CN104862317B - 一种肝癌细胞特异性的适配子及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肝癌细胞特异性的适配子及其制备方法。该适配子包括：H2c适配子、H4c适配子和H5b适配子中的至少一种。该方法包括：合成第一文库和引物；将第一文库与靶细胞孵育；分离纯化不与靶细胞结合的核酸，得到第一模板，对第一模板进行不对称扩增，得到第二文库；将第二文库与反筛细胞孵育；分离纯化与反筛细胞结合的核酸，得到第二模板，对第二模板进行不对称扩增，得到第三文库；重复操作得到第十二模板，对第十二模板进行对称扩增，得到扩增产物进行克隆并测序分离出单个适配子；模拟分析单个适配子的二级结构，测定结合率，挑选出适配子。该适配子可高特异性地识别肝癌细胞，该方法所制得的适配子可高特异性地识别肝癌组织。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种肝癌细胞特异性的适配子及其制备方法。
背景技术
指数富集配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands byExponential Enrichment，SELEX)是一种组合技术，细胞-SELEX技术是近年来发展起来的一种新技术，它是以整个细胞为靶标进行的筛选，通过这种细胞-SELEX技术筛选得到的适配子具有更强大的分辨能力，能区别细胞之间的微小差异。
肝癌是消化道系统中存在一种很常见的恶性疾病，其发病率与死亡率都很高，它是威胁人类健康的头号“杀手”。虽然目前治疗肝癌的手段有了很大的改进，但患者的生存率仍不理想。因此，早发现、早治疗是最有效的提高肝癌患者生存率的途径。
在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在以下问题：
尽管有文献报道，通过肝癌细胞筛选得到了一些适配子，但这些适配子与肝癌细胞的结合力或特异性较低，因此在用于肝癌细胞的早期诊断中有一定的局限性。
发明内容
为了解决现有技术中的适配子与肝癌细胞的结合力或特异性较低的问题，本发明实施例提供了一种肝癌细胞特异性的适配子及其制备方法。所述技术方案如下：
一方面，本发明实施例提供了一种肝癌细胞特异性的适配子，所述适配子包括：如序列表SEQ ID NO:1所示的H2c适配子、如序列表SEQ ID NO:2所示的H4c适配子和如序列表SEQ ID NO:3所示的H5b适配子中的至少一种。
具体地，所述适配子的5'端均连接荧光基团Cy5或Cy3，所述适配子的3'端均连接淬灭基团BHQ1或BHQ2。
另一方面，本发明实施例提供了一种制备上述适配子的方法，所述方法包括：
步骤1：合成随机单链寡核酸第一文库和引物；
步骤2：进行正向筛选，所述正向筛选包括：将所述第一文库与靶细胞共同孵育；
步骤3：分离纯化与所述靶细胞结合的核酸，得到第一模板，利用所述引物对所述第一模板进行不对称扩增，得到第二文库；
步骤4：进行反向筛选，所述反向筛选包括：将所述第二文库与反筛细胞共同孵育；
步骤5：分离纯化不与所述反筛细胞结合的核酸，得到第二模板，利用所述引物对所述第二模板进行不对称扩增，得到第三文库；
步骤6：采用所述第三文库重复步骤2、步骤3、步骤4和步骤5共循环十一次，在第十一次循环时，得到第二十四模板，利用所述引物对所述第二十四模板进行对称扩增，得到扩增产物；
步骤7：将所述扩增产物克隆并测序，分离出单个适配子；
步骤8：模拟每个所述单个适配子的二级结构，选出具有代表性的所述适配子，随机截取具有代表性的所述适配子的序列，对具有代表性的所述适配子的序列进行标记，测定具有代表性的所述适配子分别与所述靶细胞和所述反筛细胞的结合率，挑选出与所述靶细胞结合率高且与所述反筛细胞结合率低的所述适配子。
具体地，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物如序列表SEQ ID NO:4所示，所述反向引物如序列表SEQ ID NO:5所示。
具体地，所述孵育的温度为37℃。
