CN114948904A - 透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒的制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒的制备方法，包括以下步骤：（1）合成透明质酸衍生物；（2）制备透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒。上述方法制备的透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒在制备治疗肿瘤药物中的应用。上述方法制备的透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒在制备治疗关节炎药物中的应用。本发明的优点在于：1、对核酸药物磷酸钙核心外包被透明质酸衍生物，抑制核心不可控生长，粒径均一稳定在200nm左右；2、混合法制备，时间短，成本降低，且没有实用有机溶剂，清洁无污染；3、生物相容性更好，使用的材料为广泛应用到临床的药用辅料透明质酸和临床在用药物阿仑膦酸钠，安全性好。
Description
技术领域
本发明属于纳米生物材料领域，具体涉及透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒的制备方法与应用。
背景技术
磷酸钙纳米粒作为一种具备良好生物安全性和降解性的天然材料，在转染核酸药物（siRNA、DNA、mRNA等）治疗疾病的研究中表现出较好的递送效率。然而，磷酸钙纳米粒在生理环境下快速不可控生长的粒径使得其难以在肿瘤等病灶部位蓄积，严重限制了其运用到临床的进程。
针对磷酸钙纳米粒不可控的粒径增长问题，目前的改良手段主要的方法是以磷酸钙/核酸药物纳米沉淀为核心，通过连接键覆盖阻碍其粒径持续增长的保护外层，主要包括脂质材料（Lipid）、PEG、黏多糖和PLGA及其他无机材料。比较有代表性的是利用Lipid层控制磷酸钙纳米粒粒径生长，使用反相微乳法制备了核酸药物/磷酸钙纳米粒（Lipid coatedcalcium phophate-1，LCP-1）。其中，反相微乳是由水溶液分散到含有壬基酚聚氧乙烯醚（IGEPAL-CO-520）的环己烷油相溶液中制备得到，主要分三步：1）将CaCl2溶液（pH=9）和核酸药物/NaHPO4（pH=9）混合溶液分别分散到油相中，将两相混合搅拌，微乳交换反应产生包载siRNA的磷酸钙沉淀；2）加入柠檬酸钠直至溶液澄清稳定磷酸钙纳米粒（粒径在 80 nm左右），同时使纳米粒表面呈负电性，利于与阳离子脂质体结合。乙醇水洗脱并过硅胶柱方法纯化；3）进一步与阳离子磷脂1,2-二油烯氧基3-三甲氨基丙烷（DOTAP）/胆固醇作用，得到粒径约为150 nm 的LCP-1纳米粒。
但是上述的制备方法有两大缺陷与不足：1）操作工艺复杂；2）使用有机溶剂，成本高。
发明内容
发明目的：本发明针对上述现有技术存在的问题做出改进，即本发明公开了透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒的制备方法与应用。本发明首先合成了透明质酸衍生物材料，然后通过简单混合法，构建了透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒，本发明只需简单混合操作，制备方便，且不涉及有机溶剂，成本低廉，更安全。
技术方案：透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
（1）合成透明质酸衍生物：
（11）向反应器中加入0.3 ～ 0.7摩尔份的透明质酸和0.9～ 1.8摩尔份的羧基活化剂，然后用溶剂完全溶解后得到混合液，再将混合液的pH值调节至4～5；
（12）向反应器中加入0.3 ～ 0.7摩尔份的双磷酸盐小分子化合物，然后在18 ～25 ℃下反应24 ～ 72 h，透析后取滤液，使用冷冻干燥机将滤液冻干后得到透明质酸衍生物；
（2）制备透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒：
（21）将1体积份的CaCl2水溶液和1体积份的核酸药物水溶液混合均匀得到A液；
（22）将2体积份的缓冲液和2体积份的步骤（1）得到的透明质酸衍生物水溶液等体积混合均匀得到B液；
（23）将步骤（21）得到的A液逐滴加入步骤（22）得到的B液中，然后在37 ～ 40 ℃下孵育0.5～1h后即得到透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒。
