CN104911181A - 一种核酸定位探针及其在核酸剪切中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种核酸定位探针及其在核酸剪切中的应用，该核酸定位探针包括一段双链以及至少一段与双链相连接的单链，所述单链具有可与目标核酸序列特异性杂交的识别区，所述双链具有邻近识别区的供内切酶结合的结合区。本发明采用特定结构的核酸定位探针，实现了核酸剪切，提供了一种简单通用的核酸剪切方法，该方法中内切酶在核酸定位探针的帮助下可以在目标核酸序列的任意指定位置实现精确可调的剪切，具有简单、通用、精确、可调等优势，有望为生物、医学和化学等领域研究中的核酸剪切提供有效手段。

Description

一种核酸定位探针及其在核酸剪切中的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种核酸定位探针及其在核酸剪切中的应用。

背景技术

自DNA结构模型确定以来，核酸研究在分子生物学和医学等领域呈指数式发展，并在最近的几十年里经久不衰。核酸剪切作为核酸研究中最重要的技术之一，在基因表达、编辑、检测、测序等许多领域被广泛应用。

核酸的剪切从本质上而言就是使核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。能到达这一目的的方法有很多，大致可分为化学方法、物理方法和生物方法三类。化学方法主要是利用如铈离子、多胺铕铽络合物、α-噻吩甲酰三氟丙酮-哌啶铈等化学物质在特定溶液体系内使磷酸二酯键断裂，物理方法主要是采用超声等物理手段使磷酸二酯键断裂。这两种方法对任何核苷酸序列均可适用，但无序列特异性，因而其实际应用必然受到限制。生物方法则是在各种核酸酶的催化下来完成核酸剪切。例如，S1核酸酶可降解单链DNA或RNA，各种外切酶(Exonuclease)可以从双链DNA的3’或5’粘性末端逐一剪切核苷酸，但上述这几种酶也只能实现非特异性或半特异性的核酸剪切。而对于目标核酸序列的特异性剪切则必须依赖于限制性内切酶(Restriction endonuclease)和由其改造而成的切口内切酶(Nicking endonuclease)。这两类酶都可以特异性地绑定在其特定的识别序列上，进而对目标核酸序列实施精确的剪切，但它们的剪切方式又有所不同。限制性内切酶是对双链目标核酸序列的二条链进行剪切，以切断整个双链而形成粘性末端与平末端；切口内切酶是对双链目标核酸序列的其中一条链进行剪切，即只在一条单链上产生切口。限制性内切酶和切口内切酶均常用于质粒的重组等基因工程领域以及基因表达、测序等许多研究中，另外切口内切酶也常用于核酸等温扩增方法的建立。

然而，这两类酶均需要目标核酸序列中含有其识别序列，且剪切位点只能位于该识别序列内或附近的某一固定位置，无法按实际需要实现精细调节，针对不同的目标核酸序列来还需选择不同的内切酶才能实现剪切，因而其通用性较差，对于有些序列片段甚至会由于没有适合的内切酶而无法实现特异性剪切。因此，亟需发展一种简单、通用、精确、可调的核酸剪切方法。

发明内容

本发明提供了一种核酸定位探针及其在核酸剪切中的应用，采用该核酸定位探针指导内切酶进行核酸剪切时，无需目标核酸序列中含有内切酶识别序列。

一种核酸定位探针，包括一段双链以及至少一段与双链相连接的单链，所述单链具有可与目标核酸序列特异性杂交的识别区，所述双链具有邻近识别区的供内切酶结合的结合区。

内切酶与上述核酸定位探针的双链结合区进行结合，并通过单链识别区与目标核酸序列的杂交被定位到目标核酸序列的指定区域内，从而完成对目标核酸序列的精确剪切。

核酸定位探针的结合区只是核酸定位探针双链中的一部分区域，结合区的两端还可以有非内切酶识别序列；同样，上述识别区也只是核酸定位探针单链的一部分区域，识别区的两端还可以有非目标核酸识别序列；但是，结合区与识别区必须相互靠近，以确保内切酶能够剪切到目标核酸序列，结合区与识别区之间可允许间隔的碱基对数(单链区按核苷酸数计)根据内切酶的类型来确定。

本发明所述的“靠近”是指结合区与识别区不宜间隔过大，以避免内切酶无法剪切目标核酸序列，结合区与识别区相互间隔的核苷酸数应根据具体内切酶识别序列与剪切位点间的核苷酸数量来确定。

