性，具有开发为降血糖药物的潜力，其中一级人参多糖，二级人参多糖和三级人参多糖的最佳浓度均为1mg/ml，四级人参多糖的最佳浓度为5mg/ml，五级人参多糖和六级人参多糖的最佳浓度均为0.1mg/ml。
人参多糖降血糖实验（活体水平）
C57小鼠，8周龄，空腹12小时，腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病小鼠模型。72h后，尾静脉采血，测定空腹血糖值，取血糖值大于15.00mmol/L的小鼠为糖尿病小鼠。
糖尿病模型小鼠按血糖值分为6组，每组10只，阴性对照组灌胃蒸馏水，阳性对照组灌胃10mg/kg剂量的阿卡波糖，其余4组分别灌胃不同剂量的人参多糖，剂量分别为10、50、200和400mg/kg，每天灌胃给药1次,连续15天。末次给药后，将所有各组小鼠空腹12h，尾静脉采血，测定空腹血糖值。应用SPSS统计软件，进行Dunnett's Multiple Comparison Test，检验实验组与对照组统计显著性。实验结果见表1至表6。
表3一级人参多糖对STZ糖尿病小鼠血糖值影响（n=10）
注：与阴性对照组比较：*表示p＜0.05
从表3可知，灌胃15天后，50，200和400mg/kg的一级人参多糖通过灌胃给药能够显著降低糖尿病模型小鼠的血糖，说明一级人参多糖在口服的情况下具有降血糖的作用。
表4二级人参多糖对STZ糖尿病小鼠血糖值影响（n=10）
注：与阴性对照组比较：*表示p＜0.05
从表4可知，灌胃15天后，200与400mg/kg的二级人参多糖通过灌胃给药能够显著降低糖尿病模型小鼠的血糖，说明二级人参多糖在口服的情况下具有降血糖的作用。
表5三级人参多糖对STZ糖尿病小鼠血糖值影响（n=10）
注：与阴性对照组比较：*表示p＜0.05
从表5可知，灌胃15天后，50mg/kg，200与400mg/kg的三级人参多糖通过灌胃给药能够显著降低糖尿病模型小鼠的血糖，说明三级人参多糖在口服的情况下具有降血糖的作用。
表6四级人参多糖对STZ糖尿病小鼠血糖值影响（n=10）
注：与阴性对照组比较：*表示p＜0.05
从表6可知，灌胃15天后，400mg/kg的四级人参多糖通过灌胃给药能够显著降低糖尿病模型小鼠的血糖，说明四级人参多糖在口服的情况下具有降血糖的作用。
表7五级人参多糖对STZ糖尿病小鼠血糖值影响（n=10）
注：与阴性对照组比较：*表示p＜0.05
从表7可知，灌胃15天后，200和400mg/kg的五级人参多糖通过灌胃给药能够显著降低糖尿病模型小鼠的血糖，说明五级人参多糖在口服的情况下具有降血糖的作用。
表8六级人参多糖对STZ糖尿病小鼠血糖值影响（n=10）
注：与阴性对照组比较：*表示p＜0.05
从表8可知，灌胃15天后，400mg/kg的六级人参多糖通过灌胃给药能够显著降低糖尿病模型小鼠的血糖，说明六级人参多糖在口服的情况下具有降血糖的作用。
本发明极大的提高了人参多糖提取效率，收率从10%提高到30%。本发明制备的人参多糖可以应用到降血糖药物或者保健食品中，制成口服制剂、针剂、粘膜吸收、透皮吸收等剂型。本发明方法制备的6级人参多糖可以单独，也可以彼此相互搭配，或者与其他物质混合使用。
具体实施方式：
1.称取人参根500克，用8升蒸馏水100℃提取4小时，提取物经4层纱布过滤。过滤得到的残渣在分别用7升蒸馏水100℃提取3小时，6升蒸馏水100℃提取2小时。合并三次提取所得滤液，4000转/分离心10分钟，弃沉淀，上清液80℃浓缩至200毫升。向上清液中加入4倍体积的95%乙醇，充分搅拌后，静止沉淀过夜。离心，收集沉淀，常规干燥（95%乙醇、无水乙醇、乙醚依次充分搅拌后离心，沉淀减压干燥过夜）。得到53.5克一级人参多糖样品。
