CN104911137B

CN104911137B - 一种产莽草酸的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用

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Publication number: CN104911137B
Application number: CN201510175678.8A
Authority: CN
Inventors: 刘双江; 张博; 姜成英; 周楠
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Filing date: 2015-04-14
Publication date: 2018-06-01
Anticipated expiration: 2035-04-14

Abstract

本发明提供了一种产莽草酸的谷氨酸棒杆菌，包含aroG、aroB、aroD和aroE基因，还包含调控所述aroG基因表达的RBS1、调控aroB基因表达的RBS2、调控aroD基因表达的RBS3和调控aroE基因表达的RBS4；RBS1的基因序列为SEQ ID NO:1所示，RBS2的基因序列为SEQ ID NO:2所示，RBS3的基因序列为SEQ ID NO:3所示，RBS4的基因序列为SEQ ID NO:4所示。本发明还提供了一种构建上述产莽草酸的谷氨酸棒杆菌的方法及应用。本发明通过选择适当的RBS序列调整莽草酸表达途径中aroG、aroB、aroD、aroE基因的表达量，大大提高了莽草酸的产量。

Description

一种产莽草酸的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种产莽草酸的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用。

背景技术

莽草酸(3,4,5-trihydroxy-1-cyclohexene-1-carboxylic acid,shikimicacid,SA)呈白色晶体状，比旋光度[α]＝-157°×cm³/g×dm^-1，最大紫外吸收在235nm，其具有多种同分异构体，但只有α型的同分异构体具有生物学活性。莽草酸除可用于合成苯丙氨酸、络氨酸、色氨酸外，还可用于合成维生素、己二酸等化合物。莽草酸可以通过化学合成、微生物发酵、植物萃取等手段获得。传统的莽草酸生产主要通过植物萃取进行，植物八角茴香的果实是工业上获得莽草酸的主要来源。但由于八角茴香仅分布在全球极少数地区，其产量受气候、自然环境等因素的影响，因此严重限制了莽草酸的产量。化学合成莽草酸由于产率不高、工艺复杂、价格高昂因而未能广泛开展。利用微生物发酵生产莽草酸具有操作简单、能耗小、生产成本及低无污染等优点，在当今资源需求量较大、能源紧张、环保要求不断提高的情况下，展现了特有的优越性和广阔的发展空间。

现有的产莽草酸的菌株主要是通过对莽草酸途径基因改造的方式过表达途径中的aroG、aroB、aroD、aroE四个基因，虽然经过以上方法改造的菌株可以在一定条件下提升莽草酸的生产效率，但对莽草酸途径的改造策略只强调了过表达途径中的基因，而在翻译水平使用相同的RBS元件来控制基因的表达，限制了对莽草酸表达能力的进一步提高。例如：Chen等人对大肠杆菌进行改造，其菌株的莽草酸产量仅为1.85g/L(Chen K,Dou J,TangS,Yang Y,Wang H,Fang H,Zhou C(2012)Deletion of the aroK gene is essential forhigh shikimic acid accumulation through the shikimate pathway inE.coli.Bioresour Technol 119:141-7)。Cui等人对大肠杆菌进行改造，其菌株的莽草酸产量也仅为3.12g/L(Cui YY,Ling C,Zhang YY,Huang J,Liu JZ(2014)Production ofshikimic acid from Escherichia coli through chemically inducible chromosomalevolution and cofactor metabolic engineering.Microb Cell Fact 13:21)。

发明内容

本发明的目的是提供一种产莽草酸的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用，通过选择适当的RBS序列调整莽草酸表达途径中aroG、aroB、aroD、aroE基因的表达量，从而大大提高莽草酸的产量。

本发明提供一种产莽草酸的谷氨酸棒杆菌，包含aroG、aroB、aroD和aroE基因，还包含调控aroG基因表达的RBS1、调控aroB基因表达的RBS2、调控aroD基因表达的RBS3和调控aroE基因表达的RBS4；aroG的基因序列为SEQ ID NO:6所示，aroB的基因序列为SEQ IDNO:7所示，aroD的基因序列为SEQ ID NO:8所示，aroE的基因序列为SEQ ID NO:9所示；

在上述技术方案中，RBS1的基因序列为SEQ ID NO:1所示，RBS2的基因序列为SEQID NO:2所示，RBS3的基因序列为SEQ ID NO:3所示，RBS4的基因序列为SEQ ID NO:4所示。

在上述技术方案中，aroB基因与aroD基因之间还插入有终止子2，终止子2的基因序列为SEQ ID NO:11所示。

在上述技术方案中，还包含RiboJ基因，RiboJ的基因序列为SEQ ID NO:5所示。

在上述技术方案中，aroG基因与aroG基因的启动子之间插入有RiboJ基因，所述aroB基因与aroB基因的启动子之间插入有RiboJ基因、所述aroD基因与aroD基因的启动子之间插入有RiboJ基因，所述aroE基因与aroE基因的启动子之间插入有RiboJ基因。

本发明还提供了一种产莽草酸的谷氨酸棒杆菌的构建方法，包括如下步骤：

1)将aroG、aroB、aroD和aroE基因分别插入载体pXMJ19，得到载体pXMJ19-aroG、pXMJ19-aroB、pXMJ19-aroD、pXMJ19-aroE；