进一步地，步骤（11）中所述透明质酸的分子量为48kD ～ 780kD，优选48kD。
进一步地，步骤（11）中所述羧基活化剂为等摩尔比的HBTU和1-羟基苯并三氮唑的混合物，或者：
等摩尔比的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的混合物。
进一步地，步骤（11）中所述溶剂为去离子水、DMF、DMSO中的一种，优选去离子水。
进一步地，步骤（11）中将混合液的pH值调节至4.8。
进一步地，步骤（12）中所述双磷酸盐小分子化合物为阿仑膦酸钠、帕米膦酸二钠中的一种，优选阿仑膦酸钠。
进一步地，步骤（21）中所述CaCl2水溶液浓度为100 ～ 500mmol•L-1，优选250mmol•L-1。
进一步地，步骤（21）中所述核酸药物水溶液中的溶质为siRNA、mRNA、DNA中的一种。
更进一步地，步骤（21）中所述核酸药物水溶液的浓度为1 ～ 50 μmol•L-1。
进一步地，步骤（22）中所述缓冲液为HEPES 缓冲液或PBS缓冲液，优选的为HEPES缓冲液。
进一步地，步骤（22）中所述透明质酸衍生物水溶液的浓度为0.5～ 1.5 mg/mL。
进一步地，所述步骤（23）中透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒中磷酸钙包括磷酸三钙、磷酸氢二钙、磷酸二氢钙和磷酸八钙。
上述方法制备的透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒在制备治疗肿瘤药物中的应用。
上述方法制备的透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒在制备治疗关节炎药物中的应用。
有益效果：本发明公开的透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒的制备方法与应用的优点在于：
1、对核酸药物磷酸钙核心外包被透明质酸衍生物，抑制核心不可控生长，粒径均一稳定在200nm左右；
2、混合法制备，时间短，成本降低，且没有实用有机溶剂，清洁无污染；
3、生物相容性更好，使用的材料为广泛应用到临床的药用辅料透明质酸和临床在用药物阿仑膦酸钠，安全性好。
附图说明
图1为透明质酸-阿仑膦酸钠（HL）的核磁共振氢谱图。
图2为不同阿仑膦酸钠修饰的HL@CAP/siRNA粒径分布图。
图3为HL@CAP/siRNA纳米粒（P%=80%）的DLS粒径图。
图4为阿仑膦酸钠修饰的HL@CAP/siRNA的透射电镜图。
图5为阿仑膦酸钠修饰的HL@CAP/siRNA对siRNA的血清保护效果图。
图6为阿仑膦酸钠修饰的HL@CAP/siRNA的放置稳定性示意图。
图7为阿仑膦酸钠修饰的HL@CAP/siRNA的稀释稳定性图。
图8为HL@CAP/siRNA与商用转染试剂Lipofectamine2000的细胞摄取能力对比示意图。
具体实施方式：
下面对本发明的具体实施方式详细说明。
实施例1：
透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
（1）、合成透明质酸-阿仑膦酸钠共轭物（HL）
首先，于100 mL茄形瓶中加入200 mg（0.5 mmol）透明质酸（HA）（分子量为48kDa），加入20 mL去离子水溶解，投入EDC 143.85 mg（0.75 mmol）和NHS 86.25 mg（0.75mmol），完全溶解后，调节pH为4-5活化0.5 h；
之后，称量阿仑膦酸钠162.56 mg（0.5 mmol）并加入上述混合液，室温反应24 h（pH维持在4-5），透析除去未反应阿仑膦酸钠和杂质等，使用冷冻干燥机冻干，得到样品。对得到的样品采用核磁共振技术（1H NMR）进行表征，得到核磁共振氢谱（附图1）。从图1可看出，HA上的H分布为1.8～2.0 ppm（甲基，c峰）和3.0～4.0 ppm （其他）。将阿仑膦酸钠连接到HA上合成的AHA出现了新的分布：～1.7 ppm（亚甲基，靠近糖环，b峰）和～2.7 ppm（两个亚甲基，靠近磷酸基团，a峰），表明阿仑膦酸钠成功连接到透明质酸上。经过上述测试分析，确定目标产物。
（2）、制备HL@CAP/siRNA纳米粒
首先，将10 μL的 CaCl2（250 mmol•L-1）和10 μL siRNA（4.8 μmol•L-1）等体积混合均匀（pH7.27）得到A液；
