CN104878103B - Fam57b基因及其表达产物作为胆管癌诊治的靶标 - Google Patents

Fam57b基因及其表达产物作为胆管癌诊治的靶标 Download PDF

Info

Publication number
CN104878103B
CN104878103B CN201510290995.4A CN201510290995A CN104878103B CN 104878103 B CN104878103 B CN 104878103B CN 201510290995 A CN201510290995 A CN 201510290995A CN 104878103 B CN104878103 B CN 104878103B
Authority
CN
China
Prior art keywords
fam57b
cholangiocarcinoma
genes
gene
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201510290995.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104878103A (zh
Inventor
杨承刚
果春青
宋宏涛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qingdao Yangshen Biomedical Co Ltd
Original Assignee
Beijing Medintell Bioinformatic Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Medintell Bioinformatic Technology Co Ltd filed Critical Beijing Medintell Bioinformatic Technology Co Ltd
Priority to CN201510290995.4A priority Critical patent/CN104878103B/zh
Publication of CN104878103A publication Critical patent/CN104878103A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104878103B publication Critical patent/CN104878103B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了FAM57B在胆管癌诊断和治疗中的作用，属于基因新用途技术领域。经实验证明，与正常胆管组织相比，胆管癌组织中的FAM57B基因表达上调，表明可以通过检测胆管组织中FAM57B表达量来诊断受试者是否患有胆管癌。本发明通过体外MTT实验发现，FAM57B基因表达有利于人胆管癌细胞株的生长。因此，FAM57B能用于制备抗胆管癌药物，具有良好的开发应用前景。

