CN104861012B - 一种分离制备多穗石柯根皮苷单体的方法 - Google Patents

Abstract

一种分离制备多穗石柯根皮苷单体的方法，是将多穗石柯提取液经微滤膜澄清处理后，先用超滤膜对澄清液进行初分离，再用ADS-7大孔吸附树脂对分离液进一步分离纯化，结晶。该方法以资源丰富、根皮苷含量高的多穗石柯作为原料，并集成绿色安全的微滤澄清、超滤分离、大孔吸附树脂纯化以及结晶技术，解决了传统以苹果皮或叶作为原料制备根皮苷成本高、有机溶剂萃取方法欠安全、单一树脂分离得率低及纯度不高等难题，同时制得的多穗石柯根皮苷达到高纯品或单体的要求，不仅为其药理药效的研究和功能性终端产品的开发提供优质原料，而且真正地实现了安全、简便、合理、经济的多穗石柯资源的高值化利用，充分体现出绿色化学生产的理念和良性循环经济的策略。

Description

一种分离制备多穗石柯根皮苷单体的方法

技术领域

本发明涉及一种分离制备多穗石柯根皮苷单体的方法，尤指一种多穗石柯提取液经0.2μm膜孔径的微滤膜澄清处理后，先采用截留分子量为2500Da的超滤膜初步分离澄清液中的根皮苷，再采用ADS-7树脂进一步分离纯化制备多穗石柯根皮苷单体的方法。

背景技术

根皮苷是根皮素的2’-β-D-葡萄糖苷，属黄酮类中二氢查尔酮苷。根皮苷可调节血糖、血压，保护心脏，具有抗过敏、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等生物活性，是目前国内外用于医学、美容、食品、保健品等健康领域的热点天然产物之一，并主要来源于苹果皮或叶。但由于苹果皮或叶中的根皮苷含量较低(低于0.3％)，生产根皮苷提取物的成本较高。壳斗科植物多穗石柯(LithocarpuspolystachyusRehd，又名甜茶)是一种富含根皮苷的特色植物资源，其黄酮类化合物含量高达22.2％，且根皮苷含量约占黄酮总量的12.6％，数倍于苹果皮或叶中含量，并在我国长江以南各省区有丰富的多穗石柯资源，因此开发利用多穗石柯根皮苷具有重要理论和实践意义。

目前分离纯化根皮苷的方法主要有溶剂萃取、大孔吸附树脂分离、离子交换树脂分离、高速逆流色谱分离以及离心分配色谱分离等。Wilson等利用乙醚和乙酸乙酯萃取得到根皮苷粗提物，该方法所用有机溶剂欠安全，其产品不宜添加到食品及药品中，同时纯度不高；李胜华等优化了D-101树脂分离多穗柯根皮苷工艺，根皮苷回收率为65.4％，但由于该工艺采用了NaOH调节洗脱剂乙醇的pH至8，不安全并不符合大孔树脂分离的工艺原理；Kammerer等采用LewatitS离子交换树脂分离苹果中主要黄酮类物质，该方法根皮苷得率不高，且分离效果受上样原料纯度的影响较大，同时加入的离子交换剂及废弃物对环境污染较大；李荣涛利用高速离心分配色谱法从苹果中分离出纯度为91.20％的根皮苷，该方法的不足在于仪器设备昂贵、单次制备量小等问题。从生产效率和产品的安全性来看，由于膜分离具有高效、过程基本无相变、一般可在常温下进行以及工艺简单、操作方便、易于放大、投资省、占地少、低污染等优点，以及大孔吸附树脂是一类有机高分子聚合物吸附剂，具有稳定的理化性质，不溶于酸、碱及有机溶剂，不受无机盐类及强离子、低分子化合物存在的影响，且树脂易于再生、工艺绿色环保、步骤省时简单，因此，利用膜分离、大孔吸附树脂纯化等技术是工业化生产根皮苷提取物的主要发展方向。郭玉蓉等的专利采用X-5大孔吸附树脂从苹果幼果中分离总多酚、绿原酸和根皮苷，能得到纯度为35.5％根皮苷粗提物。但是，单一的大孔吸附树脂往往较难实现高纯度或单体根皮苷的制备。为此，本发明根据膜分离、大孔吸附树脂纯化的科学原理，通过工艺优化，将多穗石柯提取液经膜孔径为0.2μm的微滤膜澄清处理后，先采用截留分子量为2500Da的超滤膜初步分离澄清液中的根皮苷，然后采用ADS-7树脂进一步分离纯化超滤液中的根皮苷，获得了分离制备多穗石柯根皮苷单体的方法，以期为多穗石柯根皮苷高纯品及单体的工业化生产提供可靠技术保障。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对上述分离技术存在的不足，提供一种经济易得、绿色高效、适合工业化生产的分离制备多穗石柯根皮苷单体的方法。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种分离制备多穗石柯根皮苷单体的方法，该方法步骤如下：