具体地，随机截取所述适配子的序列的条件为：选取茎-环结构多的位点进行截取。
具体地，采用异硫氰酸酯对具有代表性的所述适配子的序列进行标记。
具体地，采用流式细胞实验测定具有代表性的所述适配子分别与所述靶细胞和所述反筛细胞的结合率。
具体地，所述靶细胞包括Huh7.5.1肝癌细胞和HepG2肝癌细胞中的至少一种，所述反筛细胞为L-02正常肝细胞。
本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供的适配子可高特异性地识别肝癌细胞，从而建立更加灵敏的早期诊断方法，提高肝癌的诊疗效果，本发明实施例提供的制备适配子的方法所制得的适配子可高特异性地识别肝癌细胞。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例一提供的H2c适配子的结构图；
图2是本发明实施例一提供的H4c适配子的结构图；
图3是本发明实施例一提供的H5b适配子的结构图；
图4是本发明实施例二提供的H2c适配子的浓度与特异性结合率的曲线图；
图5是本发明实施例二提供的H4c适配子的浓度与特异性结合率的曲线图；
图6是本发明实施例二提供的H5b适配子的浓度与特异性结合率的曲线图；
图7是本发明实施例二提供的H2c适配子与Huh7.5.1肝癌细胞在显微镜下的照片；
图8是本发明实施例二提供的H2c适配子与L-02正常肝细胞在显微镜下的照片；
图9是本发明实施例二提供的H4c适配子与Huh7.5.1肝癌细胞在显微镜下的照片；
图10是本发明实施例二提供的H4c适配子与L-02正常肝细胞在显微镜下的照片；
图11是本发明实施例二提供的H5b适配子与Huh7.5.1肝癌细胞在显微镜下的照片；
图12是本发明实施例二提供的H5b适配子与L-02正常肝细胞在显微镜下的照片；
图13是本发明实施例二提供的H2c适配子与肝癌组织在显微镜下的照片；
图14是本发明实施例二提供的H2c适配子与正常肝组织在显微镜下的照片；
图15是本发明实施例二提供的H4c适配子与肝癌组织在显微镜下的照片；
图16是本发明实施例二提供的H4c适配子与正常肝组织在显微镜下的照片；
图17是本发明实施例二提供的H5b适配子与肝癌组织在显微镜下的照片；
图18是本发明实施例二提供的H5b适配子与正常肝组织在显微镜下的照片；
图19是本发明实施例二提供的采用H2c适配子和H4c适配子对Huh7.5.1肝癌细胞进行荧光探针检测的曲线图；
图20是本发明实施例二提供的采用H2c适配子和H4c适配子对L-02正常肝细胞进行荧光探针检测的曲线图；
图21是本发明实施例二提供的方法流程图。
其中，图4-图6的横坐标为浓度(nM)，图4-图6的纵坐标为特异性结合率(％)。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
实施例一
本发明实施例提供了一种肝癌细胞特异性的适配子，该适配子可以包括：如序列表SEQ ID NO:1所示的H2c适配子、如序列表SEQ ID NO:2所示的H4c适配子和如序列表SEQID NO:3所示的H5b适配子中的至少一种，其中三条适配子的结构如图1-3所示。
具体地，适配子的5'端均可以连接荧光基团FAM、Cy5或Cy3，适配子的3'端均可以连接淬灭基团BHQ1或BHQ2。其中，当上述三个适配子用作荧光实验时，5'端均可以连接荧光基团Cy5，当上述适配子用作荧光探针时，5'端均可以连接荧光基团Cy5或Cy3。
本发明实施例提供的适配子可高特异性地识别肝癌细胞，从而建立更加灵敏的早期诊断方法，提高肝癌的诊疗效果。
实施例二
本发明实施例提供了一种制备本发明实施例一提供的适配子的方法，如图21所示，该方法包括：
步骤1：合成随机单链寡核酸第一文库和引物，其中，单链寡核酸第一文库为5′-ACCGACCGTGCTGGACTCT-N40-AGTATGAGCGAGCGTTGCG-3′，引物包括正向引物和反向引物，正向引物如序列表SEQ ID NO:4所示，反向引物如序列表SEQ ID NO:5所示。
