CN104910158A - 具有生物活性的5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有生物活性的5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶化合物及其制备方法和应用，属于具有抗肿瘤活性的化合物的合成技术领域。本发明的技术方案要点为：具有生物活性的5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶化合物，具有如下结构： ，其中R1为乙基甲酸酯基、乙胺甲基、甲胺甲酰基、二甲胺基甲酰基、吡啶-3-亚甲基胺基甲酰基、哌啶甲酰基或苯胺基甲酰基，R2为氢或苄基。本发明还公开了该具有生物活性的5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶化合物的制备方法及其在制备抗乳腺肿瘤药物中的应用。本发明的制备过程工艺简单，易于控制，目标产物收率高且重复性好，制得的具有抗肿瘤活性的5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶化合物均对乳腺癌细胞MCF-7具有一定的抑制作用。
Description
技术领域
本发明属于具有抗肿瘤活性的化合物的合成技术领域，具体涉及一种具有生物活性的5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶化合物及其制备方法和应用。
背景技术
四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶化合物是一种重要的含氮杂环，在医药、农药、化学、物理和材料科学等众多领域有着不可缺少的作用。四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶化合物因为具有很好的生物活性被广泛应用于医药研究，例如：文章（中国药物化学杂志,25(1),2015,8-14）报道合成了一系列2-氨基-7,8-二氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-6(5H) 烷氧基双芳基脲类化合物，其中有多个化合物在对人乳腺癌细胞MDA-MB-231的体外抗增殖活性测试中，表现出很好的效果。鉴于此，本发明合成了一系列新型的5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶化合物，并对其做了抗乳腺癌细胞MCF-7活性测试。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供了一种工艺简单、易于控制、目标产物收率较高且重复性好的具有生物活性的5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶化合物及其制备方法，制得的5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶化合物在制备抗肿瘤药物中具有较好的应用前景。
本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，具有生物活性的5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶化合物，其特征在于具有如下结构： ，其中R1为乙基甲酸酯基、乙胺甲基、甲胺甲酰基、二甲胺基甲酰基、吡啶-3-亚甲基胺基甲酰基、哌啶甲酰基或苯胺基甲酰基，R2为氢或苄基。
本发明所述的具有生物活性的5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶化合物的制备方法，其特征在于：7-苄基-4-乙基甲酸酯基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶的合成包括以下步骤：
（1）在反应瓶中加入苄胺、溴代乙酸乙酯、三乙胺和甲苯，回流反应至TLC监控原料反应完全，停止加热，加水后用乙醚萃取反应液，合并有机相，再用饱和碳酸钠溶液洗涤有机相，分出有机相，蒸出溶剂，经柱层析分离提纯得到N-乙酸乙酯基苄胺；
（2）在反应瓶中加入N-乙酸乙酯基苄胺、溴丁酸乙酯、碳酸钾和乙腈，回流反应至TLC监控原料反应完全后过滤反应液，滤液减压浓缩，经柱层析分离提纯得到N-丁酸乙酯基-N-乙酸乙酯基-苄胺；
（3）在反应瓶中加入N-丁酸乙酯基-N-乙酸乙酯基-苄胺、乙醇钠和甲苯，加热至回流，TLC监控原料反应完全后，冷却，水洗，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用饱和氯化钠溶液洗涤有机相后蒸出有机相得到1-苄基-3-羰基-4-哌啶甲酸乙酯；
（4）在反应瓶中加入甲脒盐酸盐、甲醇和氢化钾，搅拌混合均匀后加入1-苄基-3-羰基-4-哌啶甲酸乙酯，氮气保护下，TLC监控原料反应完全，加入乙酸溶液，减压蒸出溶剂甲醇，加水后用二氯甲烷萃取，再用饱和氯化钠溶液洗涤有机相，蒸出有机相得到7-苄基-4-羰基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶；
（5）在反应瓶中，把7-苄基-4-羰基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶加入到三氯氧磷中，加热回流反应至TLC监控原料反应完全，减压蒸出三氯氧磷，往浓缩物中加入饱和碳酸氢钠溶液，用二氯甲烷萃取反应液，合并有机相，旋干后粗产品经柱层析分离提纯得到7-苄基-4-氯-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶；