2)将aroG中的HindIII和PstI酶切位点，aroB中的BamHI和SpeI酶切位点，aroD中的PstI酶切位点，aroE中的EcoRI和SalI酶切位点进行突变，得到载体pXMJ19-aroG^MU、pXMJ19-aroB^MU、pXMJ19-aroD^MU、pXMJ19-aroE^MU；

3)将RiboJ基因插入载体pXMJ19，得到载体pXMJ19-RiboJ；

4)将荧光蛋白基因插入载体pXMJ19-RiboJ，得到载体pZB；

5)用引物MU-RBSAG-F和MU-RBSAG-R以pXMJ19-aroG^MU为模板扩增基因片段aroG^MU，用引物MU-RBSAB-F和MU-RBSAB-R以pXMJ19-aroB^MU为模板扩增基因片段aroB^MU，用引物MU-RBSAD-F和MU-RBSAD-R以pXMJ19-aroD^MU为模板扩增基因片段aroD^MU，用引物MU-RBSAE-F和MU-RBSAE-R以pXMJ19-aroE^MU为模板扩增基因片段aroE^MU；

6)将步骤5)中扩增的基因片段aroG^MU、aroB^MU、aroD^MU和aroE^MU分别插入载体pZB，得到载体pZB-aroG、pZB-aroB、pZB-aroD和pZB-aroE；

7)步骤6)得到的载体分别转化大肠杆菌，对得到的克隆进行测序，将测序无误的载体pZB-aroG、pZB-aroB、pZB-aroD和pZB-aroE共同转化至Corynebacterium glutamicumRES167ΔaroK中，培养并检测荧光强度；

8)用引物aroG-H-F、aroG-H-R以pXMJ19-aroG^MU为模板扩增基因片段aroG-H并插入载体pXMJ19-RiboJ，得到载体pXMJ19-RiboJ-aroG^MU-H；所述aroG-H的基因序列如SEQ IDNO:13所示；

9)用引物aroB-M-F、aroB-M-R以pXMJ19-aroB^MU为模板扩增基因片段aroB-M；用aroD-M-F、aroD-M-R以pXMJ19-aroD^MU为模板扩增基因片段aroD-M；用aroE-M-F、aroE-M-R以pXMJ19-aroE^MU为模板扩增基因片段aroE-M；将扩增的基因片段aroB-M、aroD-M和aroE-M插入载体pXMJ19-RiboJ，获得载体pXMJ19-RiboJ-aroB^MU-M、pXMJ19-RiboJ-aroD^MU-M和pXMJ19-RiboJ-aroE^MU-M；所述aroB-M、aroD-M和aroE-M的基因序列依次分别如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示；

10)用引物PB-F、PB-R以pXMJ19-RiboJ-aroB^MU-M为模板扩增基因片段Ptac-aroB-M；用引物PD-F、PD-R以pXMJ19-RiboJ-aroD^MU-M为模板扩增基因片段Ptac-aroD-M；用引物PE-F、PE-R以pXMJ19-RiboJ-aroE^MU-M为模板扩增基因片段Ptac-aroE-M，将基因片段Ptac-aroB-M插入载体pXMJ19-RiboJ-aroG^MU-H，得到载体pXMJ19-GHBM；所述Ptac-aroB-M的基因序列如SEQ ID NO:17所示；

11)将片段Ptac-aroD-M插入载体pXMJ19-GHBM，得到载体pXMJ19-GHBMDM；所述Ptac-aroD-M的基因序列如SEQ ID NO:18所示。

12)将片段Ptac-aroE-M插入载体载体pXMJ19-GHBMDM，得到载体pXMJ19-GBDE；所述Ptac-aroE-M的基因序列如SEQ ID NO:19所示；

13)用引物Terminator2-F、Terminator2-R以pXMJ19为模板扩增终止子2，将终止子2和载体pXMJ19-GBDE分别用XmaI进行酶切，回收终止子2片段和载体，将终止子2片段和载体进行连接，得到载体pXMJ19-GBTDE；

14)将pXMJ19-GBTDE转化至C.glutamicum RES167ΔaroK，获得产莽草酸的谷氨酸棒杆菌。

在上述产莽草酸的谷氨酸棒杆菌的构建方法中，步骤4)中的荧光蛋白基因为egfp基因。

本发明还提供了一种生产莽草酸的方法，包括如下步骤：

按2％～4％体积比的接种量接种上述任一产莽草酸的谷氨酸棒杆菌种子液到灭菌后冷至发酵温度的发酵培养基中，所述种子液的OD值为14，温度为30℃，通气速率为3vvm，发酵过程中补加蔗糖，搅拌转速为300rpm的条件下培养发酵3～5天，获得含莽草酸浓度为10～12g/L的发酵液。

