CN104862337B - 聚阴离子聚合物/磷酸钙纳米基因递送系统及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种聚阴离子聚合物/磷酸钙纳米基因递送系统以及其制备方法，该系统包括磷酸钙及交联透明质酸，其中磷酸钙包裹基因形成内核，巯基化透明质酸包覆于磷酸钙内核表面，透明质酸上面接枝的巯基至少部分氧化形成二硫键，从而形成交联透明质酸外壳包覆于内核表面，使磷酸钙纳米粒粒径变小、稳定性提高，该纳米粒子的粒径为100~200nm。本发明的聚阴离子聚合物包裹磷酸钙纳米基因递送系统生产过程简单、绿色，经济成本低，提高了磷酸钙纳米粒的稳定性和安全性，体内外毒性低。纳米粒外壳的二硫键在体内还原性条件下断裂，促使基因释放出来；纳米粒表面的透明质酸提高了该纳米粒的主动靶向性，提高了细胞摄取和转染效率，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及药物制剂领域和基因药物载体给药领域，尤其涉及聚阴离子聚合物包裹磷酸钙纳米粒制备的基因给药载体的方法，即聚阴离子聚合物/磷酸钙纳米基因递送系统的制备方法。
背景技术
在当今社会中，基因治疗已经发展成为治疗各种癌症的新的治疗方法。在当今社会中，基因治疗已经发展成为治疗各种癌症的新的治疗方法。而siRNA作为生物药物对癌症治疗也有着很大的潜力。但是由于裸露的siRNA分子的半衰期短、不稳定性、很快被RES系统清除易脱靶以及通过细胞膜的能力弱等特性，需要开发有效的能方便使用的给药载体系统。给药载体包括病毒载体和非病毒载体。病毒载体虽然转染效率高，但是有着潜在的免疫原性以及价格比较贵。非病毒载体主要有脂质体、多聚阳离子聚合物、阳离子脂质纳米粒。尽管阳离子载体也有着很好的转染效率，但是同时也带来一些问题，比如本身的毒性、血液毒性、纳米粒在血浆中聚集、在细胞内siRNA不易从载体中释放出来发挥作用，,因此发展高效、多功能、低毒的siRNA载体是实现siRNA治疗的重要问题。一个合适理想的siRNA传递系统需要有以下几种特点：（1）载体系统应具有生物相容性、生物可降解性以及无免疫原性。（2）载体系统应可以保护siRNA不被核酸酶降解以及在体内不被清除（3）载体系统可以提高靶向性以及有着高的转染效率（4）当进入到靶细胞后，载体系统可以促进溶酶体逃逸，使siRNA尽快释放到细胞质中发挥沉默效率。因此安全性、稳定性、较高的转然效率以及靶向性是基因治疗的关键。
磷酸钙具有良好的生物相容性和生物可降解性，因此磷酸钙纳米粒在生物医药领域有着非常广泛的应用。磷酸钙作为药物载体，磷酸钙纳米粒有着很多的优势。磷酸钙具有酸敏感性，在酸性内涵体或溶酶体酸性环境中，磷酸钙溶解，使得细胞内钙离子浓度明显增加，细胞内渗透压增加，促使纳米粒释放药物到细胞质中。但是，这样的传递系统一个缺点是在纳米粒制备后，磷酸钙晶体会快速增长容易沉淀，导致转染效率降低。因此制备纳米级的粒径合适以及稳定性良好的磷酸钙纳米粒具有非常重要的意义。Kataoka等用磷酸钙、基因以及PEG嵌段聚阴离子聚合物制备了一系列的纳米粒。中国专利申请（201310008569.8）授权了“聚阳离子脂质体/磷酸钙纳米粒给药载体的制备方法”。但是以上这些磷酸钙纳米粒都是通过EPR效应实现肿瘤的被动靶向。
于是我们尝试开发一种聚阴离子聚合物包裹磷酸钙纳米基因递送系统，该载体具有制备简单、方便、经济成本低并且具有二硫键敏感以及主动靶向的功能，具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于开发一种聚阴离子聚合物包裹磷酸钙纳米基因递送系统，提高基因的释放、溶酶体逃逸功能以及靶向性，促进基因治疗的发展。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种聚阴离子聚合物/磷酸钙纳米基因递送系统，包括磷酸钙及交联透明质酸，其特征在于，磷酸钙包裹基因形成内核，巯基化透明质酸包覆于磷酸钙内核表面，透明质酸上面接枝的巯基至少部分氧化，例如在空气中静置，被空气氧化形成二硫键，从而形成交联透明质酸外壳包覆于内核表面，使磷酸钙纳米粒粒径变小、稳定性提高。其中所述透明质酸的分子量为10-150万，巯基取代度为20-90%，该纳米粒子的粒径为100~200nm。