（6）在高压釜中加入7-苄基-4-氯-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶、三苯基膦、醋酸铅、二茂铁和三乙胺，以乙醇作为溶剂，通入CO使高压釜内压力达到1MPa，加热至100℃，TLC监控原料反应完全后过滤反应液，滤液蒸出溶剂乙醇，再经柱层析色谱分离提纯得到7-苄基-4-乙基甲酸酯基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶。
本发明所述的具有生物活性的5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶化合物的制备方法，其特征在于：7-苄基-4-乙胺甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶的合成包括以下步骤：
（1）在反应瓶中，将上述合成的7-苄基-4-乙基甲酸酯基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶和硼氢化钠加入到甲醇中，室温反应直至TLC监控原料反应完全，加水后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，旋干后粗产品经柱层析分离提纯得到7-苄基-4-羟甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶；
（2）在反应瓶中，把7-苄基-4-羟甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶和三乙醇胺加入到二氯甲烷中，反应温度设定为-10℃，滴加甲基磺酰氯溶液，滴加完后反应温度升至20℃，反应直至TLC监控原料反应完全，加水后用二氯甲烷萃取反应液，分出有机相，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤后，旋干有机相得到7-苄基-4-甲磺酰甲酯基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶；
（3）在反应瓶中，将7-苄基-4-甲磺酰甲酯基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶加入到乙腈中，再加入碘化钠和无水碳酸钾，室温反应1h后加入氨基乙烷，TLC监控原料反应完全，加水后用乙酸乙酯萃取反应液，合并有机相，旋干有机相后经柱层析分离提纯得到7-苄基-4-乙胺甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶。
本发明所述的具有生物活性的5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶化合物的制备方法，其特征在于：7-苄基-4-酰基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶和4-酰基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶的合成包括以下步骤：
（1）在反应瓶中，将上述合成的7-苄基-4-乙基甲酸酯基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶加入到甲醇中，再加入氢氧化钠溶液，加热至回流，反应结束后，冷却至室温，用盐酸溶液调节溶液pH为3-4，加水后用二氯甲烷萃取反应液，蒸出有机相得到7-苄基-4-羧基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶；
（2）在反应瓶中加入7-苄基-4-羧基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶、胺基化合物和混合催化剂2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)与三乙胺或O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸（TBTU）与三乙胺，以二氯甲烷作为溶剂，在室温下反应直至TLC监控原料反应完全，加水后用二氯甲烷萃取，有机相分出后旋干，粗品经柱层析分离提纯得到7-苄基-4-酰基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶化合物；
（3）在反应瓶中加入7-苄基-4-酰基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶化合物和甲酸铵，以钯碳作为催化剂，以甲醇作为溶剂，室温反应直至TLC监控原料反应完全，加水后用氯仿萃取，合并有机相旋干后经柱层析分离提纯得到4-酰基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶化合物。
进一步限定，所述的胺基化合物为盐酸二甲胺、盐酸甲胺、吡啶-3-甲胺、哌啶或苯胺。
本发明所述的具有生物活性的5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶化合物在制备抗乳腺肿瘤药物中的应用。
本发明合成了具有抗肿瘤活性的5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶化合物，制备过程工艺简单，易于控制，目标产物收率高且重复性好，制得的具有抗肿瘤活性的5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶化合物均对乳腺癌细胞MCF-7具有一定的抑制作用。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1
N-乙酸乙酯基苄胺的合成