作为优选，所述核酸定位探针包含两段含识别区的单链，两段单链连接于双链的同一端，或者所述核酸定位探针包括单链环，所述单链环和单链分别连接于双链的两端。

更优选的是，所述核酸定位探针不仅包含两段含识别区的单链，两段单链连接于双链的同一端，而且还包括单链环，所述单链环和单链分别连接于双链的两端。

进一步地，所述单链环的核苷酸数量大于等于0，小于等于50。

理论上，本发明所述的核酸定位探针只需具有结合区和识别区即可实现核酸剪切，针对上述结构区域，本发明提供了多种可行的核酸定位探针结构，具体如下：

所述核酸定位探针由单条核苷酸链分子内互补杂交形成或由两条核苷酸链部分互补杂交形成。

若以两条核苷酸链形式存在，该核酸定位探针的两条核苷酸链中存在一部分互补序列，互补区域中需包含结合区以供内切酶结合，未互补区域中至少包含一段与目标核酸序列互补的识别区，当然，结合区与识别区之间可允许间隔的碱基对数(单链区按核苷酸数计)根据内切酶的类型来定。说明书附图1B中提供的即为两条核苷酸链形式的核酸定位探针中的一种具体形式，图中3’侧臂和5’侧臂位于双链的同侧，且均含有一段识别区，该结构的核酸定位探针有助于提高核酸定位探针与目标核酸序列结合的稳定性，提高剪切效率。为了提高核酸定位探针的稳定性，双链中非内切酶识别序列的长度可依据所需退火温度进行调整；增加两单链识别区的序列长度也可以促进核酸定位探针双链结合区的形成与稳定。

若以单条核苷酸链形式存在，该核酸定位探针中应有两段互补的序列，并杂交形成带单链环的茎环结构，上述茎环结构能够提高核酸定位探针的稳定性。上述单链环的核苷酸数≥0，≤50；单链环的核苷酸数为0时，是指互补区域的一端通过最末两个核苷酸之间的磷酸二酯键连接。当然，该核酸定位探针的未互补区域也应具有至少一段与目标核酸序列互补的识别区。

本发明还提供了一种核酸剪切复合物，包括内切酶和所述的核酸定位探针，内切酶结合于所述的双链结合区。

所述的内切酶为限制性内切酶或切口内切酶，包括：Nt.BstNBI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、N.AlwI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Fok I。

本发明还提供了一种包含所述核酸定位探针的核酸剪切试剂盒以及包含所述核酸剪切复合物的核酸剪切试剂盒。

上述核酸定位探针以及核酸剪切复合物可应用于核酸剪切中。

本发明核酸定位探针在核酸剪切的应用中可以对任意目标核酸序列实施剪切，既不要求目标核酸序列中含有内切酶识别序列或任何其它特定序列，也不依赖于任何反应在目标核酸序列中生成或引入内切酶识别序列或任何其它特定序列，只要设计及特定序列的核酸定位探针即可。该方法能够在目标核酸序列的任意指定位置实现精确的剪切，通过改变核酸定位探针在目标核酸序列上的杂交位置即可实现剪切位点的调节。

基于核酸定位探针的核酸剪切方法不需要特殊的步骤，只需将目标核酸序列、核酸定位探针、内切酶和反应缓冲液制成混合液，在一定温度条件下维持一定时间即可实现对目标核酸序列指定位点的精确剪切。

所述的目标核酸序列为DNA序列、RNA序列或由DNA与RNA组成的复合序列。所述的反应缓冲液主要用于提供合适的反应环境，使内切酶发挥酶切功能，并维持核酸分子的稳定。

本发明采用特定结构的核酸定位探针，实现了核酸的剪切，提供了一种简单通用的核酸剪切方法，该方法中内切酶在核酸定位探针的帮助下可以在目标核酸序列的任意指定位置实现精确可调的剪切，具有简单、通用、精确、可调等优势，有望为生物、医学和化学等领域研究中核酸剪切提供有效手段。