发酵过程中补加蔗糖步骤中，分别在发酵20小时及发酵34小时的时候补加蔗糖，每升发酵液补加35g蔗糖。

在上述生产莽草酸的方法中，制备产莽草酸的谷氨酸棒杆菌种子液的培养基为：K₂HPO₄·3H₂O 0.5g/L、KH₂PO₄ 0.5g/L、(NH₄)₂SO₄ 10g/L、葡萄糖40g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2g/L、苯丙氨酸0.15g/L、酪氨酸0.15g/L、色氨酸0.15g/L、CaCO₃ 30g/L、FeSO₄·7H₂O 0.02g/L、MnSO₄·4H₂O 0.02g/L、生物素50μg/L、硫胺素200μg/L,pH 7.4。

在上述生产莽草酸的方法中，生产莽草酸的发酵培养基为：K₂HPO₄·3H₂O 0.5g/L、KH₂PO₄ 0.5g/L、尿素3g/L、蔗糖38g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2g/L、酵母粉10g/L、蛋白胨4g/L、FeSO₄·7H₂O 0.02g/L、MnSO₄·4H₂O 0.02g/L、生物素50μg/L、硫胺素200μg/L,pH 7.4。

本发明通过为谷氨酸棒杆菌的莽草酸合成途径的关键基因aroG、aroB、aroD、aroE分别选择不同的RBS，使四种基因表达量最有利于谷氨酸棒杆菌的莽草酸合成；本发明在关键基因aroG、aroB、aroD、aroE的启动子后分别插入了RiboJ基因，从而排除了Ptac启动子在转录后形成的非编码区对蛋白质翻译造成的影响。

附图说明

图1是本发明实施例提供的产莽草酸的谷氨酸棒杆菌的关键基因及调控元件结构图；

图2是本发明实施例提供的摇瓶培养产莽草酸的谷氨酸棒杆菌的莽草酸产量图；

图3是本发明实施例提供的产莽草酸的谷氨酸棒杆菌的发酵液组成的高效液相色谱(HPLC)检测结果图。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，但本发明不限于下述实施例。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。以下实施例中的大肠杆菌为：E.coli DH5α；谷氨酸棒杆菌莽草酸激酶基因敲除的营养缺陷型菌株(Corynebacterium glutamicum RES167ΔaroK)及本发明构建的菌株Corynebacterium glutamicumΔaroK/pXMJ19-GBTDE，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological CultureCollection Center,CGMCC)，Corynebacterium glutamicum RES167ΔaroK的保藏编号为：CGMCC No.10678、Corynebacterium glutamicumΔaroK/pXMJ19-GBTDE保藏编号为：CGMCCNo.10679。

实施例1

pXMJ19-aroG、pXMJ19-aroB、pXMJ19-aroD、pXMJ19-aroE载体的构建

从谷氨酸棒杆菌的基因组中扩增aroG、aroB、aroD和aroE基因，所用引物为aroG-F、aroG-R、aroB-F、aroB-R、aroD-F、aroD-R、aroE-F和aroE-R，其中，aroG-F为针对aroG基因的正向引物，aroG-R为针对aroG基因的反向引物，以此类推。用核酸内切酶KpnI、SalI酶切aroG、aroB、aroD基因和载体pXMJ19，回收基因片段和载体，将回收的aroG，aroB，aroD基因片段连接到载体pXMJ19(购自杭州工道生物技术有限公司)中，用核酸内切酶KpnI、PstI酶切aroE基因片段和载体pXMJ19，回收基因片段和载体，将基因片段和载体进行连接，aroG克隆到载体的KpnI、SalI位点，aroB克隆到载体的KpnI、SalI位点，aroD克隆到载体的KpnI、SalI位点，aroE克隆到载体的KpnI、PstI位点。aroG、aroB、aroD和aroE基因片段与载体的连接方法为：将T4 DNA连接酶缓冲液2.5μl加入灭菌的PCR管中，加入回收的DNA片段1μl和载体DNA 7μl，加入T4 DNA连接酶1μl，加入ddH₂O 13.5μl，16℃反应2小时，得到重组质粒载体，得到的载体分别命名为pXMJ19-aroG、pXMJ19-aroB、pXMJ19-aroD、pXMJ19-aroE。

所用引物序列如下：

aroG-F	CGCGCGTCGACATGAATAGGGGTGTGAGTTG
		aroG-R	CGCGCGGTACCTTAGTTACGCAGCATTTCTGCAACG
aroB-F	CGCGCGTCGACATGAGCGCAGTGCAGATTTTC
		aroB-R	CGCGCGGTACCTTAGTGGCTGATTGCCTCATAGCA
aroD-F	CGCGCGTCGACATGCCTGGAAAAATTCTCCT
		aroD-R	CGCGCGGTACCTTACTTTTTGAGATTTGCCAGGATA
aroE-F	CGCGCCTGCATATGGGTTCTCACATCACTCAC
		aroE-R	CGCGCGGTACCTTAGTGTTCTTCTGAGATGCCT