步骤2：进行正向筛选，正向筛选包括：将第一文库与靶细胞共同孵育，其中，孵育的温度为37℃，靶细胞可以为Huh7.5.1肝癌细胞和HepG2肝癌细胞中的至少一种，本实施中选取的靶细胞为Huh7.5.1肝癌细胞。
步骤3：分离纯化与靶细胞结合的核酸，得到第一模板，利用引物对第一模板进行不对称PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应)扩增，得到第二文库；得到的第二文库用于下一轮筛选。
步骤4：进行反向筛选，反向筛选包括：将第二文库与反筛细胞共同孵育；其中，孵育的温度为37℃，反筛细胞为L-02正常肝细胞。
步骤5：分离纯化不与反筛细胞结合的核酸，得到第二模板，利用引物对第二模板进行不对称PCR扩增，得到第三文库；
步骤6：采用第三文库重复步骤2、步骤3、步骤4和步骤5共循环十一次，在第十一次循环时，得到第二十四模板，利用引物对第二十四模板进行对称扩增，得到扩增产物；
步骤7：将扩增产物送至生物工程公司进行克隆并测序，分离出10个单个适配子；
步骤8：用RNA Structure 5.3软件模拟分析每个单个适配子的二级结构，选出具有代表性的适配子，随机截取具有代表性的适配子的序列，采用异硫氰酸酯对具有代表性的适配子的序列进行标记，采用流式细胞实验测定具有代表性的适配子分别与靶细胞和反筛细胞的结合率，挑选出与靶细胞结合率高(一般认为结合率≥90％为高结合率)且与反筛细胞结合率低(包括不与反筛细胞结合的序列，一般认为结合率≤10％为低结合率)的三条适配子(实施例一中提供的三条适配子)。其中，具有代表性的适配子为茎-环结构较多的适配子(较多的茎-环结构一般指茎-环结构为2～4个)，随机截取适配子的序列的条件为：选取茎-环(loop-stem)结构较多的位点进行截取。
将三条适配子送至上海赛百盛公司进行合成，用该适配子结合缓冲液，该缓冲液成分为：4.5g/L葡萄糖、5mM MgCl2、0.1mg/mLtRNA、lmg/mLBSA、1％NaN3和10％胎牛血清(Fetal calf serum，FBS)，配制成浓度为100μM适配子溶液，分装并于-20℃保存备用。
适配子变性：取适配子溶液用PBS(Phosphate Buffered Saline)缓冲溶液稀释成浓度为1μM的适配子工作液。取10支0.5ml EP(Eppendorf)管，依次加入4、8、12、16、20、40、80、120、160、200μl适配子工作液置于95℃水浴中加热5min，取出后立即冰浴10min，然后再分别加入196、192、188、184、180、160、120、80、40、0μl结合缓冲液(得到的溶液浓度分别为20nM、40nM、60nM、80nM、100nM、200nM、400nM、600nM、800nM、1000nM)，振荡混匀，备用。
确定适配子的用量：取1μM(终体积为200μL)配制的适配子溶液，配制不同浓度梯度的适配子进行流式细胞实验，测定适配子对肝癌细胞的结合率，以最低浓度、最大结合率时的浓度为适配子用量，见表1。
表1.不同浓度的适配子与Huh7.5.1肝癌细胞的结合情况
由表1可见，上述三个适配子在200nM时，其结合率均大于80％以上，所以本实施例选取250nM作为后续实验的最小用量。
适配子对肝癌细胞的特异性识别：分别取适配子250nM(200μL)，将适配子变性后分别与5×105个Huh7.5.1肝癌细胞、5×105个HepG2肝癌细胞、5×105个LM9肝癌细胞、5×105个97L肝癌细胞及5×105个L-02正常肝细胞于37℃孵育30min,离心后收集细胞沉淀，用筛选缓冲液洗涤细胞一遍后，再用200μl冷PBS缓冲液重悬细胞，立即上流式细胞仪测定适配子与这4种肝癌细胞及正常肝细胞的结合率。实验结果参见图2。
表2.适配子分别与肝癌细胞和L-02正常肝细胞的结合率
| H2c | H4c | H5b | |
| Huh7.5.1 | 88.8％ | 97.4％ | 95.1％ |
| HepG2 | 96.2％ | 95.6％ | 94.7％ |
| LM9 | 13.5％ | 11.3％ | 13.7％ |