附图说明

图1为本发明核酸定位探针的结构示意图(阴影部分为内切酶识别序列区域)；

A为茎环结构的核酸定位探针，B为由两条寡核苷酸链杂交形成的非茎环结构的核酸定位探针。

图2为采用本发明核酸定位探针进行核酸剪切的反应原理示意图(以茎环结构的核酸定位探针为例)。

图3为实施例1中FAM标记的核酸序列经不同条件处理后的变性聚丙烯酰胺凝胶(15％)电泳图；

其中，各泳道为各EP管中溶液的结果；泳道1为A管；泳道2为B管；泳道3为C管；泳道4为D管；泳道5为E管；泳道6为F管；泳道7为G管；泳道8为H管；泳道9为I管。

图4为实施例2中各目标核酸序列在内切酶及不同核酸定位探针存在下的荧光随时间变化曲线；

A：目标核酸序列T2、T3、T4和T5在内切酶与核酸定位探针P3作用下荧光随时间变化图；B：目标核酸序列T2、T3、T4和T5在内切酶与核酸定位探针P4作用下荧光随时间变化图；C：目标核酸序列T2、T3、T4和T5在内切酶与核酸定位探针P5作用下荧光随时间变化图；D：目标核酸序列T2、T3、T4和T5在内切酶与核酸定位探针P6作用下荧光随时间变化图。

图5为实施例3中目标核酸序列在不同核酸定位探针存在下被内切酶剪切后的变性聚丙烯酰胺凝胶(15％)电泳图；

其中，M泳道为DNAMarker，其他泳道为各EP管中溶液的结果；泳道1为A管；泳道2为B管；泳道3为C管；泳道4为D管。

图6为实施例4中目标核酸序列在不同单链环长度的核酸定位探针存在下被内切酶剪切后的琼脂糖凝胶(3％)电泳图；

其中，各泳道为各EP管中溶液的结果；泳道1为A管；泳道2为B管；泳道3为C管；泳道4为D管；泳道5为E管；泳道6为F管；泳道7为G管；泳道8为H管；泳道9为I管。

图7为实施例5中目标核酸序列在3’侧臂不与目标核酸序列互补的核酸定位探针存在下被内切酶剪切后的琼脂糖凝胶(3％)电泳图；

其中，各泳道为各EP管中溶液的结果；泳道1为A管；泳道2为B管；泳道3为C管。

具体实施方式

下面结合附图，通过具体实施例来具体说明本发明。本领域的技术人员应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下列实施例中，待剪切目标核酸序列为人工合成的单链DNA，其大小根据不同验证目的而有所调整。通过变性聚丙烯酰胺凝胶(15％)电泳或琼脂糖凝胶(3％)电泳验证时，目标核酸序列3’端标记有荧光基团FAM。通过实时荧光信号变化验证时，目标核酸序列的特定位置分别标记有荧光基团FAM和淬灭基团Dabcyl，且为便于观察变化需要适当调整反应步骤。根据目标核酸序列的剪切位点设计相应的核酸定位探针，下列实施例选用茎环结构的核酸定位探针，其组成参见图1，为便于说明均简称为定位探针。为了验证需要，定位探针两条单链侧臂的序列长度要随验证目的做出适当调整。

具体实施案例如下：

实施例1

本实施例中核酸剪切的反应原理如图2所示，具体步骤如下：

(1)取9个EP管，各加入23.9μL反应缓冲液，分别标号为A、B、C、D、E、F、G、H、I；

(2)往A、D、G管内各加入0.25μL定位探针P1，其浓度为10μM；往B、E、H管内各加入0.25μL定位探针P2，其浓度为10μM；往C、F、G、H管内各加入0.25μL目标核酸序列T1，其浓度为10μM；往D、E、F、G、H管内各加入0.6μL内切酶，其浓度为10U/μL；I管内加入0.25μL长度为35nt和20nt的标记有FAM基团的无关核酸序列作为长度标定组；

(3)往上述9管中按需要加入无核酸酶水使溶液总体积均为25μL，然后置于55℃孵育约50分钟；

(4)对上述9管溶液进行变性聚丙烯酰胺凝胶(15％)电泳试验，记录电泳图；

上面所述反应缓冲液组成为100mMNaCl、50mM Tris-HCl、100μg/mL BSA和10mMMgSO₄；

上述二种定位探针P1、P2序列如下：

P1：5′-TGCTGAGTGAGAGCTGTGAATGACTCACGTTTTTCGTGAGTCACCAAGA CGCAAAAAAAAAAA-FAM-3’(SEQ ID No.1)(下划线显示为定位探针的双侧臂序列，下同)；