在反应瓶中加入溴乙酸乙酯37g（0.22mol）后加入回流，在缓慢滴加苄胺22g（0.2mol）和三乙胺44g的混合溶液，滴加完后继续加热回流，TLC监控原料反应完后，冷却至室温，加入一定量的水后用乙醚500mL萃取反应液，合并有机相，用饱和的碳酸氢钠溶液洗涤反应液，分出有机相，蒸出溶剂后，经柱层析分离提纯（洗脱剂：PE：EA=20:1），得到N-乙酸乙酯基苄胺35g，收率88%。
实施例2
N-丁酸乙酯基-N-乙酸乙酯基-苄胺的合成
将N-乙酸乙酯基苄胺400g（2.1mol）加入乙腈3000mL中，再加入4-溴-丁酸乙酯450g（2.2mol）和无水碳酸钾700g（5.0mol），加热至回流，反应过夜，TLC监控原料反应完全，反应液冷却至室温，过滤反应液，滤液浓缩后经柱层析分离提纯（洗脱剂：PE:EA=10:1），得到产品N-丁酸乙酯基-N-乙酸乙酯基-苄胺492g，收率80%。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.26-7.14 (m, 5 H), 4.08-3.98 (m, 4 H), 3.69 (s, 2 H), 3.21 (s, 2 H), 2.58 (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 2.27 (t, J = 7.6 Hz, 2 H), 1.74-1.70 (m, 2 H), 1.19-1.13 (m, 6 H)。
实施例3
1-苄基-3-羰基-4-哌啶甲酸乙酯的合成
在反应瓶中，把N-丁酸乙酯基-N-乙酸乙酯基-苄胺400g（1.3mol）和乙醇钠177g（2.6mol）加入到甲苯1500mL中，加热回流反应5h，TLC监控原料反应完全，反应液冷却至室温，加入水1500mL，用乙酸乙酯1000mL萃取反应液2次，合并有机相，再用一定量的饱和氯化钠溶液洗涤有机相，最后蒸出有机相得到1-苄基-3-羰基-4-哌啶甲酸乙酯257g，收率76%。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 11.95 (s, 1 H), 7.35-7.28 (m, 5 H), 4.27-4.19 (m, 2 H), 3.61 (s, 2 H), 3.12 (s, 2 H), 2.62 (t, J =7.6 Hz, 2 H), 2.44 (t, J = 7.6 Hz, 2 H), 1.31-1.22 (m, 3 H). MS (ESI) m/z: 262.2 (M+H+)。
实施例4
7-苄基-4-羰基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶的合成
在反应瓶中，加入甲脒盐酸盐40g（385mmol）和甲醇500mL，再加入氢化钾45g（1.1mol），室温搅拌30min后再加入1-苄基-3-羰基-4-哌啶甲酸乙酯96g（322mmol），氮气保护，反应过夜，TLC监控原料反应完全，向反应液中加入乙酸24g（386mmol），然后减压蒸出溶剂，再加入水500mL，用二氯甲烷200mL萃取反应液2次，合并有机相，用一定量饱和氯化钠溶液洗涤有机相，蒸出有机相得到7-苄基-4-羰基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶70g，收率90%。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 7.93 (s, 1 H), 7.32-7.21 (m, 5 H), 3.65 (s, 2 H), 3.23 (s, 2 H), 2.79 (s, 1H), 2.69-2.66 (m, 2 H), 2.53-2.46 (m, 2 H). MS (ESI) m/z: 242.2 (M+H+)。
实施例5
7-苄基-4-氯-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶的合成
在反应瓶中，把7-苄基-4-羰基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶120g（500mmol）加入三氯氧磷500mL中，加热回流反应5h，TLC监控原料反应完全，减压蒸出三氯氧磷，在加入一定量的饱和碳酸氢钠溶液，用二氯甲烷萃取反应液，合并有机相，旋干后粗产品经柱层析分离提纯（洗脱剂：PE:EA=10:1），得到7-苄基-4-氯-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶93g，收率75%。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ: 8.64 (s, 1 H), 7.28-7.19 (m, 5 H), 3.67 (s, 2 H), 3.62 (s, 2 H), 2.80-2.75 (m, 4 H). MS (ESI) m/z: 260.1 (M+H+)。
实施例6
7-苄基-4-乙基甲酸酯基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶的合成
在高压釜中，将7-苄基-4-氯-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶18g（69mmol）、三苯基膦2.7g（12mmol）、醋酸铅2.7g（10mmol）、二茂铁2.7g（5mmol）和三乙胺21g（21mmol）加入乙醇100mL中，通入CO使釜内压力达到1MPa，加热至100℃，反应过夜，TLC监控原料反应完全，冷却至室温，过滤反应液，滤液减压蒸出溶剂，粗品经柱层析分离提纯（洗脱剂：PE:EA=10:1），得到7-苄基-4-乙基甲酸酯基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶14.3g，收率70%。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ: 8.97 (s, 1 H), 7.28-7.21 (m, 5 H), 4.42-4.35 (q, J = 7.2 Hz, 2 H), 3.67 (s, 2 H), 3.65 (s, 2 H), 3.09 (t, J = 8.0 Hz, 2 H), 2.71 (t, J = 8.0 Hz, 2 H), 1.35 (t, J = 7.2 Hz, 3 H). MS (ESI) m/z: 298.2 (M+H+)。