优选地，所述巯基化透明质酸的分子量为30-70万，巯基取代度为30-60%。
聚阴离子聚合物/磷酸钙纳米粒给药载体采用的技术方案是：
1）制备试剂A：CaCl2、缓冲盐溶液、基因；
2）制备试剂B：巯基化的透明质酸（HA-SH），磷酸氢二钠、氯化钠、缓冲盐水溶液；
3）将试剂A与试剂B混合；
4）所得纳米制剂静置一段时间，优选静置过夜；
其特征在于，
在所述试剂A中，缓冲盐溶液为缓冲盐为Hepes、Tris的一种或两种任意比例的组合；
在所述试剂B中，透明质酸的分子量为10-150万；巯基取代度为20-90%；缓冲盐为Hepes、Tris的一种或两种任意比例的组合。
优选地，试剂A中缓冲盐为Tris缓冲盐；试剂B中透明质酸分子量在30~70万，巯基取代度在30~60%；缓冲盐为Hepes缓冲盐。
优选地，基因与试剂A混合时的基因质量（μg）与试剂A的比例为60~100μg/mL。
作为优选方案，在所述试剂A中的氯化钙的浓度为100~300mM，Tris缓冲盐浓度为10~30mM，pH为7.0~8.0；在所述试剂B中，巯基化透明质酸浓度为40~3000μg/ml，优选为2mg/ml，磷酸盐的浓度为100~300mM，NaCl浓度为100~300mM，Hepes缓冲盐的浓度为20~50mM，pH为7.0~8.0。
进一步优选地，所述试剂B中巯基化透明质酸浓度为600~2000μg /ml。
作为优选方案，在所述试剂A中，基因与CaCl2溶液混合再与Tris缓冲液混合或基因与CaCl2溶液和Tris缓冲液的混合溶液混合。
进一步优选地，在所述试剂A中，将CaCl2溶液与基因溶液混合，再将缓冲溶液滴加到上述混合溶液中。
另一方面，本发明提供的聚阴离子聚合物/磷酸钙纳米基因递送系统用于体内外细胞的基因转染以及人或动物体内基因药物输送的用途，其中所述基因是DNA、siRNA、miRNA中的任一或多种。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
本发明提供了一种新型基因给药载体，将聚阴离子聚合物和磷酸钙纳米粒杂化结合，通过对磷酸钙纳米粒处方和制备工艺的改进，提高了磷酸钙纳米粒的稳定性，生产过程简单、绿色，经济成本低；提高了磷酸钙纳米粒的稳定性和安全性，体内外毒性低。纳米粒外壳的二硫键在体内还原性条件下断裂，促使基因释放出来；纳米粒表面的透明质酸提高了该纳米粒的主动靶向性，提高了细胞摄取和转染效率，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1：本发明的聚阴离子聚合物/磷酸钙纳米基因递送系统的透射电镜照片；
图2：本发明的聚阴离子聚合物/磷酸钙纳米基因递送系统的胶体稳定性结果；
图3：本发明的聚阴离子聚合物/磷酸钙纳米基因递送系统的血浆稳定性结果；
图4：本发明的聚阴离子聚合物/磷酸钙纳米基因递送系统的细胞毒性（MTT法）结果；
图5 ：流式细胞仪分析细胞摄取图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：一种聚阴离子聚合物/磷酸钙杂化纳米粒基因递送系统的制备
1）制备试剂A，Tris为10mM的水溶液，盐酸调节pH为7.4；CaCl2浓度为2.5mM的水溶液；
2）制备试剂B，含有巯基化的透明质酸的浓度为2mg/ml、Na2HPO4浓度为1.5mM、NaCl浓度为280mM、Hepes浓度为50mM的水溶液，NaOH调节pH为7.4；