a、0.2μm膜孔径的微滤膜澄清处理多穗石柯提取液：将多穗石柯提取液用0.2μm微滤膜进行微滤澄清，并在滤液重为多穗石柯提取液重的80-90％时，于提取液中加入为10-20％提取液重的纯水透析一次，合并滤液和透析液，得澄清液；其中，微滤澄清条件：温度40-50℃，压力0.25-0.35MPa。

b、截留分子量为2500Da的超滤膜初步分离澄清液中的根皮苷：将上述微滤澄清液采用截留分子量为2500Da的超滤膜进行超滤，并在滤液重为澄清液重的80-90％时，于澄清液中加入10-20％澄清液重的纯水透析一次，合并滤液和透析液，得超滤分离液，将分离液减压浓缩，得到的浓缩液加1.0-1.5倍纯水进行稀释，以作为ADS-7树脂进一步纯化的原料液；其中，超滤条件：温度30-40℃，压力1.5-2.0MPa。

c、ADS-7树脂进一步分离纯化制备多穗石柯根皮苷单体：将4-6BV上述原料液以2-3BV/h流速对ADS-7树脂进行上样，上样完毕后静置30min，先用2BV质量浓度为20-40％的食用乙醇淋洗除去杂质，再用2-4BV质量浓度为70-90％的食用乙醇以1.5-2.5BV/h流速洗脱，收集洗脱液，将洗脱液减压浓缩、回收食用乙醇，得到的浓缩液趁热过滤，结晶，真空冷冻干燥，即得根皮苷单体。

上述提及的多穗石柯提取液是将多穗石柯原料于55-65℃干燥至含水量低于6％，以70-80％质量浓度的食用乙醇为提取溶剂，按1g多穗石柯加20-40mL食用乙醇的比例，于多穗石柯原料中加入食用乙醇超声辅助提取30-40min，取提取液。其中，超声辅助提取时的超声频率为50HZ。

上述提及的减压浓缩时的真空度为-0.05～-0.09MPa，温度为50～60℃。

上述提及的真空冷冻干燥时的真空度为-0.05～-0.09MPa，温度为-38～-42℃。

本发明使用的ADS-7树脂，是从D101、X-5、ADS-7、S-8、AB-8、NKA-9、HPD-100、HPD-400、HPD500、HZ816、HZ818、HZ906、HZ806、HZ832、HZ16、聚酰胺等十六树脂中筛选出来的，其筛选过程如下：称取树脂各1g，分别置于100mL的锥形瓶中，量取50mL经微滤膜过滤后的多穗石柯澄清液至各锥形瓶中，具塞后于110r/min、25℃恒温摇床下振荡24h，待树脂充分吸附后取出抽滤，液相色谱检测滤液中剩余根皮苷含量。将抽滤后的树脂用纯水冲洗、吸干后，置于原来的锥形瓶中，分别加入60％-80％质量浓度的乙醇50mL，具塞后于110r/min、25℃恒温摇床下振荡解吸24h。过滤后检测滤液根皮苷含量，计算其吸附量和解吸量，从而获得吸附与解吸综合效果最好的ADS-7树脂。

本发明中使用的各种树脂的预处理：将购买的各类树脂先分别浸泡于95％质量浓度乙醇中(乙醇量约为树脂量2倍)，浸泡24h后滤去多余乙醇，重新用95％乙醇湿法装柱，直至流出乙醇澄清透明，再用纯水淋洗树脂至流出液无醇味，即可。

本发明中使用的膜设备的清洗：在使用膜设备前后，均需对膜设备进行清洗。对0.2μm微滤膜采用0.6％质量浓度的NaClO在温度为50℃、无压力条件下清洗45min，对2500Da超滤膜采用pH12的NaOH溶液在温度为40℃、无压力条件下清洗60min。