2.热水煮提后的人参根残渣加入2升蒸馏水，沸水煮沸30min，冷却至50℃后加入250毫克α-淀粉酶，保持50℃提取24小时。提取物经4层纱布过滤，收集提取液，用截留分子量为3500Da的透析膜透析。收集透析膜内液，浓缩，冷冻干燥后得到二级人参多糖45克。
3.淀粉酶提取后的人参根残渣中加入4升50mM的EDTA二钠盐，60℃提取3小时，提取物经4层纱布过滤，残渣继续用相同条件再提取一次。合并2次提取所得滤液，用截留分子量为3500Da的透析膜透析。收集透析膜内液，浓缩，冷冻干燥后得到三级人参多糖30克。
4.EDTA提取后的人参根残渣中加入4升0.05M Na2CO3（含20mM NaBH4），4℃提取16小时，提取物经4层纱布过滤，残渣接着25℃提取16小时。合并2次的提取液，50%盐酸中和后用截留分子量为3500Da的透析膜透析。收集透析膜内液，浓缩，冷冻干燥后得到四级人参多糖9克。
5.Na2CO3提取后的人参根残渣中加入3升1M KOH（含20mM NaBH4），25℃提取12小时。提取物经4层纱布过滤，所得提取液用50%盐酸中和，截留分子量为3500Da的透析膜透析后，收集透析膜内液，浓缩，冷冻干燥后得到五级人参多糖11克。
6.1M KOH提取后的人参根残渣中加入3升4M KOH（含20mM NaBH4），25℃提取18小时。提取物经4层纱布过滤，所得提取液用50%盐酸中和，截留分子量为3500Da的透析膜透析后，收集透析膜内液，浓缩，冷冻干燥后得到六级人参多糖13.8克。
Claims (4)
1.一种人参多糖的综合提取方法及其在制备降血糖药物和食品中的应用，其特征在于通过以下步骤制备多糖样品：
a)一级人参多糖的提取：100℃条件下分别经蒸馏水煮提人参根4小时，3小时及2小时。提取物经4层纱布过滤，合并三次提取所得滤液，离心去除其中的不溶物，上清液加入4倍体积的95%乙醇沉淀过夜，离心，收集沉淀，干燥后得到一级人参多糖；
b)二级人参多糖的提取：上一步剩余人参根残渣首先加入蒸馏水，沸水煮沸30min，冷却至50℃后加入α-淀粉酶，保持50℃提取24小时，提取物经4层纱布过滤，收集提取液，用截留分子量为3500Da的透析膜透析，收集透析膜内液，浓缩，干燥后得到二级人参多糖；
c)三级人参多糖的提取：上一步剩余的人参根残渣中加入50mM的EDTA二钠盐，60℃提取3小时，按照相同条件共提取2次，提取物经4层纱布过滤，合并2次提取所得滤液，用截留分子量为3500Da的透析膜透析，收集透析膜内液，浓缩，干燥后得到三级人参多糖；
d)四级人参多糖的提取：上一步剩余的人参根残渣中加入0.05M Na2CO3，4℃提取16小时，提取物经4层纱布过滤，残渣接着25℃提取16小时，合并2次的提取液，50%盐酸中和后用截留分子量为3500Da的透析膜透析，收集透析膜内液，浓缩，干燥后得到四级人参多糖；
e)五级人参多糖的提取：上一步剩余的人参根残渣中加入1M KOH，25℃提取12小时。提取物经4层纱布过滤，所得提取液用50%盐酸中和，截留分子量为3500Da的透析膜透析后，收集透析膜内液，浓缩，干燥后得到五级人参多糖；
f)六级人参多糖的提取：上一步剩余的人参根残渣中加入4M KOH，25℃提取18小时。提取物经4层纱布过滤，所得提取液用50%盐酸中和，截留分子量为3500Da的透析膜透析后，收集透析膜内液，浓缩，干燥后得到六级人参多糖。
2.根据权利1所述提取方法制备得到的人参多糖，其特征在于各级分人参多糖可以单独，也可以彼此相互搭配，或者与其他物质混合使用。
3.根据权利1所述提取方法制备得到的人参多糖，其特征在于所得人参多糖可以制成口服制剂、针剂、粘膜吸收、透皮吸收等剂型
4.根据权利1所述的提取方法，其特征在于α-淀粉酶的使用剂量的终浓度为50至250mg/L。
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