3）取80μg基因siRNA与CaCl2溶液等体积混合后，将Tris缓冲液以5：1的比例滴加到基因与氯化钙混合溶液中；再与试剂B等体积快速混合均匀，即制备得到杂化纳米磷酸钙的基因转染载体。
实施例2：一种聚阴离子聚合物/磷酸钙杂化纳米粒基因递送系统的制备
1）制备试剂A，Tris为10mM的水溶液，盐酸调节pH为7.4；CaCl2浓度为2.5mM的水溶液；
2）制备试剂B，含有巯基化的透明质酸的浓度为1mg/ml、Na2HPO4浓度为1.5mM、NaCl浓度为280mM、Hepes浓度为50mM的水溶液，NaOH调节pH为7.4；
3）取80μg基因siRNA与CaCl2溶液等体积混合后，将Tris缓冲液以5：1的比例滴加到基因与氯化钙混合溶液中；再与试剂B等体积快速混合均匀，即制备得到杂化纳米磷酸钙的基因转染载体。
实施例3：一种聚阴离子聚合物/磷酸钙杂化纳米粒基因递送系统的制备
1）制备试剂A，Tris为10mM的水溶液，盐酸调节pH为7.4；CaCl2浓度为2.5mM的水溶液；
2）制备试剂B，含有巯基化的透明质酸的浓度为0.8mg/ml、Na2HPO4浓度为1.5mM、NaCl浓度为280mM、Hepes浓度为50mM的水溶液，NaOH调节pH为7.4；
3）取80μg基因siRNA与CaCl2溶液等体积混合后，将Tris缓冲液以5：1的比例滴加到基因与氯化钙混合溶液中；再与试剂B等体积快速混合均匀，及制备得到杂化纳米磷酸钙的基因转染载体。
实施例4：一种聚阴离子聚合物/磷酸钙杂化纳米粒基因递送系统的制备
1）制备试剂A，Tris为10mM的水溶液，盐酸调节pH为7.4；CaCl2浓度为2.5mM的水溶液；
2）制备试剂B，含有巯基化的透明质酸的浓度为0.6mg/ml、Na2HPO4浓度为1.5mM、NaCl浓度为280mM、Hepes浓度为50mM的水溶液，NaOH调节pH为7.4；
3）取80μg基因siRNA与CaCl2溶液等体积混合后，将Tris缓冲液以5：1的比例滴加到基因与氯化钙混合溶液中；再与试剂B等体积快速混合均匀，及制备得到杂化纳米磷酸钙的基因转染载体。
实施例5：一种聚阴离子聚合物/磷酸钙杂化纳米粒胶体稳定性考察
取新鲜制备的聚阴离子聚合物/磷酸钙杂化纳米粒溶液置于4℃孵育，按时间点纳米粒溶液样品，纳米激光粒度分析仪测量粒径，按下面公式分析纳米粒粒径随孵育时间的变化
相对粒径(%)=[粒径(t)-粒径(0)]/粒径(0)×100%
其中粒径(0)为0时间点粒径的大小，粒径(t)为孵育时间t后粒径的大小。
如附图2所示，纳米粒在三天内粒径比较稳定，变化不是很大，在纳米粒放置过夜后，粒径变小，这说明透明质酸上的巯基氧化自交联成二硫键，使粒径减小，使纳米粒更加稳定。
实施例6：一种聚阴离子聚合物/磷酸钙杂化纳米粒血浆稳定性考察
取新鲜制备的聚阴离子聚合物/磷酸钙杂化纳米粒溶液与胎牛血清（FBS）等体积混匀，置于37℃摇床孵育。按时间点取纳米粒与FBS混合液（v/v=1），纳米激光粒度分析仪测量粒径，按下面公式分析纳米粒粒径随孵育时间的变化：
。相对粒径(%)=[粒径(t)-粒径(0)]/粒径(0)×100%
其中粒径(0)为0时间点粒径的大小，粒径(t)为孵育时间t后粒径的大小。
如附图3所示，可以看出纳米粒在血浆中粒径的变化很小，几乎不变，说明纳米粒有着良好的血浆稳定性。
实施例7：MTT法测量本发明新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统的细胞毒性。
生长对数期HepG2细胞铺板于96孔板，生长24h后，细胞汇合度为70～80%。吸去培养液，载有siRNA的本发明聚阴离子聚合物/磷酸钙纳米基因递送系统按浓度梯度给药。24h后，加入MTT溶液(5mg/mL，pH 7.4 PBS)10μL，37℃，继续孵育4 h。弃去上清液，加入150μLDMSO溶解蓝紫色的甲瓒结晶，用酶联免疫测定仪于570nm测定吸光度。计算细胞生存率。