P2：5′-AAAAAAAAAAGAGCTGTGAATGACTCACGTTTTTCGTGAGTCACCAAGA CGCAGTATATTGG-FAM-3’(SEQ ID No.2)；

上述目标核酸序列T1的序列如下所示：

T1：5′-CCAATAATACTGCGTCTTGGTTCACAGCTCTCACTCAGCATGGCAAGGAGGAACTTA-FAM-3’(SEQ ID No.3)。

上述内切酶为Nt.BstNBI，其识别序列为5’-GAGTC-3’，剪切位点位于识别序列后第四位核苷酸处(5’-GAGTCNNN-3’，加粗、中间划线核苷酸代指剪切点，下同)

电泳结果如图3所示(9道作为参考条带用于标定长度为35nt与20nt的寡核苷酸)：

核酸定位探针和目标核酸序列各自在不含内切酶的条件下均呈现其原有长度大小的电泳条带(如图3中1、2、3道)；

核酸定位探针和目标核酸序列各自在存在内切酶的条件下均呈现其原有长度大小的电泳条带(如图3中4、5、6道)，说明内切酶对单独的定位探针或目标核酸序列无剪切作用；

核酸定位探针、目标核酸序列及内切酶共存的条件下，出现目标核酸序列被剪切后的条带(34nt)，而未出现定位探针被剪切后的条带(17nt)，说明内切酶在定位探针存在下能够实施对目标核酸序列的剪切，而对定位探针无作用。

上述结果说明，本发明中内切酶在特定定位探针的帮助下只剪切目标核酸序列，而定位探针不受剪切影响。

实施例2

本实施例为便于观察到荧光信号的变化，采用先预混定位探针和目标核酸序列，后加入内切酶的试验操作，其反应原理如图2所示。具体步骤如下：

(1)取16个EP管，各加入23.9μL反应缓冲液，分成四组A、B、C、D；

(2)往A组四管内各加入0.25μL定位探针P3，其浓度为10μM；往B组四管内各加入0.25μL定位探针P4，其浓度为10μM；往C组四管内各加入0.25μL定位探针P5，其浓度为10μM；往D组四管内各加入0.25μL定位探针P6，其浓度为10μM；

(3)往A组四管内分别加入0.25μL不同目标核酸序列T2、T3、T4和T5，其浓度均为10μM；往B组四管内分别加入0.25μL不同目标核酸序列T2、T3、T4和T5，其浓度均为10μM；往C组四管内分别加入0.25μL不同目标核酸序列T2、T3、T4和T5，其浓度均为10μM；往D组四管内分别加入0.25μL不同目标核酸序列T2、T3、T4和T5，其浓度均为10μM；

(4)将上述16管溶液置于55℃孵育12分钟，使定位探针与目标核酸序列充分结合，每隔一分钟记录荧光值变化；

(5)往各EP管均加入0.6μL内切酶，其浓度为10U/μL，继续在55℃孵育约40分钟，每隔一分钟记录荧光值变化；

上面所述反应缓冲液组成为100mMNaCl、50mM Tris-HCl、100μg/mL BSA和10mMMgSO₄；

上述四种定位探针P3、P4、P5和P6序列如下：

P3：5’-GAGCAGAGAACCTGACTCACGTTTTTCGTGAGTCAAATACGACG-3’(SEQ IDNo.4)；

P4：5’-GAGCAGAGAACTGACTCACGTTTTTCGTGAGTCACAATACGACG-3’(SEQ IDNo.5)；

P5：5’-GAGCAGAGAATGACTCACGTTTTTCGTGAGTCACCAATACGACG-3’(SEQ IDNo.6)；

P6：5’-GAGCAGAGATGACTCACGTTTTTCGTGAGTCAACCAATACGACG-3’(SEQ IDNo.7)。

上述四种目标核酸序列T2、T3、T4和T5序列相同，只是淬灭基团标记的位置不同，如下示：

T2，5’-Dabcyl-CGTCGTATTGGTTCTCTGCTC-FAM-3’(SEQ ID No.8)

T3，5’-CGTCGTATTGG(Dabcyl-T)TCTCTGCTC-FAM-3’(SEQ ID No.9)(Dabcyl为标记在核苷酸T上的淬灭基团，下同)；