其次将20 μL HEPES 缓冲液（HBS，50 mmol•L-1 HEPES，280 mmol•L-1 NaCl，1.5mmol•L-1 Na2HPO4，pH 7.27）和20 μL 不同浓度的HL等体积混合均匀得到B液；将A液逐滴加入B液，37℃孵育1 h，得到HL@CAP/siRNA纳米粒。
表征HL@CAP/siRNA纳米粒
（1）、使用马尔文粒度仪（DLS）测定粒径分布和电位，得到附图2。如图2，siRNA和钙磷酸盐沉淀固化形成核心，之后HL凭借阿仑膦酸钠与核心表面钙离子的相互作用吸附在核心的周围，形成类核壳结构，阻碍核心的进一步生长。
（2）、为了考察HL加入量对磷酸钙纳米粒生长的影响，测定不同HL引入量下HL@CAP/siRNA纳米粒的粒径大小。随着HL引入量的增加，粒径逐渐降低，而且在P%大于等于70%时，粒径可控制在200 nm左右，说明HL可以有效地抑制磷酸钙纳米粒的不规则生长。基于此，选择HL@CAP/siRNA纳米粒（P%=80%）进行后续实验，如附图3所示，其粒径约195 nm，电位约-15 mV，而未经HL修饰的磷酸钙纳米粒（CaP/siRNA）粒径约3200 nm，电位近中性。
（3）、取10 μL筛选优化的HL@CAP/siRNA纳米粒滴加在镀有碳膜的铜网上，自然挥干，使用JOEL 100CX透射电子显微镜（电压100 kV）观察并拍摄，得到附图4。如图4所示，CAP/siRNA纳米粒聚集成团，粒径大于1 μm，而HL@CAP/siRNA纳米粒（P%=80%）大多单独分散，呈球形，大小约为150 nm左右，略小于水合粒径，是因为电镜观察的是水分挥发之后固缩的粒子。
（4）、HL@CAP/siRNA纳米粒的稳定性
考察HL@CAP/siRNA纳米粒在血清中的稳定性：即保护siRNA免遭RNA酶降解的能力。游离siRNA及CAP/siRNA NPs和 HL@CAP/siRNA NPs分别与等体积胎牛血清混合（siRNA终浓度为1.2 μM），37℃孵育，分别于0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、9 h、12 h、24 h、36 h和48 h取样，-20度中保存。
取完所有样品后，各时间点样品加入含1mol/L HCl的6×RNA 上样缓冲液，在含有0.5 μg/mL gel red 的1%琼脂糖凝胶上80 V 电压电泳3 min，再以100 V 电压电泳15min，ImagerQuant RT ECL凝胶成像系统观察gel red /siRNA 荧光。内环境和胞浆中含有较多的RNA酶，可以破坏siRNA使其失去基因沉默效应。大多数递送载体包载siRNA后可显著增强siRNA的抗RNA酶降解能力。结果如附图5，利用凝胶电泳实验考察了不同纳米粒对siRNA的保护效果。游离的siRNA在两个小时内基本被RNA酶降解完全，CAP/siRNA 纳米粒可有效保护siRNA约24 h，而HL@CAP/siRNA纳米粒对siRNA具有更强的保护效果，在48 h时仍能观察到清晰条带。HL@CAP/siRNA纳米粒对siRNA较好的保护效果也说明其可以高效地包载siRNA。
考察HL@CAP/siRNA纳米粒的放置稳定性：室温分别放置1、3、5、7、10、30天，测定粒径，如附图6，随着时间的推移，HL@CAP/siRNA纳米粒的粒径稳定。
考察HL@CAP/siRNA纳米粒的稀释稳定性：取20 μL HL@CAP/siRNA纳米粒，用0.9%生理盐水分别稀释至原体积的8、16、32、64、128、256和512倍，使用马尔文激光粒度仪测定其粒径变化。如附图7，随着稀释倍数的增加，HL@CAP/siRNA纳米粒的粒径变化不大，说明其具有较好的抗稀释能力。
（5）、人非小细胞性肺癌细胞A549对HL@CAP/siRNA纳米粒的摄取能力
人非小细胞性肺癌细胞A549分别以每孔25万接种于六孔板中，24 h后更换培养基，加入OPTI-MEM 培养基，分别用不同纳米复合物转染FAM-siRNA，FAMsiRNA终浓度为100nM，孵育4 h。预冷PBS洗涤两遍后，消化离心，再用PBS洗涤两遍后，300 µL PBS重悬，立即利用流式细胞仪测量细胞中FAM荧光强度，采集10000个细胞，激发波长为488 nm，发射波长为518 nm，采集数据使用FCS ExpressV3 软件分析，得到附图8。如图8所示，HL@CAP/siRNA纳米粒摄取量是未修饰组（CAP/siRNA 纳米粒）的3倍，说明HL修饰可以显著促进细胞对siRNA的摄取能力，为后续发挥高效基因沉默能力奠定了基础，具有更好的抗肿瘤潜力。
实施例2
透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