实施例7
7-苄基-4-羟甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶的合成
在反应瓶中，-10℃条件下，加入7-苄基-4-乙基甲酸酯基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶72g（0.24mol）、硼氢化钠23g（0.6mol）和甲醇720mL，加完后升至室温，反应2h，TLC监控原料反应完全，向反应液中加入水700mL，然后用乙酸乙酯500mL萃取4次，合并有机相，旋干后的粗品经柱层析分离提纯（洗脱剂：PE:EA=3:1），得到7-苄基-4-羟甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶31g，收率50%。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.93 (s, 1 H), 7.27-7.37(m, 5 H), 4.65 (s, 2 H), 3.74-3.71 (d, 4 H), 2.80-2.83 (t, 2 H),2.66-2.68 (t, 2 H). MS (ESI) m/z: 256 (M+H+)。
实施例8
7-苄基-4-甲磺酰甲酯基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶的合成
在反应瓶中，加入7-苄基-4-羟甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶26g（0.1mol）、三乙醇胺21.5mL（0.1mol）和二氯甲烷215mL，反应温度为-10℃，缓慢滴加甲基磺酰氯4.8mL（0.12mol），滴加完后，升温至20℃，反应2h，TLC监控原料反应完全，加入一定量的水100mL，再用100mL二氯甲烷萃取3次，分出有机相，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤后，旋干有机相，得到7-苄基-4-甲磺酰甲酯基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶29g，收率81%。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 7.38-7.34 (d, 1 H), 578-59 (m, 5 H), 3.84 (s, 1 H), 3.35 (s, 3 H), 3.16 (s, 1 H), 2.17-2.18 (d, 2 H), 168-1.72 (m, 2 H), 1.33-1.37 (m, 4 H). MS (ESI) m/z: 334 (M+H+)。
实施例9
7-苄基-4-乙胺甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶的合成
在反应瓶中，加入7-苄基-4-甲磺酰甲酯基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶36g（0.11mol）、碘化钠24g（0.16mol）、无水碳酸钾45g（0.32mol）和乙腈600mL，室温搅拌1h后，缓慢加入氨基乙烷540mL，反应过夜，TLC监控原料反应完后，加入水500mL，再用乙酸乙酯300mL萃取3次，合并有机相，旋干有机相后，产物粗品经柱层析分离提纯（洗脱剂：EA:MeOH:TEA=20:2:0.1），得到7-苄基-4-乙胺甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶23g，收率74%。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.89 (s, 1 H), 7.30-7.35 (m, 5 H), 3.95 (s, 2 H), 3.72 (s, 2 H), 3.71 (s, 2 H), 286-2.90 (t, 2 H), 2.80-2.81 (s, 2 H),140-148 (m, 2 H),1.28 (s, 3 H). MS (ESI) m/z: 283 (M+H+)。
实施例10
7-苄基-4-羧基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶的合成
在反应瓶中，加入7-苄基-4-乙基甲酸酯基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶60g（0.2mol）、氢氧化钠4g（0.1mol）和甲醇800ml，加热回流反应2h后冷却至室温，加入一定量的水，再用盐酸溶液条件反应液PH为3-4，蒸出甲醇后用二氯甲烷萃取反应液，合并有机相，旋干有机相得到7-苄基-4-羧基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶45g，收率84%。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.97 (s, 1 H), 7.64-7.61 (m, 2 H), 7.50-7.48 (m, 3 H), 4.52 (s, 2 H), 4.40 (s, 2 H), 3.60 (t, J = 6.4 Hz, 2 H), 3.40 (t, J = 6.0 Hz, 2 H). MS (ESI) m/z: 270.1 (M+H+).