实验结果如附图4所示，在基因浓度10～1000 nM，细胞生存率都在100%，其中最低的细胞生存率也在80%以上，表明本发明聚阴离子聚合物/磷酸钙纳米基因递送系统的低毒性。
实施例8：流式细胞仪分析细胞摄取
生长对数期HepG2细胞铺板于96孔板，生长24h后，细胞汇合度为70～80%。吸去培养液，载有FAM-siRNA的本发明聚阴离子聚合物/磷酸钙纳米基因递送系统稀释至FAM-siRNA的浓度为100nM，与HepG2细胞共孵育不同的时间。移去培养液，PBS清洗两遍，胰酶消化，PBS清洗，吹散，35μm尼龙网过滤除去细胞团，得到单细胞悬液流式细胞仪上机。选取10000个细胞，用Cell Quest Pro软件统计分析细胞参数。
实验结果如附图5所示，表明单独的FAM-siRNA分子很难被摄取，但是本发明聚阴离子聚合物/磷酸钙纳米基因递送系统处理过的细胞表现出很好的细胞摄取能力，并且该摄取具有时间依赖性。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行变更以及修改。本发明的技术性范围并不局限于说明书的内容，须要根据权利要求范围来确定其技术范围。
上面结合附图对本发明的实施方式作了详细的说明，但是本发明不限于上述实施方式，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。
Claims (8)
1.一种聚阴离子聚合物/磷酸钙纳米基因递送系统，包括磷酸钙及交联透明质酸，其特征在于，磷酸钙包裹基因形成内核，巯基化透明质酸包覆于磷酸钙内核表面，透明质酸上面接枝的巯基至少部分氧化形成二硫键，从而形成交联透明质酸外壳包覆于内核表面，使磷酸钙纳米粒粒径变小、稳定性提高，其中所述透明质酸的分子量为30-70万，巯基取代度为30-60%，该纳米粒子的粒径为100~200nm。
2.一种制备聚阴离子聚合物/磷酸钙纳米基因递送系统的方法，包括以下步骤：
1）制备试剂A：CaCl2、缓冲盐溶液、基因；
2）制备试剂B：一定浓度的巯基化的透明质酸（HA-SH），磷酸氢二钠、氯化钠、缓冲盐水溶液；
3）将试剂A与试剂B混合；
4）所得制剂静置一段时间，
其特征在于，
在所述试剂A中，缓冲盐溶液为缓冲盐为Hepes、Tris的一种或两种任意比例的组合；
在所述B试剂中，透明质酸的分子量为30-70万，巯基取代度为30-60%；缓冲盐为Hepes、Tris的一种或两种任意比例的组合。
3.如权利要求2所述的制备聚阴离子聚合物/磷酸钙纳米基因递送系统的方法，其特征在于，试剂A中缓冲盐为Tris缓冲盐；试剂B中缓冲盐为Hepes缓冲盐。
4.如权利要求2和3中任一项所述的制备聚阴离子聚合物/磷酸钙纳米基因递送系统的方法，其特征在于，在所述试剂A中的氯化钙的浓度为100~300mM，Tris缓冲盐浓度为10~30mM，pH为7.0~8.0；在所述试剂B中，巯基化透明质酸浓度为40~3000μg/ml，磷酸盐的浓度为100~300mM，NaCl浓度为100~300mM，Hepes缓冲盐的浓度为20~50mM，pH为7.0~8.0。
5.如权利要求4所述的制备聚阴离子聚合物/磷酸钙纳米基因递送系统的方法，其特征在于，巯基化透明质酸浓度为600~2000μg/ml。
6.如权利要求2所述的制备聚阴离子聚合物/磷酸钙纳米基因递送系统的方法，其特征在于，基因与CaCl2溶液混合再与Tris缓冲液混合或基因与CaCl2溶液和Tris缓冲液的混合溶液混合。
7.如权利要求6所述的制备聚阴离子聚合物/磷酸钙纳米基因递送系统的方法，其特征在于，将CaCl2溶液与基因溶液混合，再将Tris缓冲溶液滴加到上述混合溶液中。
8.如权利要求1所述的聚阴离子聚合物/磷酸钙纳米基因递送系统用于体外细胞的基因转染的用途，其中所述基因是DNA、siRNA、miRNA中的任一或多种。
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