T4，5’-CGTCGTATTGGT(Dabcyl-T)CTCTGCTC-FAM-3’(SEQ ID No.10)；

T5，5’-CGTCGTATTGGTTC(Dabcyl-T)CTGCTC-FAM-3’(SEQ ID No.11)。

上述内切酶为Nt.BstNBI，其识别序列为5’-GAGTC-3’，剪切位点位于识别序列后第四位核苷酸处(5’-GAGTCNNN-3’)。

荧光结果如图4所示：

目标核酸序列T2的荧光在四组实验中均显著增强，而T3、T4、T5的荧光因定位探针的不同而异，说明内切酶在不同定位探针的介导下对目标核酸序列的剪切位置随之改变；

对于定位探针P3(如图4A)，目标核酸序列T3的荧光增强而T4、T5的荧光不变化，说明剪切位点位于第12、13个核苷酸之间，即5’-CGTCGTATTGGCTCTGCTC-3’；

对于定位探针P4(如图4B)，目标核酸序列T3、T4的荧光增强而T5的荧光不变化，说明剪切位点位于第13-15个核苷酸之间，即5’-CGTCGTATTGGTCTGCTC-3’；

对于定位探针P5(如图4C)，目标核酸序列T3、T4的荧光增强而T5的荧光不变化，说明剪切位点位于第13-15个核苷酸之间，即5’-CGTCGTATTGGTCTGCTC-3’；

对于定位探针P6(如图4D)，目标核酸序列T3、T4、T5的荧光均增强，说明剪切位点位于第15个核苷酸之后，即5’-CGTCGTATTGGTTCTGCTC-3’。

上述结果说明，本发明中内切酶能够在定位探针的帮助下对目标核酸序列进行精确、可调剪切。针对本实施例中所采用的内切酶与定位探针的结构进行分析可知，剪切点位于目标核酸序列与5’侧臂杂交所形成双链的第三个核苷酸和第四个核苷酸之间。

实施例3

本实例中反应原理由图2所示。具体步骤如下：

(1)取四个EP管，各加入23.9μL反应缓冲液，0.6μL内切酶(浓度为10U/μL)，标号A、B、C、D；

(2)往A、B、C、D管内各加入0.25μL目标核酸序列T6，其浓度为10μM；

(3)往A管内加入0.25μL无核酸酶水；往B管内加入0.25μL定位探针P7，其浓度为10μM；往C管内加入0.25μL定位探针P8，其浓度为10μM；往D管内加入0.25μL定位探针P9，其浓度为10μM；

(4)将上述四管溶液置于55℃孵育约50分钟，使定位探针与目标核酸序列充分结合、充分剪切；

(5)对四管溶液进行变性聚丙烯酰胺凝胶(15％)电泳试验，记录电泳图；

上面所述反应缓冲液组成为但不限于100mMNaCl、50mM Tris-HCl、100μg/mL BSA和10mM MgSO₄；

上述目标核酸序列T6的3’端标记有FAM荧光基团，通过紫外光照射呈现荧光以判断电泳条带位置，其序列组成如下：

T6：5’-GCTCATCACTGCACACTCCTGTAAGGTTTCACACATCTAAGGTCGTATTGCTCCTCTGGTCTCTC-FAM-3’(SEQ ID No.12)；

上述定位探针P7、P8和P9可分别与目标核酸序列的不同区域杂交，其核酸序列如下所示：

P7：5’-GGAGCAATACGATGACTCACGTTTTTCGTGAGTCACCTTAGATGTGT-3’(SEQID No.13)；

P8：5’-TAGATGTGTGAATGACTCACGTTTTTCGTGAGTCAACCTTACAGGAG-3’(SEQID No.14)；

P9：5’-TTACAGGAGTGTTGACTCACGTTTTTCGTGAGTCAGCAGTGATGAGC-3’(SEQID No.15)；

上述内切酶为Nt.BstNBI，其识别序列为5’-GAGTC-3’，剪切位点位于识别序列后第四位核苷酸处(5’-GAGTCNNN-3’)。

电泳结果如图5所示：

当没有定位探针存在时，目标核酸序列未被剪切(图5中1道)；

当使用P7作为定位探针时，目标核酸序列被剪切成两段，其中带荧光基团的链为20nt，在凝胶上呈现20nt明亮条带(图5中2道)，该结果说明T6被剪切的位置为5’-.....TCTAAGGTCATTG.....-3’(省略号为省去的核苷酸，下同)；

当使用P8作为定位探针时，目标核酸序列被剪切成两段，其中带荧光基团的链为35nt，在凝胶上呈现35nt明亮条带(图5中3道)，该结果说明T6被剪切的位置为5’-.....AGGTTTCAC.....-3’；