Description

FAM57B基因及其表达产物作为胆管癌诊治的靶标
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及人FAM57B基因在胆管癌诊断、治疗中的用途。
背景技术
胆管癌恶性程度高，预后极差。手术是胆管癌的有效治疗手段，但术后5年生存率不高。胆管癌约占胃肠道恶性肿瘤的3％，在全球范围内发生率呈逐年上升趋势。胆管癌发病的平均年龄约为50岁，男性发病率约为女性的1.5倍。早期预防、早期发现、早期治疗是提高人胆管癌手术根治率和5年生存率的关键。
胆管癌的诊断依赖于临床表现、实验室检查和影像学检查的结合，最终确诊以病理学或细胞学为“金标准”。但当患者出现临床症状，或影像学检查发现肿瘤时，患者大多已是进展期肿瘤，手术切除率和根治率低，目前针对人胆管癌，仍然缺乏一种特异的和敏感的诊断方法。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于胆管癌早期诊断的分子标志物。相比传统的胆管癌的诊断方法，使用基因标志物来诊断胆管癌的具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在癌症早期就能知晓癌症风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种人FAM57B基因及其表达产物在制备诊断胆管癌的产品中的应用。
进一步，上面所提到的诊断产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测FAM57B基因及其表达产物的表达水平以诊断胆管癌的产品。
进一步，所述用RT-PCR诊断胆管癌的产品至少包括一对特异扩增FAM57B基因的引物；所述用实时定量PCR诊断胆管癌的产品至少包括一对特异扩增FAM57B基因的引物；所述用免疫检测诊断胆管癌的产品包括：与FAM57B蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断胆管癌的产品包括：与FAM57B基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断胆管癌的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与FAM57B蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与FAM57B基因的核酸序列杂交的探针。
优选地，所述产品包括芯片、试剂盒。
本发明还提供了人FAM57B基因在高通量测序平台中的应用。随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知人FAM57B基因的异常与胆管癌相关也属于人FAM57B基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了人FAM57B基因及其表达产物在制备治疗胆管癌的药物中的应用。
一方面，本发明所述的“治疗胆管癌的药物”包括能够括抑制胆管癌细胞生长、促进胆管癌细胞凋亡、抑制胆管癌细胞粘附、抑制胆管癌细胞迁移和侵袭。
另一方面，本发明所述的“治疗胆管癌的药物”的主要活性成分包括抑制FAM57B基因表达的物质、抑制FAM57B基因表达产物稳定性的物质、和/或抑制FAM57B基因表达产物活性的物质。
进一步，本发明所述的治疗胆管癌的药物包括：通过干扰RNA抑制FAM57B基因表达的双链核糖核酸，或基于FAM57B抗原蛋白的肿瘤疫苗、或用于抑制FAM57B蛋白活性的蛋白质。
本发明还提供了一种用于治疗胆管癌的药物组合物，所述药物组合物包含FAM57B基因和/或其表达产物抑制剂。所述抑制剂包括抑制FAM57B基因表达的物质、抑制FAM57B基因表达产物稳定性的物质、和/或抑制FAM57B基因表达产物活性的物质。
进一步，本发明所述抑制剂包括：通过干扰RNA抑制FAM57B基因表达的双链核糖核酸，或基于FAM57B抗原蛋白的肿瘤疫苗、或用于抑制FAM57B蛋白活性的蛋白质。
本发明还提供了上述FAM57B基因和/或其表达产物抑制剂在制备治疗胆管癌药物中的应用。
在本发明中，所述RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。以细胞为基础的RNAi筛选在功能基因学研究方面具有许多优势，主要表现在大多数细胞类型都能使用RNAi方法，并且相对较容易下调或沉默任何目的基因的表达。
为了确保FAM57B基因能够被高效剔除或沉默，根据FAM57B基因的mRNA序列设计了siRNA特异性片段。siRNA的设计根据已发表的通用设计原则(Elbashir et.al 2001，Schwarz et.al 2003，Khvorova et.al 2003，Reynolds et.al 2004，Hsieh et.al 2004，Ui-Tei et.al 2004)，通过在线工具完成设计，该在线工具为：siRNASelectionProgram ofWhitehead Institute(BingbingYuan et.al 2004，http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/)和BLOCK-iTTM RNAi Designer ofINVITROGEN(winner of the 2004Frost&Sullivan Excellence in Research Award，https://rnaidesigner.invitrogen.com/sirna/)。为了进一步提高siRNA片断的有效性，综合两个在线设计工具的优点来设计用于筛选的siRNA片断。最后，通过同源性比对(NCBI BLAST)来过滤siRNA序列，以提高siRNA片断的特异性并减少RNAi干扰的脱靶效应。
本发明的药物还包括药学上可接受的载体，载体，这类载体包括(但并不限于)：稀释剂、赋形剂如水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇等。
本发明的药物还可与其他治疗胆管癌的药物联用，多种药物联合使用可以大大提到治疗的成功率。
本发明还提供了一种诊断胆管癌的产品，所述产品包括但不限于芯片、试剂盒。
其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测FAM57B基因转录水平的针对FAM57B基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的FAM57B蛋白的特异性抗体。所述基因芯片可用于检测包括人FAM57B基因在内的多个基因(例如，与胆管癌相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括人FAM57B蛋白在内的多个蛋白质(例如与胆管癌相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与胆管癌的标志物同时检测，可大大提高胆管癌诊断的准确率。