实施例2

酶切位点突变

为了方便后续的载体构建，对aroG中的酶切位点HindIII、PstI，aroB中的酶切位点BamHI、SpeI，aroD中的酶切位点PstI，aroE中的酶切位点EcoRI、SalI进行了突变。所用引物为MU-aroG-1-F、MU-aroG-1-R、MU-aroG-2-F、MU-aroG-2-R、MU-aroG-3-F、MU-aroG-3-R、MU-aroB-1-F、MU-aroB-1-R、MU-aroB-2-F、MU-aroB-2-R、MU-aroD-F、MU-aroD-R、MU-aroE-1-F、MU-aroE-1-R、MU-aroE-2-F、MU-aroE-2-R，其中，MU-aroG-1-F、MU-aroG-1-R为含有突变位点的针对aroG基因的第一对引物，MU-aroG-2-F、MU-aroG-2-R为含有突变位点的针对aroG基因的第二对引物，以此类推。用上述引物以pXMJ19-aroG、pXMJ19-aroB、pXMJ19-aroD、pXMJ19-aroE为模板分别进行PCR，得到的PCR产物，转化大肠杆菌感受态细胞，长出的克隆采用第二代DNA测序技术进行测序，根据测序结果选择正确突变的载体。得到的载体分别命名为pXMJ19-aroG^MU、pXMJ19-aroB^MU、pXMJ19-aroD^MU、pXMJ19-aroE^MU。进行突变是为了方便后续的载体与DNA片段的组装，aroG，aroB，aroD，aroE基因内部包含在后续的组装中需要用到的BamHI、EcoRI、KpnI、SalI等酶切位点，在这些位点存在的情况下，无法按照预先设计的酶切位点进行试验，因此需要将上述位点进行突变。

所用引物序列如下：

实施例3

RiboJ基因的插入

RiboJ基因购买自生工生物工程(上海)股份有限公司，并克隆于生工生物工程(上海)股份有限公司购买的pUC19中。用引物RiboJ-F，RiboJ-R扩增RiboJ基因，扩增的基因片段经过回收，用核酸内切酶HindIII、PstI酶切RiboJ基因和载体pXMJ19，回收RiboJ基因片段和载体，将RiboJ基因片段和载体进行连接，连接方法为：将T4 DNA连接酶缓冲液2.5μl加入灭菌的PCR管中，加入回收的DNA片段1μl和载体DNA 7μl，加入T4 DNA连接酶1μl，加入ddH₂O 13.5μl，16℃反应2小时，得到重组质粒载体，得到的载体命名为pXMJ19-RiboJ。

RiboJ的作用：Ptac启动子在转录后的非编码区会对蛋白质的翻译造成影响，加入RiboJ片段后，在转录后RiboJ可以形成核酶形式的二级结构并将自身前端的序列剪切掉，从而排除了Ptac启动子在转录后形成的非编码区会对蛋白质翻译造成的影响。

所用引物序列如下：

RiboJ-F	CGCGAAGCTTAGCTGTCACCGGATGTGCTTTCCGGTCTGATGAGTC
		RiboJ-R	CGCGCTGCAGTTAAACAAAATTATTTGTAGAGGCTGTTTCG

实施例4

EGFP基因的插入

从载体pACGFP中用引物EGFP-F、EGFP-R扩增egfp基因(增强型绿色荧光蛋白基因)，上述引物扩增的基因片段经过回收，用核酸内切酶EcoRI、KpnI酶切egfp基因片段和载体pXMJ19-RiboJ，回收egfp基因片段和载体，将egfp基因和载体进行连接，连接方法：将T4DNA连接酶缓冲液2.5μl加入灭菌的PCR管中，加入回收的DNA片段1μl和载体DNA 7μl，加入T4 DNA连接酶1μl，加入ddH2O 13.5μl，16℃反应2小时，得到重组质粒载体，得到的载体命名为pZB。

所用引物序列如下：

实施例5

RBS序列的插入

用引物MU-RBSAG-F、MU-RBSAG-R、MU-RBSAB-F、MU-RBSAB-R、MU-RBSAD-F、MU-RBSAD-R、MU-RBSAE-F、MU-RBSAE-R分别以pXMJ19-aroG^MU、pXMJ19-aroB^MU、pXMJ19-aroD^MU、pXMJ19-aroE^MU为模板扩增出基因片段，上述引物扩增的基因片段经过回收，用核酸内切酶SalI、KpnI酶切回收的基因片段和载体pXMJ19，将回收的基因片段和载体进行连接，连接方法：将T4 DNA连接酶缓冲液2.5μl加入灭菌的PCR管中，加入回收的DNA片段1μl和载体DNA 7μl，加入T4 DNA连接酶1μl，加入ddH₂O 13.5μl，16℃反应2小时，得到重组质粒载体，得到的质粒载体命名为pZB-aroG、pZB-aroB、pZB-aroD、pZB-aroE。将上述质粒载体分别转化大肠杆菌。对得到的克隆采用第二代DNA测序技术进行测序。

所用引物序列如下：

实施例6

荧光强度检测

实施例5中测序无误的质粒再转化至Corynebacterium glutamicum RES167ΔaroK中，在MS培养基中，0.5mM IPTG诱导，30℃，200rpm培养48小时后检测荧光强度及OD600。OD600及荧光强度的检测使用 synergy H4 Hybrid酶标仪。MS培养基(每升培养基含：Na₂HPO₄-12H₂O 2.0g、KH₂PO₄ 0.5g、MgSO₄-7H₂O 0.03g、NH₄C1 0.53g、微量元素溶液2m1、生物素100g、维生素B1 500g，pH 8.0)。其中，微量元素溶液组成为：EDTA 0.500g、ZnSO₄-7H₂O 0.220g、CaC1₂ 0.055g、MnCl₂-4H₂O 0.051g、FeSO₄-7H₂O 0.0499g、(NH₄)₆Mo₇O₂₄-4H₂O 0.011g、CuSO₄-5H₂O 0.0157g、CoCl₂-6H₂O 0.0161g，加水至1000ml；pH 6.0。