实施例11
7-苄基-4-二甲胺基甲酰基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶的合成
在反应瓶中，加入7-苄基-4-羧基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶50g（186mmol）、HATU 85g（223mmol）、三乙胺94g（930mmol）和二氯甲烷500mL，在室温下反应1h后加入盐酸二甲胺23g（280mmol），在室温条件下反应20h，TLC监控原料反应完全，加入一定量的水500mL，用二氯甲烷200mL萃取两次，合并有机相，旋干有机相，粗品经柱层析分离提纯后（洗脱剂：PE:EA=3:1）得到7-苄基-4-二甲胺基甲酰基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶36g，收率66%。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ: 8.94 (s, 1 H), 7.36-7.27 (m, 5 H), 3.75 (s, 2 H), 3.73 (s, 2 H), 3.12 (s, 3 H), 2.89-2.86 (m, 5 H), 2.81-2.80 (m, 2 H). MS (ESI) m/z: 297.2 (M+H+)。
实施例12
4-二甲胺基甲酰基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶的合成
在反应瓶中，加入7-苄基-4-二甲胺基甲酰基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶36g（122mmol）、甲酸铵77g（1.2mol）、Pd/C 14.5g（10%w/w）和甲醇300mL，在室温下反应直至TLC监控原料反应完全后抽滤，向滤液中加入水250mL，反应液用氯仿200mL萃取3次，合并有机相，有机相蒸出后经柱层析分离提纯（洗脱剂：二氯甲烷：甲醇=20:1），得到4-二甲胺基甲酰基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶16.8g，收率67%。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.96 (s, 1 H), 4.10 (s, 2 H), 3.15 (t, J = 6.0 Hz, 2 H), 3.13 (s, 3 H), 2.89 (s, 3 H), 2.80 (t, J = 6.0 Hz, 2 H). MS (ESI) m/z: 207.2 (M+H+)。
实施例13
7-苄基-4-(哌啶-3-亚甲胺基)甲酰基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶的合成
在反应瓶中，加入7-苄基-4-羧基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶54g（0.2mol）、TBTU 76g（0.24mol）、三乙胺62g（0.6mol）、吡啶-3-甲胺47g（0.22mol）和DMF 800mL，室温搅拌，反应过夜，TLC监控原料反应完全，加入水500mL，再用二氯甲烷400mL萃取4次，合并有机相，有机相蒸出后得到的粗产品经柱层析分离提纯后（洗脱剂：PE:EA=3:1）得到7-苄基-4-(哌啶-3-亚甲胺基)甲酰基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶25g，收率35%。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.90 (s, 1 H), 8.62-854 (m, 3 H), 721-7.69 (t, 1 H), 7.39-7.28 (m, 7 H), 465-4.63 (d, 2 H), 3.75-374 (d, 4 H),3.50-3.46 (t, 2 H), 2.83-2.79 (t, 2 H). MS (ESI) m/z: 360 (M+H+)。
实施例14
4-(哌啶-3-亚甲胺基)甲酰基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶的合成
在反应瓶中，加入7-苄基-4-(哌啶-3-亚甲胺基)甲酰基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶20g（0.056mmol）、甲酸铵34g（0.56mol）、Pd/C 10g（10%w/w）和甲醇300mL，在室温下反应过夜，TLC监控原料反应完全后抽滤，向滤液中加入水250mL，反应液用氯仿200mL萃取3次，合并有机相，有机相蒸出后经柱层析分离提纯（洗脱剂：二氯甲烷：甲醇=10:1），得到4-(哌啶-3-亚甲胺基)甲酰基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶2.6g，收率18%。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.94 (s, 1 H), 8.67-8.54 (m, 3 H), 7.77-7.70 (m, 1 H), 7.38-7.30 (m, 1 H), 4.65-4.63 (s, 2 H), 3.80 (s, 2 H), 3.53 (t, J = 6.0 Hz, 2 H), 2.83 (t, J = 6.0 Hz, 2 H). MS (ESI) m/z: 270.2 (M+H+)。
实施例15
7-苄基-4-哌啶甲酰基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶的合成