其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测FAM57B基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括FAM57B蛋白的特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测FAM57B基因表达水平过程中所需的试剂。优选度，所述试剂包括针对FAM57B基因的引物和/或探针。根据SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测FAM57B基因表达水平的引物和探针。
与FAM57B基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
进一步，所述FAM57B蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述FAM57B蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与FAM57B蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。
在本发明的上下文中，“FAM57B基因”包括人FAM57B基因以及人FAM57B基因的任何功能等同物的多核苷酸。FAM57B基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中FAM57B基因(NC_000016.10)DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
优选地，FAM57B基因的编码序列包括以下任一一种DNA分子：
(1)序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列；
(2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
(3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有70％、优选地，90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。
在本发明的具体实施方案中，所述FAM57B基因的编码序列是SEQ ID NO.1所示的DNA序列。
在本发明的上下文中，FAM57B基因表达产物包括人FAM57B蛋白以及人FAM57B蛋白的部分肽。所述FAM57B蛋白的部分肽含有与胆管癌相关的功能域。
“FAM57B蛋白”包括人FAM57B蛋白以及人FAM57B蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括人FAM57B蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与人FAM57B的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。
优选地，FAM57B蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：
(1)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。
(3)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(又称为序列同一性)，更优选地，与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少约90％至95％的同源性，常为96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。
在本发明的具体实施方案中，所述FAM57B蛋白是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。
通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。
通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是FAM57B蛋白的融合蛋白。对于与FAM57B蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留FAM57B蛋白的生物学活性即可。
本发明的FAM57B蛋白也包括对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留FAM57B蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。
在本发明的上下文中，“诊断胆管癌”既包括判断受试者是否已经患有胆管癌、也包括判断受试者是否存在患有胆管癌的风险。
在本发明的上下文中，“治疗胆管癌”从疾病的状态变化来分，可以包括疾病的缓解、疾病的完全治愈；从药物发挥的作用不同，可以包括抑制细胞生长、促进细胞凋亡、抑制细胞粘附、抑制细胞迁移和侵袭。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了FAM57B基因表达与胆管癌相关，通过检测受试者胆管黏膜中FAM57B的表达，可以判断受试者是否患有胆管癌、或者判断受试者是否存在患有胆管癌的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。
本发明发现了一种新的分子标记物-FAM57B基因，相比传统的检测手段，基因诊断更及时、更特异、更灵敏，能够实现胆管癌的早期诊断，从而降低胆管癌的死亡率。
附图说明
图1显示利用QPCR检测FAM57B基因在胆管癌组织中的表达情况；
图2显示利用QPCR检测siRNA对FAM57B基因表达的影响；
图3显示利用MTT检测FAM57B基因表达对胆管癌细胞生长的影响。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1筛选与胆管癌相关的基因标志物
1.1样品收集
各收集10例正常胆管组织和胆管癌组织样本。上述样本为胆管癌患者的手术切除标本，上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。