当使用P9作为定位探针时，目标核酸序列被剪切成两段，其中带荧光基团的链为50nt，在凝胶上呈现50nt明亮条带(图5中4道)，该结果说明T6被剪切的位置为5’-.....GCACTCCT.....-3’；

上述结果说明，本发明中只要调整定位探针的两侧臂序列，使其对应目标核酸序列的不同位置，即可以对目标核酸序列上任意指定位置进行剪切。

实施例4

本实例中反应原理由图2所示。具体步骤如下：

(1)取9个EP管，各加入23.9μL反应缓冲液，标号A、B、C、D、E、F、G、H和I；

(2)往各管均加入0.25μL目标核酸序列T7，其浓度为10μM；

(3)往A、C、E、G四管内加入0.6μL内切酶(浓度为10U/μL)；

(4)往A和B管内加入0.25μL定位探针P10，其浓度为10μM；往C和D管内加入0.25μL定位探针P11，其浓度为10μM；往E和F管内加入0.25μL定位探针P12，其浓度为10μM；往G和H管内加入0.25μL定位探针P13，其浓度为10μM；

(5)往上述9管中按需要加入无核酸酶水使溶液总体积均为25μL，然后置于55℃孵育约50分钟；

(6)对上述9管溶液进行琼脂糖凝胶(3％)电泳，记录电泳图；

上面所述反应缓冲液组成为但不限于100mMNaCl、50mM Tris-HCl、100μg/mL BSA和4mM MgSO₄；

上述目标核酸序列T7的3’端标记有FAM荧光基团，通过紫外光照射呈现荧光以判断电泳条带位置，其序列组成如下：

T7：5’-TAATAACAGCATAACGTCCTCTGGTCTCTCTCCTCAATAA-FAM-3’(SEQ IDNo.16)；

上述定位探针P10、P11、P12、P13的序列如下所示：

P10：5’-GAGGAGAGAGACCAGAGGATGACTCACGTTTTCGTGAGTCAGCAATACGA CAAT-3’(SEQ ID No.17)(加粗核苷酸为环上的核苷酸，下同)；

P11：5’-GAGGAGAGAGACCAGAGGATGACTCACGTTTCGTGAGTCAGCAATACGAC AAT-3’(SEQ ID No.18)；

P12：5’-GAGGAGAGAGACCAGAGGATGACTCACGTTCGTGAGTCAGCAATACGA CAAT-3’(SEQ ID No.19)；

P13：5’-GAGGAGAGAGACCAGAGGATGACTCACGTCGTGAGTCAGCAATACGA CAAT-3’(SEQ ID No.20)；

上述内切酶为Nt.BstNBI，其识别序列为5’-GAGTC-3’，剪切位点位于识别序列后第四位核苷酸处(5’-GAGTCNNN-3’)。

电泳结果如图6所示(9道电泳物为只含目标核酸序列T7的I管内溶液，其作为参考条带)：

P10与T7结合后在有内切酶(图6中1道)与无内切酶(图6中2道)时有明显条带差异，前者位于参考条带(图6中9道，下同)下，而后者位于参考条带上，说明环长度为四个核苷酸的定位探针能够帮助内切酶对目标核酸序列实施剪切；(注：上面的条带是定位探针与目标核酸序列的杂交产物，故慢于9道中的目标核酸序列；下面的条带是目标核酸序列被剪切后的产物，且与定位探针分离，故快于9道中的目标核酸序列；以下同)

P11与T7结合后在有内切酶(图6中3道)与无内切酶(图6中4道)有明显条带差异，前者位于参考条带下，而后者位于参考条带上，说明环长度为三个核苷酸的定位探针能够实施目标核酸序列的剪切；

P12与T7结合后在有内切酶(图6中5道)与无内切酶(图6中6道)有明显条带差异，前者位于参考条带下，而后者位于参考条带上，说明环长度为二个核苷酸的定位探针能够实施目标核酸序列的剪切；

P13与T7合后在有内切酶(图6中7道)与无内切酶(图6中8道)有明显条带差异，前者位于参考条带下，而后者位于参考条带上，说明环长度为一个核苷酸的定位探针能够实施目标核酸序列的剪切；