（1）合成透明质酸衍生物：
（11）向反应器中加入0.3摩尔份的透明质酸和0.9摩尔份的羧基活化剂，然后用溶剂完全溶解后得到混合液，再将混合液的pH值（pH值的调节可以通过氢氧化钠水溶液实现）调节至4；
（12）向反应器中加入0.3摩尔份的双磷酸盐小分子化合物，然后在18 ℃下反应272 h，透析后取滤液，使用冷冻干燥机将滤液冻干后得到透明质酸衍生物；
（2）制备透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒：
（21）将1体积份的CaCl2水溶液和1体积份的核酸药物水溶液混合均匀得到A液；
（22）将2体积份的缓冲液和2体积份的步骤（1）得到的透明质酸衍生物水溶液等体积混合均匀得到B液；
（23）将步骤（21）得到的A液逐滴加入步骤（22）得到的B液中，然后在37℃下孵育1h后即得到透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒。
进一步地，步骤（11）中所述透明质酸的分子量为48kD。
进一步地，步骤（11）中所述羧基活化剂为等摩尔比的HBTU（O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐，CAS号：94790-37-1）和1-羟基苯并三氮唑的混合物。
进一步地，步骤（11）中所述溶剂为去离子水。
进一步地，步骤（12）中所述双磷酸盐小分子化合物为阿仑膦酸钠。
进一步地，步骤（21）中所述CaCl2水溶液浓度为100 mmol•L-1。
进一步地，步骤（21）中所述核酸药物水溶液中的溶质为siRNA。
更进一步地，步骤（21）中所述核酸药物水溶液的浓度为1 μmol•L-1。
进一步地，步骤（22）中所述缓冲液为HEPES 缓冲液HEPES 缓冲液（50 mmol•L-1HEPES，280 mmol•L-1 NaCl，1.5 mmol•L-1 Na2HPO4，pH 7.27）。
进一步地，步骤（22）中所述透明质酸衍生物水溶液的浓度为0.5mg/mL。
进一步地，所述步骤（23）中透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒中磷酸钙包括磷酸三钙、磷酸氢二钙、磷酸二氢钙和磷酸八钙。
上述方法制备的透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒在制备治疗肿瘤药物中的应用。
上述方法制备的透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒在制备治疗关节炎药物中的应用。
实施例3
透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
（1）合成透明质酸衍生物：
（11）向反应器中加入0.7摩尔份的透明质酸和1.8摩尔份的羧基活化剂，然后用溶剂完全溶解后得到混合液，再将混合液的pH值（pH值的调节可以通过氢氧化钠水溶液实现）调节至5；
（12）向反应器中加入0.7摩尔份的双磷酸盐小分子化合物，然后在25 ℃下反应24h，透析后取滤液，使用冷冻干燥机将滤液冻干后得到透明质酸衍生物；
（2）制备透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒：
（21）将1体积份的CaCl2水溶液和1体积份的核酸药物水溶液混合均匀得到A液；
（22）将2体积份的缓冲液和2体积份的步骤（1）得到的透明质酸衍生物水溶液等体积混合均匀得到B液；
（23）将步骤（21）得到的A液逐滴加入步骤（22）得到的B液中，然后在40 ℃下孵育0.5h后即得到透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒。
进一步地，步骤（11）中所述透明质酸的分子量为780kD。
进一步地，步骤（11）中所述羧基活化剂为等摩尔比的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的混合物。
进一步地，步骤（11）中所述溶剂为DMF。
进一步地，步骤（12）中所述双磷酸盐小分子化合物为帕米膦酸二钠。
进一步地，步骤（21）中所述CaCl2水溶液浓度为500mmol•L-1。
进一步地，步骤（21）中所述核酸药物水溶液中的溶质为mRNA。
更进一步地，步骤（21）中所述核酸药物水溶液的浓度为50 μmol•L-1。
进一步地，步骤（22）中所述缓冲液为PBS缓冲液。