1.2RNA样品的制备及质量分析
1.2.1RNA样品的制备
使用QIAGEN公司的组织RNA提取试剂盒提前总RNA。具体步骤如下：
1)在较少RNase干扰的清洁区，使用含适量液氮的研钵称取离体肝癌组织样本约20mg，用杵棒研磨至粉末状；
2)将样本转移到一个不含RNA酶的2mL的离心管中；
3)加入300μl Lysis solution，置于匀浆器内，充分研磨1-5min；
4)12000g，4℃，离心10min，转移上清至新的1.5mL的离心管中；
5)加入600μl RNase-Free Water，用漩涡器混匀；
6)加入20μl蛋白酶K，在55℃温浴15min，不断涡旋混匀；
7)14000g，室温，离心1min，使细胞碎片沉淀于离心管底部，取上清转移到另外一个不含RNA酶1.5mL的离心管中；
8)加入450μl的95％乙醇，涡旋混匀；
RNA吸附：
9)取650μl含乙醇的裂解液加到离心柱中，14000g离心1min；
10)弃下层，重置收集管于柱上；
11)依照裂解液的容量，重复9)～10)步；
12)加入400μl Wash solution，14000g离心2min；
13)弃下层，将柱置于一新的收集管上；
DNase处理：
14)加入100μl Enzyme Incubation Buffer和15μl DNase I，14000g离心1min；
15)将收集管中的溶液重新移入柱中；
16)室温放置15min；
RNA洗涤：
17)加入400μl Wash solution，14000g离心1min，弃下层，重置收集管于柱上；
18)加入400μl Wash solution，14000g离心2min，弃收集管；
RNA洗脱：
19)把柱子放入1.7mL Elution管中；
20)加入30μl Elution Buffer
21)200g离心2min，使溶液充分与柱结合，然后14000g离心1min；
22)将RNA使用无RNA去离子水溶解，待用。
1.2.2 RNA样品的质量分析(NanoDrop1000分光光度计)
NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。
1.2.3 RNA样品的质量分析(Agilent Technologies 2100Bioanalyzer)
将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，Agilent Technologies2100Bioanalyzer检测RNA样品质量，观察28S rRNA和18S rRNA主带明显、无降解、RNA完整性指数合格、浓度达到要求的符合RNA-seq测序cDNA文库构建的要求，可以用于文库构建及测序。
1.3高通量转录组测序
1.3.1 RNA-seq读段定位
首先将低质量的读段去除得到清洁读段，然后利用TopHat v1.3.1将清洁片段与UCSC H.sapiens参考基因组(hg19)进行匹配，H.sapiens UCSC hg19版的预先构建的索引从TopHat主页下载，并作为参考基因组，利用TopHat与基因组匹配时，允许每个读段(默认到20)有多个匹配位点，最多2次错配。TopHat根据外显子区域和GT-AG剪切信号建立可能的剪切位点库，根据这些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我们使用TopHat方法的系统默认参数。
1.3.2转录丰度评估
匹配上的读段文件通过Cufflinks v1.0.3处理，Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中匹配到特定基因1kb长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算FPKM估计值的置信区间。Cufflinks使用的参考的GTF注释文件从Ensembl数据库下载(Homo_sapiens.GRCh37.63.gtf)。
1.3.3差异表达基因的检测
将下载的Ensembl GTF文件和通过TopHat匹配的原始文件传输到Cuffdiff，Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度，检测差异表达。在Cuffidff输出中只有q值＜0.01，测试显示成功的比较才被认为是差异表达。
1.4结果
RNA-seq结果显示，FAM57B基因在胆管癌组织中的表达量显著高于正常的胆管组织。
实施例2QPCR测序验证FAM57B基因的差异表达
1、根据高通量测序的检测结果选择FAM57B基因进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择胆管癌组织和正常胆管组织各90例。
2、RNA提取步骤同实施例1。
3、逆转录：使用TAKARA公司的反转录试剂盒进行操作。具体步骤如下：
(1)取总RNA 2μg进行逆转录，加入Oligo(dT)2μl，充分混匀。70℃水浴5分钟后立即冰浴2-3分钟。
(2)构建25μl反应体系，其中包括5×逆转录缓冲液5μl，dNTP(2.5mM)5μl，RNasin40U/μl，M-MLV 200U/μl，补无核酶水至预期体积。
(3)42℃水浴60分钟后，95℃水浴5分钟以灭活M-MLV。
(4)-20℃储存备用。
4、QPCR扩增
(1)引物设计
根据Genbank中FAM57B基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：
FAM57B基因：
正向引物为5’-ATCATTGATGACCAACACT-3’(SEQ ID NO.3)；
反向引物为5’-GCGTAGATGTCGTAGATG-3’(SEQ ID NO.4)。
GAPDH基因：
正向引物为5’-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’(SEQ ID NO.5)；
反向引物为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.6)。
(2)按照表1配制PCR反应体系：
其中，SYBR Green聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。
表1PCR反应体系
试剂 体积
正向引物 1μl
反向引物 1μl
SYBR Green聚合酶链式反应体系 12.5μl
模板 2μl
去离子水 补足25μl
(3)PCR反应条件：95℃10min，(95℃15s，60℃60s)*45个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。