在反应瓶中，加入7-苄基-4-羧基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶20g（0.07mol）、TBTU29g（0.09mol）、三乙胺22.5g（0.21mol）、哌啶7g（0.08mol）和二氯甲烷200mL，室温搅拌，反应过夜，TLC监控原料反应完全，加入水100mL，再用二氯甲烷50mL萃取3次，合并有机相，有机相蒸出后得到的粗产品经柱层析分离提纯后（洗脱剂：PE:EA=10:1）得到7-苄基-4-哌啶甲酰基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶16g，收率64%。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 8.93 (s, 1 H), 7.37-7.27 (m, 5 H), 3.71 (s, 2 H), 3.70 (s, 2 H), 3.18 (t, J = 4.2 Hz, 2 H), 2.88 (t, J = 6.4 Hz, 2 H), 2.80-2.77 (m, 4 H), 1.71-1.67 (m, 4 H), 1.57-1.55 (m, 2 H). MS (ESI) m/z: 337.2 (M+H+)。
实施例16
4-哌啶甲酰基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶
在反应瓶中，加入7-苄基-4-哌啶甲酰基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶36g（0.11mol）、甲酸铵70g（1.1mol）、Pd/C 15g（10%w/w）和甲醇1000mL，在室温下反应过夜，TLC监控原料反应完全后抽滤，向滤液中加入水500mL，反应液用氯仿500mL萃取3次，合并有机相，有机相蒸出后经柱层析分离提纯（洗脱剂：二氯甲烷：甲醇=10:1），得到4-哌啶甲酰基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶15g，收率60%。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 9.08 (s, 1 H), 4.47 (s, 2 H), 3.76 (t, J = 4.2 Hz, 2 H), 3.62 (t, J = 6.4 Hz, 2 H), 3.26 (t, J = 4.2 Hz, 2 H), 3.09 (t, J = 6.0 Hz, 2 H), 1.76-1.72 (m, 4 H), 1.62-1.60 (m, 2 H). MS (ESI) m/z: 247.2 (M+H+)。
实施例17
7-苄基-4-苯胺甲酰基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶的合成
在反应瓶中，加入7-苄基-4-羧基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶20g（0.07mol）、TBTU29g（0.09mol）、三乙胺22.5g（0.21mol）、苯胺7.6g（0.08mol）和二氯甲烷200mL，室温搅拌，反应过夜，TLC监控原料反应完全，加入水100mL，再用二氯甲烷50mL萃取3次，合并有机相，有机相蒸出后得到的粗产品经柱层析分离提纯后（洗脱剂：PE:EA=12:1）得到7-苄基-4-苯胺甲酰基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶18g，收率70%。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.99 (s, 1 H), 7.64 (d, J = 7.6 Hz, 1 H), 7.36 (t, J = 7.6 Hz, 1 H), 7.29-7.20 (m, 8 H), 3.87-3.82 (m, 2 H), 3.59 (s, 2 H), 3.08 (t, J = 8.4 Hz, 1 H), 2.97 (t, J = 8.0 Hz, 1 H), 2.83-2.80 (m, 1 H), 2.57-2.54 (m, 1 H). MS (ESI) m/z: 345.4 (M+H+)。
实施例18
苯胺甲酰基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶的合成
在反应瓶中，加入7-苄基-4-苯胺甲酰基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶36g（0.11mmol）、甲酸铵67g（1.1mol）、Pd/C 15g（10%w/w）和甲醇200mL，在室温下反应过夜，TLC监控原料反应完全后抽滤，向滤液中加入水100mL，反应液用氯仿50mL萃取3次，合并有机相，有机相蒸出后经柱层析分离提纯（洗脱剂：二氯甲烷：甲醇=10:1），得到苯胺甲酰基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶22g，收率80%。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 9.21 (s, 1 H), 7.78 (d, J = 7.6 Hz, 2 H), 7.41 (t, J = 8.0 Hz, 2 H), 7.26 (t, J = 7.6 Hz, 1 H), 4.53 (s, 2 H), 3.66 (t, J = 6.4 Hz, 2 H), 3.62 (t, J = 6.4 Hz, 2 H). MS (ESI) m/z: 254.9 (M+H+)。