经过检测发现不同RBS对应的相对荧光强度：RBS1：AAAGGGTGAATCT为250985.7、RBS2：AAAGGCATGTTCT为603334、RBS3:AAAGGCATGGCCG为277826、RBS4:AAAGG AGAACGTG为233609。

实施例7

载体pXMJ19-RiboJ-aroG^MU-H构建

分别用引物aroG-H-F、aroG-H-R以pXMJ19-aroG^MU为模板扩增出基因片段aroG-H用上述引物扩增的基因片段经过回收，用核酸内切酶SalI、BamHI分别酶切aroG-H基因片段和载体pXMJ19-RiboJ，回收基因片段和载体，将基因片段和载体进行连接，连接方法：将T4DNA连接酶缓冲液2.5μl加入灭菌的PCR管中，加入回收的DNA片段1μl和载体7μl，加入T4DNA连接酶1μl，加入ddH₂O 13.5μl，16℃反应2小时，得到重组质粒载体，得到的载体命名为pXMJ19-RiboJ-aroG^MU-H。

所用引物序列如下：

aroG-H-F	CGCGCGTCGACAAAGGGTGAATCTATGAATAGGGGTGTGAGTTG
		aroG-H-R	CGCGCGGATCCTTAGTTACGCAGCATTTCTGCAACG

实施例8

载体pXMJ19-RiboJ-aroB^MU-M、pXMJ19-RiboJ-aroD^MU-M、pXMJ19-RiboJ-aroE^MU-M的构建

分别用引物aroB-M-F、aroB-M-R、aroD-M-F、aroD-M-R、aroE-M-F、aroE-M-R扩增aroB-M、aroD-M、aroE-M基因，扩增的基因经过回收，用核酸内切酶SalI、BamHI分别酶切aroB-M、aroD-M、aroE-M基因片段和载体pXMJ19-RiboJ，回收基因片段和载体，将基因片段和载体进行连接，连接方法：将T4 DNA连接酶缓冲液2.5μl加入灭菌的PCR管中，加入回收的DNA片段1μl和载体DNA 7μl，加入T4 DNA连接酶1μl，加入ddH₂O 13.5μl，16℃反应2小时，得到重组质粒载体，得到的载体命名为pXMJ19-RiboJ-aroB^MU-M、pXMJ19-RiboJ-aroD^MU-M、pXMJ19-RiboJ-aroE^MU-M。

所用引物序列如下：

实施例9

载体pXMJ19-GHBM构建

用引物PB-F、PB-R、PD-F、PD-R、PE-F、PE-R分别以pXMJ19-RiboJ-aroB^MU-M、pXMJ19-RiboJ-aroD^MU-M、pXMJ19-RiboJ-aroE^MU-M为模板扩增出基因片段Ptac-aroB-M、Ptac-aroD-M、Ptac-aroE-M，扩增的基因片段经过回收，用核酸内切酶BamHI、XmaI分别酶切Ptac-aroB-M基因片段和载体pXMJ19-RiboJ-aroG^MU-H，回收基因片段和载体，将基因片段和载体进行连接，连接方法：将T4 DNA连接酶缓冲液2.5μl加入灭菌的PCR管中，加入回收的DNA片段1μl和载体7μl，加入T4 DNA连接酶1μl，加入ddH₂O 13.5μl，16℃反应2小时，得到重组质粒载体，得到载体命名为pXMJ19-GHBM。

所用引物序列如下：

PB-F	CGCGGGATCCTTGCGCCGACATCATAACGGTT
		PB-R	CGCGCCCGGGTTAGTGGCTGATTGCCTCATAAGCA
PD-F	CGCGCCCGGGTTGCGCCGACATCATAACGGTT
		PD-R	CGCGGGTACCTTACTTTTTGAGATTTGCCAGGATA
PE-F	CGCGGGTACCTTGCGCCGACATCATAACGGTT
		PE-R	CGCGGAATTCTTAGTGTTCTTCTGAGATGCCT

实施例10

载体pXMJ19-GHBMDM构建

再用KpnI、XmaI分别酶切基因片段Ptac-aroD-M及载体pXMJ19-GHBM,回收基因片段和载体，将基因片段和载体进行连接，连接方法：将T4 DNA连接酶缓冲液2.5μl加入灭菌的PCR管中，加入回收的DNA片段1μl和载体7μl，加入T4 DNA连接酶1μl，加入ddH₂O 13.5μl，16℃反应2小时，得到重组质粒pXMJ19-GHBMDM。