本发明检测根皮苷含量的方法为高效液相色谱法，色谱条件为：色谱柱WelchromTMC18柱(5μm,4.6mm×250mm)；流动相为乙腈：水：磷酸＝22:88:0.1；流速为1.0mL/min；检测波长为285nm；检测温度为30℃，进样量为10μL。其中，根皮苷标准曲线绘制为：精确称取7.5mg根皮苷标准品配置成浓度为0.30mg/mL的母液，将上述母液稀释成浓度梯度为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30mg/mL，按色谱检测条件每个进样10μL，以根皮苷质量浓度为横坐标，以根皮苷峰面积作为纵坐标，得到标准曲线方程为y＝16467872x+13571.7333(R²＝0.9997)。

与现有技术相比，本发明的优点是：

1、本发明选用资源丰富、根皮苷含量高的多穗石柯作为原材料，并集成采用绿色安全并适合于大规模工业化生产的微滤澄清、超滤分离、大孔吸附树脂纯化等技术，分离制备多穗石柯根皮苷单体，突破了传统以苹果皮或叶作为原料制备根皮苷成本高、有机溶剂萃取方法欠安全、高速离心分配色谱法制备量小等难题。

2、本发明采用超滤膜初步分离与富集微滤澄液中的根皮苷，通过提高大孔吸附树脂分离纯化前料液中根皮苷的含量水平，大幅提高了树脂分离纯化效率和纯化倍数，不仅解决了传统采用单一树脂分离纯度不高、难以获得适合药理药效研究和功能性终端产品开发的根皮苷高纯品或单体的难题，而且ADS-7树脂是从D101、X-5、ADS-7、S-8、AB-8、NKA-9、HPD-100、HPD-400、HPD500、HZ816、HZ818、HZ906、HZ806、HZ832、HZ16、聚酰胺等十六树脂中筛选出来的最优树脂，既涵盖了已有文献资料用于分离根皮苷的D101、X-5大孔吸附树脂，又包括近年新出来HPD、HZ系列树脂，完全具有代表性和科学性。

3、本发明在分离制备多穗石柯根皮苷单体过程中，采用的溶剂仅为不同浓度的食用乙醇、水，采用的工艺技术也是绿色安全并适合于大规模工业化生产的微滤澄清、超滤分离、大孔吸附树脂纯化等技术，完全符合根皮苷提取物工业化生产中的绿色、安全、节能、简便以及大批量的生产要求。

具体实施方式

实施例1

取多穗石柯，于55℃烘至含水量低于6％，以70％质量浓度的食用乙醇为提取溶剂，按1g多穗石柯加20mL食用乙醇的比例，于多穗石柯中加入食用乙醇，并以50HZ超声辅助提取40min，取提取液。

将上述多穗石柯提取液以0.2μm微滤膜在40℃、0.25MPa条件下进行微滤澄清，并在滤液重为提取液重的80％时，于提取液中加入20％提取液重的纯水透析一次，收集滤液、透析液并合并，得澄清液。将微滤澄清液采用截留分子量为2500Da的超滤膜在30℃、1.5Mpa条件下进行超滤，并在滤液重为澄清液重的80％时，于澄清液中加入20％澄清液重的纯水透析一次，收集滤液、透析液并合并，得超滤分离液，将分离液减压浓缩(真空度-0.09MPa，温度50℃)至无醇味(回收食用乙醇)，加纯水稀释1.0倍，作为ADS-7树脂纯化的原料液(即稀释液)。

室温下，将稀释液以2BV/h流速上ADS-7树脂柱，上样4BV，静置30min吸附稳定后，先用20％质量浓度的食用乙醇淋洗2BV除去杂质，再用2BV质量浓度为70％的食用乙醇以1.5BV/h流速洗脱，收集此段食用乙醇洗脱液，减压浓缩(真空度-0.09MPa，温度50℃)至无醇味(回收食用乙醇)，将得到的浓缩液趁热过滤，滤液置于0℃下结晶，过夜，于-40℃、-0.07MPa下真空冷冻干燥24h，获得根皮苷单体产品。经液相色谱检测根皮苷含量，根皮苷纯度为99.5％，得率为81.2％。

实施例2

取多穗石柯，于65℃烘至含水量低于6％，以80％质量浓度的食用乙醇为提取溶剂，按1g多穗石柯加40mL食用乙醇的比例，于多穗石柯中加入食用乙醇以50HZ超声辅助提取30min，取提取液。