5、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
6、结果
结果如图1所示，与正常胆管组织相比，FAM57B基因在胆管癌组织中的表达上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同RNA-sep结果一致。
实施例3抑制FAM57B基因表达
1、细胞培养：人胆管癌细胞株QBC939，以含10％小牛血清的DMEM(高糖)培养基在37℃、5％CO2、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％胰蛋白酶常规消化传代。
2、siRNA设计
针对FAM57B的siRNA序列：
siRNA1-FAM57B：
正义链为5’-UUGAACUUCUGGAAAUGUCUU-3’(SEQ ID NO.7)；
反义链为5’-GACAUUUCCAGAAGUUCAAGC-3’(SEQ ID NO.8)，
siRNA2-FAM57B：
正义链为5’-UAUUAGCGGUCUGUAAAGCAC-3’(SEQ ID NO.9)；
反义链为5’-GCUUUACAGACCGCUAAUAAA-3’(SEQ ID NO.10)，
siRNA3-FAM57B：
正义链为5’-AAUAAAUAAAAUAAAUAAGAU-3’(SEQ ID NO.11)；
反义链为5’-CUUAUUUAUUUUAUUUAUUUA-3’(SEQ ID NO.12)
阴性对照siRNA序列(siRNA-NC)：
正义链为5’-AUAAAAUAAAUAAGAUUCCUC-3’(SEQ ID NO.13)；
反义链为5’-GGAAUCUUAUUUAUUUUAUUU-3’(SEQ ID NO.14)。
将细胞按1×104/孔接种到24孔细胞培养板中，在37℃、5％CO2培养箱中细胞培养24h，在无双抗、含10％FBS的DMEM培养基中，转染按照脂质体转染试剂2000(购自于Invitrogen公司)的说明书转染，实验分为阴性对照组(siRNA-NC)和实验组(20nM)(siRNA1-FAM57B、siRNA2-FAM57B、siRNA3-FAM57B)，其中阴性对照组siRNA与FAM57B基因的序列无同源性，浓度为20nM/孔。同时分别转染。
3、QPCR检测FAM57B基因的转录水平
3.1细胞总RNA的提取
采用TRIzol Reagent(Invitrogen Cat.No.15596-018)总RNA提取试剂，按说明书提供方法提取QBC939细胞的总RNA。具体方法为：取细胞，用浓度为0.01M的PBS冲洗3次，加入适量TRIzol试剂，室温放置5min裂解细胞，吹打均匀后以1mL/管分装至1.5mL Eppendorf管中。每管加入0.2mL氯仿，剧烈震荡15s，室温放置2-3min，4℃、12000r/min离心15min，将上层水相移至干净Eppendorf管中，加入0.5mL异丙醇，轻轻混匀，室温放置10min，4℃、7500r/min离心10min。弃上清，75％乙醇洗涤RNA沉淀，7500r/min离心5min，室温干燥RNA沉淀，5-10min后溶于适量DEPC水。质量分数为1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA样本的完整性，应用Bio-Photometer对提取的RNA进行定量测定。
3.2逆转录步骤同实施例2。
3.3 QPCR扩增步骤同实施例2。
4、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，干扰FAM57B基因表达组与对照组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
5、结果
结果如图2显示，相比siRNA2-FAM57B、siRNA3-FAM57B，siRNA1-FAM57B能够更有效抑制FAM57B基因的表达，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例4FAM57B基因对胆管癌细胞增殖的影响
采用MTT实验检测FAM57B基因对胆管癌细胞增殖能力影响。
1、细胞培养与转染步骤同实施例3。
2、步骤：各组细胞转染12h后胰酶消化，制成单细胞悬液，以每孔6000个细胞接种于96孔培养板中，每组分7个时间点，每个时间点设6个复孔。细胞贴壁后，进行第1次检测：每孔加入5g/L的MTT液20μl，继续培养4h后，吸去培养基，加入DMSO 150μl，细心吹打，使紫蓝色沉淀充分溶解，用酶标仪在490nm波长测吸光度值(A值)。然后每12h检测1次，连续测72h，共7次。本实验重复3次。
3、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
4、结果
图3所示的结果显示：siRNA1-FAM57B组的细胞生长速度明显低于转染siRNA-NC组的细胞生长速度，差异具有统计学意义(P<0.05)。上述结果表明FAM57B表达有利于胆管癌细胞的生长，通过抑制FAM57B基因的表达可以抑制胆管癌细胞的生长。
实施例5FAM57B基因对胆管癌细胞对细胞凋亡的影响
使用流式细胞仪检测FAM57B基因对细胞凋亡的影响。
1、细胞培养步骤同实施例3。
2、细胞转染步骤同实施例3。
3、步骤
细胞转染72h后，使用预冷PBS洗涤细胞，然后用0.25％胰酶消化细胞，中止消化，将离心收集的细胞使用PBS重悬，将细胞定量为1×106个/ml，取200μL上述细胞悬液放置到Appendorf管中，加入10μL Annexin-V-FITC混匀，室温暗处孵育染色15min，上机前5min加入10mg/L碘化丙锭(PI)染色5μL。未转染siRNA的细胞分别用Annexin-V-FITC和PI染色用于标准定量。用FACS流式细胞仪进行双色荧光细胞流式计数，观察凋亡细胞百分比。
3、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用的t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
4、结果：
转染siRNA1-FAM57B组的细胞凋亡率为(44.02+1.87)％，转染siRNA-NC组的细胞凋亡率为(6.95+0.18)％，上述差异具有统计学意义(P<0.05)，上述结果表明，FAM57B表达有利于胆管癌细胞存活，通过抑制FAM57B基因的表达可以促进胆管癌细胞的凋亡。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (4)