实施例19
抗肿瘤活性测试
收集生长期乳腺癌细胞MCF-7，以MTS法测定一下化合物的抗癌活性，将细胞以适当浓度（每毫升4×104个细胞）加到96孔细胞培养板中（含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液），培养24小时后，在37℃、体积浓度为5%的CO2条件下与不同浓度的化合物作用72小时，然后将MTS（最终质量浓度2mg/mL）和DMS（最终摩尔浓度30μM）的混合物直接加入含细胞的培养基中，继续置培养箱孵育4h。作用4h后，弃去上清液，每孔加入150μLDMSO，振荡，细胞存活率通过其对MTS作用的代谢物在酶联免疫监测仪490nm波长下的吸收率测定。
。
初步生物活性测试表明，该类化合物在乳腺癌细胞MCF-7中对癌细胞均有抑制作用。
综上所述，本发明提供了一种具有生物活性的5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶化合物，这是该类化合物该用途的首次发现，具有重大的研发潜力。
以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。
Claims (6)
1.具有生物活性的5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶化合物，其特征在于具有如下结构： ，其中R1为乙基甲酸酯基、乙胺甲基、甲胺甲酰基、二甲胺基甲酰基、吡啶-3-亚甲基胺基甲酰基、哌啶甲酰基或苯胺基甲酰基，R2为氢或苄基。
2.一种权利要求1所述的具有生物活性的5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶化合物的制备方法，其特征在于7-苄基-4-乙基甲酸酯基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶的合成包括以下步骤：
（1）在反应瓶中加入苄胺、溴代乙酸乙酯、三乙胺和甲苯，回流反应至TLC监控原料反应完全，停止加热，加水后用乙醚萃取反应液，合并有机相，再用饱和碳酸钠溶液洗涤有机相，分出有机相，蒸出溶剂，经柱层析分离提纯得到N-乙酸乙酯基苄胺；
（2）在反应瓶中加入N-乙酸乙酯基苄胺、溴丁酸乙酯、碳酸钾和乙腈，回流反应至TLC监控原料反应完全后过滤反应液，滤液减压浓缩，经柱层析分离提纯得到N-丁酸乙酯基-N-乙酸乙酯基-苄胺；
（3）在反应瓶中加入N-丁酸乙酯基-N-乙酸乙酯基-苄胺、乙醇钠和甲苯，加热至回流，TLC监控原料反应完全后，冷却，水洗，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用饱和氯化钠溶液洗涤有机相后蒸出有机相得到1-苄基-3-羰基-4-哌啶甲酸乙酯；
（4）在反应瓶中加入甲脒盐酸盐、甲醇和氢化钾，搅拌混合均匀后加入1-苄基-3-羰基-4-哌啶甲酸乙酯，氮气保护，TLC监控原料反应完全，加入乙酸溶液，减压蒸出溶剂甲醇，加水后用二氯甲烷萃取，再用饱和氯化钠溶液洗涤有机相，蒸出有机相得到7-苄基-4-羰基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶；
（5）在反应瓶中，把7-苄基-4-羰基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶加入到三氯氧磷中，加热回流反应至TLC监控原料反应完全，减压蒸出三氯氧磷，往浓缩物中加入饱和碳酸氢钠溶液，用二氯甲烷萃取反应液，合并有机相，旋干后粗产品经柱层析分离提纯得到7-苄基-4-氯-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶；
（6）在高压釜中加入7-苄基-4-氯-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶、三苯基膦、醋酸铅、二茂铁和三乙胺，以乙醇作为溶剂，通入CO使高压釜内压力达到1MPa，加热至100℃，TLC监控原料反应完全后过滤反应液，滤液蒸出溶剂乙醇，再经柱层析色谱分离提纯得到7-苄基-4-乙基甲酸酯基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶。
3. 一种权利要求1所述的具有生物活性的5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶化合物的制备方法，其特征在于7-苄基-4-乙胺甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶的合成包括以下步骤：
（1）在反应瓶中，将依据权利要求2的制备方法合成的7-苄基-4-乙基甲酸酯基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶和硼氢化钠加入到甲醇中，室温反应直至TLC监控原料反应完全，加水后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，旋干后粗产品经柱层析分离提纯得到7-苄基-4-羟甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶；
（2）在反应瓶中，把7-苄基-4-羟甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶和三乙醇胺加入到二氯甲烷中，反应温度设定为-10℃，滴加甲基磺酰氯溶液，滴加完后反应温度升至20℃，反应直至TLC监控原料反应完全，加水后用二氯甲烷萃取反应液，分出有机相，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤后，旋干有机相得到7-苄基-4-甲磺酰甲酯基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶；