将上述多穗石柯提取液以0.2μm微滤膜在50℃、0.35MPa条件下进行微滤澄清，并在滤液重为提取液重的90％时，于提取液中加入10％提取液重的纯水透析一次，收集滤液、透析液并合并，得澄清液。将微滤澄清液采用截留分子量为2500Da的超滤膜在40℃、2.0Mpa条件下进行超滤，并在滤液重为澄清液重的90％时，于澄清液中加入10％澄清液重的纯水透析一次，收集滤液、透析液并合并，得超滤分离液，将分离液减压浓缩(真空度-0.05MPa，温度60℃)至无醇味(回收食用乙醇)，加纯水稀释1.5倍，作为ADS-7树脂纯化的原料液(即稀释液)。

室温下，将稀释液以3BV/h流速上ADS-7树脂柱，上样6BV，静置30min吸附稳定后，先用40％质量浓度的食用乙醇淋洗2BV除去杂质，再用4BV质量浓度为90％的食用乙醇以2.5BV/h流速洗脱，收集洗脱液，将洗脱液减压浓缩(真空度-0.05MPa，温度60℃)至无醇味(回收食用乙醇)，得到的浓缩液趁热过滤，滤液置于4℃下结晶，过夜，于-42℃、-0.05MPa下真空冷冻干燥24h，获得根皮苷单体产品。经液相色谱检测根皮苷含量，根皮苷纯度为99.3％，得率为79.7％。

实施例3

取多穗石柯，于60℃烘至含水量低于6％，以75％质量浓度的食用乙醇为提取溶剂，按1g多穗石柯加30mL食用乙醇的比例，于多穗石柯中加入食用乙醇以50HZ超声辅助提取35min，取提取液。

将上述多穗石柯提取液以0.2μm微滤膜在45℃、0.30MPa条件下进行微滤澄清，并在滤液重为提取液重的85％时，于提取液中加入15％提取液重的纯水透析一次，收集滤液、透析液并合并，得澄清液。将微滤澄清液采用截留分子量为2500Da的超滤膜在35℃、1.75MPa条件下进行超滤，并在滤液重为澄清液重的85％时，于澄清液中加入15％澄清液重的纯水透析一次，收集滤液、透析液并合并，得超滤分离液，将分离液减压浓缩(真空度-0.07MPa，温度55℃)至无醇味(回收食用乙醇)，加纯水稀释1.25倍，作为ADS-7树脂纯化的原料液(即稀释液)。

室温下，将稀释液以2.5BV/h流速上ADS-7树脂柱，上样5BV，静置30min吸附稳定后，先用30％质量浓度食用乙醇淋洗2BV除去杂质，再用3BV质量浓度为80％的食用乙醇以2.0BV/h流速洗脱，收集洗脱液，得到的洗脱液减压浓缩(真空度-0.07MPa，温度55℃)至无醇味(回收食用乙醇)，得到的浓缩液趁热过滤，滤液置于2℃下结晶，过夜，于-38℃、-0.09MPa下真空冷冻干燥24h，获得根皮苷单体产品。经液相色谱检测根皮苷含量，根皮苷纯度为99.5％，得率为80.1％。

对比实例1

室温下，将5BV实施例3中制得的多穗石柯提取液，以2.5BV/h流速缓慢倒入已经预处理装有ADS-7树脂的层析柱中进行上样，上样后，静置30min吸附稳定后，先用30％质量浓度食用乙醇淋洗2BV除去杂质，再用80％质量浓度食用乙醇以2.0BV/h流速洗脱3BV，收集洗脱液，洗脱液减压浓缩(真空度-0.07MPa，温度55℃)至无醇味(回收食用乙醇)，于-38℃、-0.09MPa下真空冷冻干燥24h。经液相色谱检测根皮苷纯度为36.8％，得率为78.6％。

对比实例2

室温下，将5BV实施例3中制得的多穗石柯微滤澄清液，以2.5BV/h流速缓慢倒入已经预处理装有ADS-7树脂的层析柱中进行上样，上样后，静置30min吸附稳定后，先用30％质量浓度食用乙醇淋洗2BV除去杂质，再用80％质量浓度食用乙醇以2.0BV/h流速洗脱3BV，收集洗脱液，洗脱液减压浓缩(真空度-0.07MPa，温度55℃)至无醇味(回收食用乙醇)，于-38℃、-0.09MPa下真空冷冻干燥24h。经液相色谱检测根皮苷纯度为43.2％，得率为87.4％。