实施例11

载体pXMJ19-GBDE构建

用EcoRI、XmaI分别酶切基因片段Ptac-aroE-M及载体pXMJ19-GHBMDM,回收基因片段和载体，将基因片段和载体进行连接，连接方法：将T4 DNA连接酶缓冲液2.5μl加入灭菌的PCR管中，加入回收的DNA片段1μl和载体7μl，加入T4 DNA连接酶1μl，加入ddH₂O 13.5μl，16℃反应2小时，得到重组质粒pXMJ19-GBDE。

实施例12

用引物Terminator1-F、Terminator1-R、Terminator2-F、Terminator2-R、Terminator3-F、Terminator3-R以pXMJ19为模板扩增出终止子1、终止子2、终止子3基因片段，其中，Terminator1-F、Terminator1-R为针对终止子1的一对引物，以此类推。终止子1、终止子2和终止子3的序列依次分别如序列表中的SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ IDNO:12所示。在本发明中，终止子在转录水平上对不同模块的转录进行终止。同时，还可以有效的防止通读现象的发生。所谓通读是指，在串联表达多基因的情况下核糖体越过终止密码子UAA而继续翻译下游序列的情况。将终止子1基因片段与载体pXMJ19-GBDE用XmaI进行酶切，回收基因片段和载体，将基因片段和载体进行连接，连接方法：将T4 DNA连接酶缓冲液2.5μl加入灭菌的PCR管中，加入回收的DNA片段1μl和载体7μl，加入T4 DNA连接酶1μl，加入ddH₂O 13.5μl，16℃反应2小时，得到重组质粒pXMJ19-GBTDE。

将终止子2基因片段与载体pXMJ19-GBTDE用KpnI进行酶切，回收基因片段和载体，将基因片段和载体进行连接，连接方法：将T4 DNA连接酶缓冲液2.5μl加入灭菌的PCR管中，加入回收的DNA片段1μl和载体7μl，加入T4 DNA连接酶1μl，加入ddH₂O 13.5μl，16℃反应2小时，得到重组质粒pXMJ19-GBTDTE。

将终止子3基因片段与载体pXMJ19-GBTDTE用BamHI进行酶切，回收基因片段和载体，将基因片段和载体进行连接，连接方法：将T4 DNA连接酶缓冲液2.5μl加入灭菌的PCR管中，加入回收的DNA片段1μl和载体7μl，加入T4 DNA连接酶1μl，加入ddH₂O 13.5μl，16℃反应2小时，得到重组质粒pXMJ19-GTBTDTE。

实施例13

将载体pXMJ19-GBDE、pXMJ19-GBTDE、pXMJ19-GBTDTE、pXMJ19-GTBTDTE分别转化至C.glutamicum RES167ΔaroK(此菌为自己构建的莽草酸激酶基因敲除的营养缺陷型菌株)，(已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China GeneralMicrobiological Culture Collection Center,CGMCC)，保藏编号CGMCC No.10678，在250mL三角瓶中，初始OD600为0.15左右，0.5mM IPTG诱导，30℃，200rpm，装液50mL的条件下培养72小时，莽草酸产量如图2所示。其中对照菌株为没有经过工程学改造的菌株C.glutamicum RES167ΔaroK的莽草酸产量，在同样的培养条件下其莽草酸产量为0.08g/L。培养基组分及含量如下，每升培养基含：K₂HPO₄·3H₂O 0.5g、KH₂PO₄ 0.5g、(NH₄)₂SO₄ 10g、葡萄糖40g、MgSO₄·7H₂O 0.2g、苯丙氨酸0.15g、酪氨酸0.15g、色氨酸0.15g、CaCO₃ 30g、FeSO₄·7H₂O 0.02g、MnSO₄·4H₂O 0.02g、生物素50μg、硫胺素200μg,pH 7.4。

将载体pXMJ19-GBTDE转化至C.glutamicum RES167ΔaroK(此菌为自己构建的莽草酸激酶基因敲除的营养缺陷型菌株)中，在250mL三角瓶中，初始OD600为0.15左右，0.5mMIPTG诱导，30℃，200rpm，装液50mL的条件下培养72小时，莽草酸产量可达到4.3g/L。其中对照菌株为没有经过工程学改造的菌株C.glutamicum RES167ΔaroK，在同样的培养条件下其莽草酸产量为0.77g/L。在5L发酵罐中，接种量按体积比5％接种，种子液的OD600值为14，0.5mM IPTG诱导，温度为30℃，通气速率为3vvm，溶氧50％，发酵过程中分别在发酵20小时和34小时补加蔗糖，每升发酵液补加35克蔗糖，搅拌转速为300rpm的条件下培养发酵3～5天，莽草酸产量为11.3g/L。培养基组成及含量如下，每升培养基含：K₂HPO₄·3H₂O 0.5g、KH₂PO₄ 0.5g、尿素3g、蔗糖38g、MgSO₄·7H₂O 0.2g、酵母粉10g、蛋白胨4g、FeSO₄·7H₂O0.02g、MnSO₄·4H₂O 0.02g、生物素50μg、硫氨素200μg,pH 7.4。

莽草酸的检测方法：取适量发酵液，12000rpm离心10分钟，取上清液用去离子水稀释适当倍数，通过高效液相色谱(HPLC)检测莽草酸产量。色谱柱为Zorbax Eclipse XDB-C18(Agilent Technologies，USA)；流动相为甲醇和pH 2.5的磷酸水溶液(95:5,v/v)；等度洗脱；流速0.35mL/min；柱温30℃；进样量5μL；检测器:DAD(Agilent Technologies，USA)，215nm。