上述结果说明，本发明中定位探针中的单链环长度可以调节，在保证双链结合区结构稳定的前提下，该单链环可以为任意长度甚至为零，这使得定位探针的结构设计具备灵活性。

实施例5

本实例中反应原理由图2所示。具体步骤如下：

(1)取3个EP管，各加入23.9μL反应缓冲液，标号A、B和C；

(2)往各管均加入0.25μL目标核酸序列T8，其浓度为10μM；

(3)往A管内加入0.6μL内切酶(浓度为10U/μL)；

(4)往A和B管内加入0.25μL定位探针P14，其浓度为10μM；

(5)往上述3管中按需要加入无核酸酶水使溶液总体积均为25μL，然后置于55℃孵育约50分钟；

(6)对上述3管溶液进行琼脂糖凝胶(3％)电泳，记录电泳图；

上面所述反应缓冲液组成为但不限于100mMNaCl、50mM Tris-HCl、100μg/mL BSA和4mM MgSO₄；

上述目标核酸序列T8的3’端标记有FAM荧光基团，通过紫外光照射呈现荧光以判断电泳条带位置，其序列组成如下：

T8：5’-TAATAACAGCATAACGTCCTCTGGTCTCTCTCCTCAATAA-FAM-3’(SEQ IDNo.21)；

上述定位探针P14的序列如下所示：

P14：5’-GAGGAGAGAGACCAGAGGATGACTCACGTCGTGAGTCAGCAATACGACAAT-3’(SEQ ID No.22)；

上述内切酶为Nt.BstNBI，其识别序列为5’-GAGTC-3’，剪切位点位于识别序列后第四位核苷酸处(5’-GAGTCNNN-3’)。

电泳结果如图7所示(3道电泳物为只含目标核酸序列T8的C管内溶液，其作为参考条带。

P14与T8结合后在有内切酶(图7中1道)与无内切酶(图7中2道)有明显条带差异，前者位于参考条带下，而后者位于参考条带上，说明定位探针在其3’侧臂为非目标核酸互补序列，但5’侧臂能与目标核酸序列稳定杂交的情况下，也能帮助内切酶对目标核酸序列实施剪切；

上述结果说明，本发明中定位探针在其3’侧臂序列与目标核酸序列不互补，但5’侧臂能与目标核酸序列稳定杂交时也能帮助内切酶对实施对目标核酸序列的剪切，使定位探针的结构设计更具灵活性。

上述五个实施例子使用了不同序列的目标核酸链，本方法均能对其进行剪切，说明本方法具备很好的通用性。

通过上述实施例表明，本发明对目标核酸序列的剪切，具备简单(无须分步骤、分溶液体系，溶液混合后置于等温条件孵育即可)、通用(无序列限制，对不含内切酶识别序列的目标核酸序列也能实施剪切)、精确(只在设计位点进行剪切)、可调(只需依据目标核酸调整定位探针的侧臂序列即可调节剪切位点)等优势，可望为生物、医学和化学等领域研究中核酸剪切提供有效手段。

Claims (10)

1.一种核酸定位探针，其特征在于，包括一段双链以及至少一段与双链相连接的单链，所述单链具有可与目标核酸序列特异性杂交的识别区，所述双链具有邻近识别区的供内切酶结合的结合区。

2.如权利要求1所述的核酸定位探针，其特征在于，所述核酸定位探针包含两段单链，两段单链连接于双链的同一端。

3.如权利要求1所述的核酸定位探针，其特征在于，所述核酸定位探针包括单链环，所述单链环和单链分别连接于双链的两端。

4.如权利要求3所述的核酸定位探针，其特征在于，所述单链环的核苷酸数量大于等于0，小于等于50。

5.如权利要求1所述的核酸定位探针，其特征在于，所述核酸定位探针由单条核苷酸链分子内互补杂交形成或由两条核苷酸链部分互补杂交形成。

6.一种核酸剪切复合物，其特征在于，包括内切酶和权利要求1～5任一项所述的核酸定位探针，内切酶结合于所述的结合区。

7.如权利要求6所述的核酸剪切复合物，其特征在于，所述的内切酶为限制性内切酶或切口内切酶。

8.一种包含权利要求1～5任一项所述核酸定位探针的核酸剪切试剂盒。

9.一种包含权利要求6或7所述的核酸剪切复合物的核酸剪切试剂盒。

10.如权利要求1～5任一项所述的核酸定位探针或权利要求6或7所述的核酸剪切复合物在核酸剪切中的应用。