对比实例3

室温下，将5BV实施例3中制得的多穗石柯微滤澄清液，以2.5BV/h流速缓慢倒入已经预处理的D101树脂层析柱中上样，上样后，静置30min吸附稳定后，先用30％质量浓度食用乙醇淋洗2BV除去杂质，再以90％食用乙醇以2.0BV/h流速洗脱3BV，收集洗脱液，将洗脱液减压浓缩至无醇味(回收食用乙醇)，于-38℃、-0.09MPa下真空冷冻干燥24h。经液相色谱检测根皮苷含量，根皮苷纯度为29.4％，得率为72.4％。

对比实例4

室温下，将5BV实施例3中制得的多穗石柯微滤澄清液，以2.5BV/h流速缓慢倒入已经预处理的X-5树脂层析柱中进行上样，上样后，静置30min吸附稳定后，先用30％质量浓度食用乙醇淋洗2BV除去杂质，再以80％质量浓度食用乙醇以2.0BV/h流速洗脱4BV，收集洗脱液，并减压浓缩至无醇味(回收食用乙醇)，于-38℃、-0.09MPa下真空冷冻干燥24h。经液相色谱检测根皮苷含量，根皮苷纯度为30.7％，得率为73.8％。

Claims (7)

1.一种分离制备多穗石柯根皮苷单体的方法，其特征在于：该方法步骤如下：

a、0.2μm膜孔径的微滤膜澄清处理多穗石柯提取液：将多穗石柯提取液用0.2μm微滤膜进行微滤澄清，并在滤液重为多穗石柯提取液重的80-90％时，于提取液中加入为10-20％提取液重的纯水透析一次，合并滤液和透析液，得澄清液；

b、截留分子量为2500Da的超滤膜初步分离澄清液中的根皮苷：将上述微滤澄清液采用截留分子量为2500Da的超滤膜进行超滤，并在滤液重为澄清液重的80-90％时，于澄清液中加入10-20％澄清液重的纯水透析一次，合并滤液和透析液，得超滤分离液，将分离液减压浓缩，得到的浓缩液加1.0-1.5倍纯水进行稀释，以作为ADS-7树脂进一步纯化的原料液；

c、ADS-7树脂进一步分离纯化制备多穗石柯根皮苷单体：将4-6BV上述原料液以2-3BV/h流速对ADS-7树脂进行上样，上样完毕后静置30min，先用2BV质量浓度为20-40％的食用乙醇淋洗，再用2-4BV质量浓度为70-90％的食用乙醇以1.5-2.5BV/h流速洗脱，收集洗脱液，将洗脱液减压浓缩、回收食用乙醇，得到的浓缩液趁热过滤，结晶，真空冷冻干燥，即得根皮苷单体。

2.如权利要求1所述的一种分离制备多穗石柯根皮苷单体的方法，其特征在于：所述步骤a中的多穗石柯提取液是将多穗石柯原料于55-65℃干燥至含水量低于6％，以70-80％质量浓度的食用乙醇为提取溶剂，按1g多穗石柯加20-40mL食用乙醇的比例，于多穗石柯原料中加入食用乙醇超声辅助提取30-40min，取提取液。

3.如权利要求2所述的一种分离制备多穗石柯根皮苷单体的方法，其特征在于：所述超声辅助提取时的超声频率为50HZ。

4.如权利要求1所述的一种分离制备多穗石柯根皮苷单体的方法，其特征在于：所述步骤a中微滤澄清时的温度为40-50℃，压力为0.25-0.35MPa。

5.如权利要求1所述的一种分离制备多穗石柯根皮苷单体的方法，其特征在于：所述步骤b中超滤时的温度为30-40℃，压力为1.5-2.0MPa。

6.如权利要求1所述的一种分离制备多穗石柯根皮苷单体的方法，其特征在于：所述步骤b和步骤c中减压浓缩时的真空度为-0.05～-0.09MPa，温度为50～60℃。

7.如权利要求1所述的一种分离制备多穗石柯根皮苷单体的方法，其特征在于：所述步骤c中真空冷冻干燥时的真空度为-0.05～-0.09MPa，温度为-38～-42℃。