进一步地，步骤（22）中所述透明质酸衍生物水溶液的浓度为1.5 mg/mL。
进一步地，所述步骤（23）中透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒中磷酸钙包括磷酸三钙、磷酸氢二钙、磷酸二氢钙和磷酸八钙。
上述方法制备的透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒在制备治疗肿瘤药物中的应用。
上述方法制备的透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒在制备治疗关节炎药物中的应用。
实施例4
透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
（1）合成透明质酸衍生物：
（11）向反应器中加入0.5摩尔份的透明质酸和1.5摩尔份的羧基活化剂，然后用溶剂完全溶解后得到混合液，再将混合液的pH值（pH值的调节可以通过氢氧化钠水溶液实现）调节至4.8；
（12）向反应器中加入0.5摩尔份的双磷酸盐小分子化合物，然后在22 ℃下反应48h，透析后取滤液，使用冷冻干燥机将滤液冻干后得到透明质酸衍生物；
（2）制备透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒：
（21）将1体积份的CaCl2水溶液和1体积份的核酸药物水溶液混合均匀得到A液；
（22）将2体积份的缓冲液和2体积份的步骤（1）得到的透明质酸衍生物水溶液等体积混合均匀得到B液；
（23）将步骤（21）得到的A液逐滴加入步骤（22）得到的B液中，然后在38 ℃下孵育0.75h后即得到透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒。
进一步地，步骤（11）中所述透明质酸的分子量为350kD。
进一步地，步骤（11）中所述羧基活化剂为等摩尔比的HBTU（O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐，CAS号：94790-37-1）和1-羟基苯并三氮唑的混合物。
进一步地，步骤（11）中所述溶剂为去DMSO。
进一步地，步骤（12）中所述双磷酸盐小分子化合物为阿仑膦酸钠。
进一步地，步骤（21）中所述CaCl2水溶液浓度为250mmol•L-1。
进一步地，步骤（21）中所述核酸药物水溶液中的溶质为DNA。
更进一步地，步骤（21）中所述核酸药物水溶液的浓度为25 μmol•L-1。
进一步地，步骤（22）中所述缓冲液为HEPES 缓冲液（50 mmol•L-1 HEPES，280mmol•L-1 NaCl，1.5 mmol•L-1 Na2HPO4，pH 7.27）。
进一步地，步骤（22）中所述透明质酸衍生物水溶液的浓度为1mg/mL。
进一步地，所述步骤（23）中透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒中磷酸钙包括磷酸三钙、磷酸氢二钙、磷酸二氢钙和磷酸八钙。
上述方法制备的透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒在制备治疗肿瘤药物中的应用。
上述方法制备的透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒在制备治疗关节炎药物中的应用。
综上，由本发明的实施例可知，本发明合成了一种透明质酸-阿仑膦酸钠共轭物高分子材料（HL），通过一步混合法将其包被在磷酸钙纳米沉淀的周围，构建一种新型的透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒（HL@CAP/siRNA NPs），纳米粒均一稳定的，操作更简单，且不涉及有机溶剂，成本低廉，更安全，为解决siRNA磷酸钙纳米载体突破应用困境提供了新策略和新技术。
上面对本发明的实施方式做了详细说明。但是本发明并不限于上述实施方式，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。
Claims (10)
1.透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）合成透明质酸衍生物：
（11）向反应器中加入0.3 ～ 0.7摩尔份的透明质酸和0.9～ 1.8摩尔份的羧基活化剂，然后用溶剂完全溶解后得到混合液，再将混合液的pH值调节至4～5；