（3）在反应瓶中，将7-苄基-4-甲磺酰甲酯基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶加入到乙腈中，再加入碘化钠和无水碳酸钾，室温反应1h后加入氨基乙烷，TLC监控原料反应完全，加水后用乙酸乙酯萃取反应液，合并有机相，旋干有机相后经柱层析分离提纯得到7-苄基-4-乙胺甲基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶。
4. 一种权利要求1所述的具有生物活性的5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶化合物的制备方法，其特征在于7-苄基-4-酰基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶和4-酰基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶的合成包括以下步骤：
（1）在反应瓶中，将依据权利要求2的制备方法合成的7-苄基-4-乙基甲酸酯基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶加入到甲醇中，再加入氢氧化钠溶液，加热至回流，反应结束后，冷却至室温，用盐酸溶液调节溶液pH为3-4，加水后用二氯甲烷萃取反应液，蒸出有机相得到7-苄基-4-羧基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶；
（2）在反应瓶中加入7-苄基-4-羧基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶、胺基化合物和混合催化剂2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯与三乙胺或O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸与三乙胺，以二氯甲烷作为溶剂，在室温下反应直至TLC监控原料反应完全，加水后用二氯甲烷萃取，有机相分出后旋干，粗品经柱层析分离提纯得到7-苄基-4-酰基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶化合物；
（3）在反应瓶中加入7-苄基-4-酰基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶化合物和甲酸铵，以钯碳作为催化剂，以甲醇作为溶剂，室温反应直至TLC监控原料反应完全，加水后用氯仿萃取，合并有机相旋干后经柱层析分离提纯得到4-酰基-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶化合物。
5. 根据权利要求4所述的具有生物活性的5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶化合物的制备方法，其特征在于所述的胺基化合物为盐酸二甲胺、盐酸甲胺、吡啶-3-甲胺、哌啶或苯胺。
6. 权利要求1所述的具有生物活性的5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶化合物在制备抗乳腺肿瘤药物中的应用。
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| GR01 | Patent grant | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Mao Longfei Inventor after: Xu Guiqing Inventor after: Li Wei Inventor after: Jiang Yuqin Inventor after: Dong Wenpei Inventor after: Jiang Tao Inventor after: Shen Jiaxuan Inventor after: Wang Zhihui Inventor after: Qi Shangwen Inventor before: Mao Longfei Inventor before: Xu Guiqing Inventor before: Li Wei Inventor before: Jiang Yuqin Inventor before: Dong Wenpei Inventor before: Jiang Tao Inventor before: Shen Jiaxuan |
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| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20180511 Address after: 450000 Henan Zhengzhou high tech Industrial Development Zone, 100 Cui Zhu street, Zhengzhou University, science and Technology Park, 210. Patentee after: Zhengzhou Zhengying Biological Technology Co., Ltd. Address before: No. 46, Makino District, Makino District, Xinxiang, Henan Patentee before: Henan Normal University |