| 97L | 9.7％ | 12.5％ | 11.5％ |
| L-02 | 1.4％ | 5.8％ | 6.3％ |
由表2可见，本发明实施例提供的适配子与Huh7.5.1肝癌细胞和HepG2肝癌细胞的结合率均大于90％以上，本发明实施例提供的适配子对另外2种肝癌细胞的结合率均较低，其结合率都在14％以下，对L-02正常肝细胞的结合率小于7％。由此可见，本实施例提供的适配子只对Huh7.5.1肝癌细胞和HepG2肝癌细胞具有特异性识别的能力，而对L-02正常肝癌细胞基本没有识别作用。
将上述由本发明实施例提供的方法制得的适配子的5'端均连接荧光基团(Cy5)且3'端均连接淬灭基团(BHQ2)，设计成适配子荧光探针的结构。将适配子荧光探针再分别与Huh7.5.1肝癌细胞及L-02正常肝细胞孵育，采用流式细胞实验测定适配子与细胞结合前后的荧光强度的变化。
细胞计数：取5×105个肝癌细胞或L-02正常肝细胞置于1.5ml EP管中，离心弃上清液，留细胞沉淀待用。
孵育结合：将适配子荧光探针(250nM，200μL)分别与细胞沉淀于37℃孵育30min。
结合力的确定：离心并弃上清液，用筛选缓冲液(成分：4.5g/L葡萄糖、5mM MgCl2和1％NaN3)洗涤细胞3次，最后用200μl冷PBS缓冲液重悬细胞，立即上流式细胞仪测定其结合率。用Graphism 5软件计算每条适配子与肝癌细胞的结合力，结果如图4-6所示，由图4-6可见这3条适配子与肝癌细胞的结合力均在纳摩尔水平，具有较高的结合力。
共聚焦显微实验：分别取5×105个Huh7.5.1肝癌细胞或L-02正常肝细胞与250nM适配子在37℃孵育30min后，筛选缓冲液洗涤细胞2次后，加入100μlPBS后置于显微镜下进行拍照，结果如图7-12所示，可见三条适配子均可以很好的与Huh7.5.1肝癌细胞结合，而基本不与L-02正常肝细胞结合，显示出对Huh7.5.1肝癌细胞良好的特异性。
适配子的诊断价值评价：
1、适配子区分癌组织和正常组织：
分别取石蜡包埋的人的肝癌组织和正常肝组织(已经在医院得到病理学上的确证)各6例，经脱蜡处理后，分别与上述3条适配子(250nM，200μl，3条适配子的一端标记有FAM基团(由上海赛百盛公司合成))于37℃孵育30min，经PBS洗涤组织后，置于共聚焦显微镜下进行拍照，拍照结果显示：这三条荧光标记的适配子可以与人的肝癌组织很好的结合，发出很强的绿色荧光，而且基本不与人的正常肝组织结合，结果如图13-图18所示，可见，该三条适配子在肝癌组织和正常肝组织之间的鉴别诊断中均有良好效果。
2、适配子荧光探针检测肝癌细胞
将三条适配子的一端修饰Cy5，另一端标记BHQ2，交由上海赛百盛公司合成，将上述每条适配子(250nM，200μl)分别与5×105个Huh7.5.1肝癌细胞或L-02正常肝细胞在37℃孵育30min后，PBS洗涤后，立即置于流式细胞仪内测定各条序列与细胞结合前后的荧光强度的变化。结果显示：适配子荧光探针可以被肝癌细胞活化，发出很强的荧光，然后当与正常肝细胞结合后，荧光强度基本没有变化，进一步说明适配子荧光探针可以被肝癌细活化。因此，筛选得到的适配子可以很好的检测肝癌细胞，结果如图19和图20所示，显示作为荧光探针检测肝癌的潜在的临床诊断价值。
本发明实施例提供的制备适配子的方法所制得的适配子可高特异性地识别肝癌细胞。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种肝癌细胞特异性的适配子，其特征在于，所述适配子包括：如序列表SEQ ID NO:1所示的H2c适配子、如序列表SEQ ID NO:2所示的H4c适配子或如序列表SEQ ID NO:3所示的H5b适配子中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的适配子，其特征在于，所述适配子的5'端均连接荧光基团Cy5或Cy3，所述适配子的3'端均连接淬灭基团BHQ1或BHQ2。
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