（12）向反应器中加入0.3 ～ 0.7摩尔份的双磷酸盐小分子化合物，然后在18 ～ 25℃下反应24 ～ 72 h，透析后取滤液，使用冷冻干燥机将滤液冻干后得到透明质酸衍生物；
（2）制备透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒：
（21）将1体积份的CaCl2水溶液和1体积份的核酸药物水溶液混合均匀得到A液；
（22）将2体积份的缓冲液和2体积份的步骤（1）得到的透明质酸衍生物水溶液等体积混合均匀得到B液；
（23）将步骤（21）得到的A液逐滴加入步骤（22）得到的B液中，然后在37 ～ 40 ℃下孵育0.5～1h后即得到透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒。
2.如权利要求1所述的透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤（11）中所述羧基活化剂为等摩尔比的HBTU和1-羟基苯并三氮唑的混合物，或者：
等摩尔比的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的混合物。
3.如权利要求1所述的透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤（11）中所述透明质酸的分子量为48kD ～ 780kD；
步骤（11）中将混合液的pH值调节至4.8。
4.如权利要求1所述的透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤（11）中所述溶剂为去离子水、DMF、DMSO中的一种，优选去离子水。
5.如权利要求1所述的透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤（12）中所述双磷酸盐小分子化合物为阿仑膦酸钠、帕米膦酸二钠中的一种，优选阿仑膦酸钠。
6.如权利要求1所述的透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤（21）中所述CaCl2水溶液浓度为100 ～ 500mmol•L-1，优选250mmol•L-1。
7.如权利要求1所述的透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤（21）中所述核酸药物水溶液中的溶质为siRNA、mRNA、DNA中的一种；
步骤（21）中所述核酸药物水溶液的浓度为1 ～ 50 μmol•L-1。
8.如权利要求1所述的透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤（22）中所述缓冲液为HEPES 缓冲液或PBS缓冲液，优选的为HEPES 缓冲液；
步骤（22）中所述透明质酸衍生物水溶液的浓度为0.5～ 1.5 mg/mL。
9.权利要求1-8任意一项所述的制备方法制备的透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒在制备治疗肿瘤药物中的应用。
10.权利要求1-8任意一项所述的制备方法制备的透明质酸衍生物包被的磷酸钙纳米粒在制备治疗关节炎药物中的应用。
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| CN (1) | CN114948904A (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104862337A (zh) * | 2015-05-25 | 2015-08-26 | 中国药科大学 | 聚阴离子聚合物/磷酸钙纳米基因递送系统及制备方法 |
| CN106362172A (zh) * | 2016-08-26 | 2017-02-01 | 郑州大学 | 透明质酸修饰的介孔碳酸钙药物组合物的制备方法及应用 |
| CN109464397A (zh) * | 2018-11-16 | 2019-03-15 | 中国药科大学 | 一种基于生物矿化的氧化石墨烯多药共载系统及其制备方法和应用 |
-
2022
- 2022-07-28 CN CN202210895284.XA patent/CN114948904A/zh active Pending
Patent Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
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