莽草酸产量计算方法：从sigma公司购买莽草酸的标准品，配制不同浓度的莽草酸标准溶液，0g/L、0.01g/L、0.05g/L、0.1g/L、0.2g/L、0.4g/L、0.8g/L、1g/L，分别将上述标准液用HPLC检测出峰面积，根据峰面积和莽草酸标准溶液的浓度计算出标准曲线为Y＝80759X+63.56，其中Y为相应浓度莽草酸的峰面积，X为莽草酸的浓度)。将未知浓度的莽草酸样品通过HPLC检测可以得到一个峰面积，带入上述标准曲线公式得出浓度。结果如图3所示，12.078处的峰为莽草酸。

Claims

1.一种产莽草酸的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，包含aroG、aroB、aroD和aroE基因，还包含调控所述aroG基因表达的RBS1、调控所述aroB基因表达的RBS2、调控所述aroD基因表达的RBS3和调控所述aroE基因表达的RBS4；所述aroG的基因序列为SEQ ID NO:6所示，所述aroB的基因序列为SEQ ID NO:7所示，所述aroD的基因序列为SEQ ID NO:8所示，所述aroE的基因序列为SEQ ID NO:9所示；

所述RBS1的基因序列为SEQ ID NO:1所示，所述RBS2的基因序列为SEQ ID NO:2所示，所述RBS3的基因序列为SEQ ID NO:3所示，所述RBS4的基因序列为SEQ ID NO:4所示。

2.如权利要求1所述的产莽草酸的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述aroB基因与aroD基因之间还插入有终止子2，所述终止子2的基因序列为SEQ ID NO:11所示。

3.如权利要求1或2所述的产莽草酸的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，还包含

RiboJ基因，所述RiboJ的基因序列为SEQ ID NO:5所示。

4.如权利要求3所述的产莽草酸的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述aroG基因与aroG基因的启动子之间插入有RiboJ基因，所述aroB基因与aroB基因的启动子之间插入有RiboJ基因、所述aroD基因与aroD基因的启动子之间插入有RiboJ基因，所述aroE基因与aroE基因的启动子之间插入有RiboJ基因。

5.一种产莽草酸的谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

2)将aroG基因中的HindIII和PstI酶切位点，aroB基因中的BamHI和SpeI酶切位点，aroD基因中的PstI酶切位点，aroE基因中的EcoRI和SalI酶切位点进行突变，得到载体pXMJ19-aroG^MU、pXMJ19-aroB^MU、pXMJ19-aroD^MU、pXMJ19-aroE^MU；

3)将RiboJ基因插入载体pXMJ19，得到载体pXMJ19-RiboJ；

4)将荧光蛋白基因插入所述载体pXMJ19-RiboJ，得到载体pZB；

5)用引物MU-RBSAG-F和MU-RBSAG-R以所述pXMJ19-aroG^MU为模板扩增基因片段aroG^MU，用引物MU-RBSAB-F和MU-RBSAB-R以所述pXMJ19-aroB^MU为模板扩增基因片段aroB^MU，用引物MU-RBSAD-F和MU-RBSAD-R以所述pXMJ19-aroD^MU为模板扩增基因片段aroD^MU，用引物MU-RBSAE-F和MU-RBSAE-R以所述pXMJ19-aroE^MU为模板扩增基因片段aroE^MU，所述MU-RBSAG-F的基因序列为CGCGCGTCGACAAAGGNNNNNNNNATGAATAGGGGTGTGAGTTG，所述MU-RBSAG-R的基因序列为CGCGCGGTACCGTTACGCAGCATTTCTGCAACG，所述MU-RBSAB-F的基因序列为CGCGCGTCGACAAAGGNNNNNNNNATGAGCGCAGTGCAGATTTTC，所述MU-RBSAB-R的基因序列为CGCGCGGTACCGTGGCTGATTGCCTCATAAGCA，所述MU-RBSAD-F的基因序列为CGCGCGTCGACAAAGGNNNNNNNNATGCCTGGAAAAATTCTCCT，所述MU-RBSAD-R的基因序列为CGCGCGGTACCCTTTTTGAGATTTGCCAGGATA，所述MU-RBSAE-F的基因序列为CGCGCGTCGACAAAGGNNNNNNNNATGGGTTCTCACATCACTCAC，所述MU-RBSAE-R的基因序列为CGCGCGGTACCGTGTTCTTCTGAGATGCCT；

7)步骤6)得到的载体分别转化大肠杆菌，对得到的克隆进行测序，将测序无误的所述载体pZB-aroG、pZB-aroB、pZB-aroD和pZB-aroE共同转化至Corynebacterium glutamicumRES167ΔaroK中，培养并检测荧光强度，Corynebacterium glutamicum RES167ΔaroK的菌株保藏号为CGMCC No.10678；