1.人FAM57B基因及其表达产物在制备诊断胆管癌的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测FAM57B基因或其表达产物的表达水平以诊断胆管癌的产品。
3.FAM57B基因和/或其表达产物抑制剂在制备治疗胆管癌药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述抑制剂是针对FAM57B的siRNA。
CN201510290995.4A 2015-06-01 2015-06-01 Fam57b基因及其表达产物作为胆管癌诊治的靶标 Active CN104878103B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510290995.4A CN104878103B (zh) 2015-06-01 2015-06-01 Fam57b基因及其表达产物作为胆管癌诊治的靶标

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510290995.4A CN104878103B (zh) 2015-06-01 2015-06-01 Fam57b基因及其表达产物作为胆管癌诊治的靶标

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104878103A CN104878103A (zh) 2015-09-02
CN104878103B true CN104878103B (zh) 2018-08-24

Family

ID=53945776

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510290995.4A Active CN104878103B (zh) 2015-06-01 2015-06-01 Fam57b基因及其表达产物作为胆管癌诊治的靶标

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104878103B (zh)

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1177048C (zh) * 2001-09-12 2004-11-24 上海新世界基因技术开发有限公司 编码具有抑制癌细胞生长功能的人蛋白的多核苷酸

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Fam57b (Family with Sequence Similarity 57, Member B), a Novel Peroxisome Proliferator-activated Receptor γ Target Gene That Regulates Adipogenesis through Ceramide Synthesis;Yzumi Yamashita-Sugahara等;《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》;The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.;20130215;第288卷(第7期);4522-4537 *
人胆汁中潜在的胆管癌肿瘤标志物的筛选及相关蛋白的功能研究;沈健;《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20130115(第1期);E072-64 *
基于RNA-seq技术的直肠癌肝转移预警基因的研究;林国生;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20150215(第2期);E072-508 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN104878103A (zh) 2015-09-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108949992B (zh) 一种与食管鳞癌及其分级相关的生物标志物
CN104962658B (zh) Myoz1基因及其表达产物在帕金森病诊治中的应用
CN109468382B (zh) lncRNA在肺腺癌诊疗中的应用
CN108531596A (zh) 一种lncRNA作为生物标志物在胃癌诊治中的应用
CN106967719B (zh) 一种长链非编码rna作为前列腺癌分子标志物的应用
CN106636443B (zh) Dnah14基因在制备肿瘤诊治产品中的应用
WO2020157070A1 (en) Novel biomarkers and diagnostic profiles for prostate cancer
KR20110015013A (ko) 결장직장암의 평가 방법 및 여기에 사용하기 위한 조성물
CN107519193A (zh) 食管鳞癌早期分子诊断标志物及其应用
CN105886625B (zh) Chka基因在制备食管癌诊治产品中的应用
CA3067527A1 (en) Mmp1 gene transcript for use as marker for diagnosis of ovarian cancer prognosis, and test method
CN105385754B (zh) 一种与胆管癌相关的分子标记物
CN104878103B (zh) Fam57b基因及其表达产物作为胆管癌诊治的靶标
CN105385779B (zh) 与直肠腺癌相关的基因标记物
CN104894259A (zh) Tex19基因在胆管癌诊断和治疗中的应用
CN105838797B (zh) 一种诊治食管癌的分子标志物
CN112029864B (zh) 一种乳腺癌miRNA检测试剂盒及其应用
CN111534587B (zh) 分子标志物5-tRF-His、乳腺癌检测试剂盒及其应用
CN105755154A (zh) 区分转移性与非转移性肺鳞癌的分子标志物
CN105803068A (zh) 一种诊治肺腺癌的分子标记物
CN107184983B (zh) 一种肺腺癌的诊治靶标
CN104789689A (zh) 作为肺腺癌诊治靶标的clec9a基因
CN109371136A (zh) 一种与肺腺癌相关的lncRNA及其应用
EP2083087B1 (en) Method for determining tongue cancer
CN105112554B (zh) Clec1b基因在胆管癌诊断和治疗中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
EXSB Decision made by sipo to initiate substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right

Denomination of invention: FAM57B gene and expressed product thereof serving as target for diagnosis and treatment of bile duct cancer

Effective date of registration: 20181225

Granted publication date: 20180824

Pledgee: Huaxia Bank Beijing branch Wanliu Limited by Share Ltd

Pledgor: Beijing Yang Shen biology information technology company limited

Registration number: 2018990001252

PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right
PC01 Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right

Date of cancellation: 20191206

Granted publication date: 20180824

Pledgee: Huaxia Bank Beijing branch Wanliu Limited by Share Ltd

Pledgor: Beijing Yang Shen biology information technology company limited

Registration number: 2018990001252

PC01 Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20210401

Address after: 266000 room 2503, Qianshan building, D2, Qingdao International Innovation Park Phase II, No.1 Keyuan Weiyi Road, Laoshan District, Qingdao City, Shandong Province

Patentee after: Qingdao Yangshen biomedical Co.,Ltd.

Address before: 100080 3103, fangting building, No.1 Shanyuan street, Haidian District, Beijing

Patentee before: BEIJING MEDINTELL BIOMED INFORMATION TECHNOLOGY Co.,Ltd.

TR01 Transfer of patent right