8)用引物aroG-H-F、aroG-H-R以所述pXMJ19-aroG^MU为模板扩增基因片段aroG-H并插入所述载体pXMJ19-RiboJ，得到载体pXMJ19-RiboJ-aroG^MU-H；所述aroG-H的基因序列如SEQID NO:13所示,所述aroG-H-F的基因序列为CGCGCGTCGACAAAGGGTGAATCTATGAATAGGGGTGTGAGTTG，所述aroG-H-R的基因序列为CGCGCGGATCCTTAGTTACGCAGCATTTCTGCAACG；

9)用引物aroB-M-F、aroB-M-R以所述pXMJ19-aroB^MU为模板扩增基因片段aroB-M；用aroD-M-F、aroD-M-R以所述pXMJ19-aroD^MU为模板扩增基因片段aroD-M；用aroE-M-F、aroE-M-R以所述pXMJ19-aroE^MU为模板扩增基因片段aroE-M；将扩增的基因片段aroB-M、aroD-M和aroE-M分别插入所述载体pXMJ19-RiboJ，获得载体pX MJ19-RiboJ-aroB^MU-M、pXMJ19-RiboJ-aroD^MU-M和pXMJ19-RiboJ-aroE^MU-M；所述aroB-M、aroD-M和aroE-M的基因序列依次分别如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和S EQ ID NO:16所示，所述aroB-M-F的基因序列为CGCGCGTCGACAAAGGCATGTTCTATGAGCGCAGTGCAGATTTTC，所述aroB-M-R的基因序列为CGCGCGGATCCTTAGTGGCTGATTGCCTCATAAGCA，所述aroD-M-F的基因序列为CGCGCGTCGACAAAGGCATGGCCGATGCCTGGAAAAATTCTCCT，所述aroD-M-R的基因序列为CGCGCGGATCCTTACTTTTTGAGATTTGCCAGGATA，所述aroE-M-F的基因序列为CGCGCGTCGACAAAGGAGAACGTGATGGGTTCTCACATCACTCAC，所述aroE-M-R的基因序列为CGCGCGGATCCTTAGTGTTCT TCTGAGATGCCT；

10)用引物PB-F、PB-R以所述pXMJ19-RiboJ-aroB^MU-M为模板扩增基因片段Ptac-aroB-M；用引物PD-F、PD-R以所述pXMJ19-RiboJ-aroD^MU-M为模板扩增基因片段Ptac-aroD-M；用引物PE-F、PE-R以所述pXMJ19-RiboJ-aroE^MU-M为模板扩增基因片段Ptac-aroE-M，将基因片段Ptac-aroB-M插入所述载体pXMJ19-RiboJ-aroG^MU-H，得到载体pXMJ19-GHBM；所述Ptac-aroB-M的基因序列如SEQ ID NO:17所示，所述PB-F的基因序列为CGCGGGATCCTTGCGCCGACATCATAACGGTT，所述PB-R的基因序列为CGCGCCCGGGTTAGTGGCTGATTGCCTCATAAGCA，所述PD-F的基因序列为CGCGCCCGGGTTGCGCCGACATCATAACGGTT，所述PD-R的基因序列为CGCGGGTACCTTACTTTTTGAGATTTGCCAGGATA，所述PE-F的基因序列为CGCGGGTACCTTGCGCCGACATCATAACGGTT，所述PE-R的基因序列为CGCGGAATTCTTAGTGTTCTTCTGAGATGCCT；

11)将片段Ptac-aroD-M插入所述载体pXMJ19-GHBM，得到载体pXMJ19-GHBMDM；所述Ptac-aroD-M的基因序列如SEQ ID NO:18所示；

12)将片段Ptac-aroE-M插入所述载体pXMJ19-GHBMDM，得到载体pXMJ19-GBDE；所述Ptac-aroE-M的基因序列如SEQ ID NO:19所示；

13)用引物Terminator2-F、Terminator2-R以pXMJ19为模板扩增终止子2，将终止子2和所述载体pXMJ19-GBDE分别用XmaI进行酶切，回收终止子2片段和载体pXMJ19-GBDE，将终止子2片段和载体pXMJ19-GBDE进行连接，得到载体pXMJ19-GBTDE，所述终止子2的基因序列为SEQ ID NO:11所示；

14)将所述pXMJ19-GBTDE转化至C.glutamicum RES167ΔaroK，获得产莽草酸的谷氨酸棒杆菌，C.glutamicum RES167ΔaroK的菌株保藏号为CGMCC No.10678。

6.如权利要求5中所述的产莽草酸的谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于，步骤4)中所述荧光蛋白基因为egfp基因。

7.一种生产莽草酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：

按2％～4％体积比的接种量接种权利要求1至4中任一产莽草酸的谷氨酸棒杆菌种子液到灭菌后冷至发酵温度的发酵培养基中，所述种子液的OD600值为14，温度为30℃，通气速率为3vvm，发酵过程中补加蔗糖，搅拌转速为300rpm的条件下培养发酵3～5天，获得含莽草酸浓度为10～12g/L的发酵液。

8.如权利要求7所述的生产莽草酸的方法，其特征在于，所述发酵过程中补加蔗糖步骤中，分别在发酵20小时及发酵34小时的时候补加蔗糖，每升发酵液补加35g蔗糖。