CN104857039B - 当归藤在制备治疗阿尔兹海默病药物方面的用途 - Google Patents
当归藤在制备治疗阿尔兹海默病药物方面的用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及当归藤的用途,即当归藤在制备治疗阿尔兹海默病药物方面的用途,特别是当归藤提取物及当归藤总黄酮在制备治疗阿尔兹海默病药物方面的用途。
Description
技术领域
本发明涉及当归藤的用途,特别是当归藤提取物及当归藤总黄酮的用途,即在制备治疗阿尔兹海默病药物方面的用途。
背景技术
阿尔茨海默病(AD)是老年期痴呆中最常见的类型之一,是一种神经退行性疾病,临床表现为进行性学习记忆、认知功能减退、行为异常、日常生活能力下降及情感、思维障碍等,其特征性病理变化为大脑皮层萎缩,并伴有β淀粉样蛋白沉积,神经原纤维缠结,大量记忆性神经元数目减少,以及老年斑的形成。目前研究提出AD发病机制学说有:胆碱能功能低下假说、炎症或免疫假说、基因突变假说、淀粉样蛋白假说、氧化应激及兴奋性毒性假说和凋亡假说等。淀粉样蛋白假说是目前公认的AD发生的最主要原因。该学说认为,沉积在神经元周围的β淀粉样蛋白(βamyloid beta peptide,Aβ)通过诱导细胞凋亡造成AD神经元丢失,Aβ分子的β片层结构可以促进Aβ聚集成不溶性纤维,不易被蛋白酶降解,进一步形成极难溶的沉淀,由此生成老年斑,淀粉样斑块部位氧化应激升高而造成老化损伤,这种经毒性损伤会促使老年痴呆症出现特征性病理变化。形成这种变化的直接原因是β淀粉样蛋白的过度表达。目前针对Aβ的神经毒作用的防治措施主要有以下几方面:减少Aβ的产生;促进Aβ的降解和清除;防止Aβ的聚集和沉积;抗氧化应激等。
当归藤(Embelia parviflora Wall)系紫金牛科花酸藤子属植物,又称小花酸藤子、大力王、筛其强,为常绿木质藤本,以其干燥的藤或根入药,主要分布广西(龙州、大新、天等、百色、河池)、广东、贵州、云南等地。其性味苦、涩、平。壮医认为当归藤具有通龙路火路、补血调经、益精壮阳、强腰膝的功能,是常用壮药品种,用于勒内(贫血)、京瑟(闭经)、月经不调、隆白呆(带下)、发旺(风湿骨痛)、腰腿痛、胸肋痛、胃痛、慢性肠炎、产后腹痛、卟艮裆(不孕症)等,属抗风湿要药。广西特产中成药“桂龙药膏”以该药材为原料。
广西中医学院学报发表的“当归藤化学成分的预试验研究”发现,当归藤中可能含有糖类、苷类、酚类、鞣质、皂苷、有机酸类、黄酮类、三萜类、甾体类、挥发油及油脂等成分。
据“当归藤不同部位挥发油成分GC-MS分析”《安徽农业科学》卢森华等人研究报道,当归藤根、茎、叶挥发油中均含有2-正戊基呋喃、肉豆蔻酸、棕榈酸和亚油酸,根中含量最高为亚油酸,茎中含量最高为棕榈酸。
“当归藤中总皂苷的提取工艺研究”《时珍国医国药》刘静等人在对当归藤化学成分的研究中,分离得到大量皂苷类化合物,其主要成分为百两金皂苷B。皂苷类化合物常具有较好的抗肿瘤活性,而百两金皂苷B作为中药百两金的重要成分之一,对肿瘤细胞MCF-7,NCI-H460和SF-268具有很强的细胞毒活性。
“紫外分光光度法测定当归藤中儿茶素含量”《安徽农业科学》管海波等在对当归藤化学成分的研究过程中,分离得到大量的儿茶素。儿茶素具有抑菌、消炎、抑制肿瘤、抗氧化、抗衰老、抗畸变、降血压、降血脂、降血糖、防辐射等多种保健功能。
目前没有文献资料提到紫金牛科植物当归藤、当归藤提取物或当归藤总黄酮可用于治疗阿尔兹海默病。
发明内容
本发明的目的是提供当归藤在制备治疗阿尔兹海默病药物方面的新用途;
本发明的另一目的是提供当归藤提取物在制备治疗阿尔兹海默病药物方面的新用途;
本发明的另一目的是提供当归藤总黄酮在制备治疗阿尔兹海默病药物方面的新用途;
本发明的另一目的是提供当归藤提取物的制备方法;
本发明的另一目的是提供当归藤总黄酮的制备方法。
本发明的目的是通过下列的技术方案实现的:
本发明原料来源:
当归藤:系紫金牛科花酸藤子属植物Embelia parviflora Wall,又称小花酸藤子、大力王、筛其强,为常绿木质藤本,以其干燥的藤或根入药,主要分布广西(龙州、大新、天等、百色、河池)、广东、贵州、云南等地。性味苦、涩、平。
发明人在研究阿尔兹海默病的治疗过程中发现,紫金牛科植物当归藤特别是当归藤所含总黄酮表现出能抑制痴呆小鼠脑内β淀粉样蛋白的表达,减少自由基对神经的损伤,实现了对阿尔兹海默氏病病理进程的干预和病理症状的显著改善,从而有效治疗阿尔兹海默病。
AD发病机理复杂,Aβ生成与活性氧产生之间具有明显相互促进效应。脑老化过程中,神经细胞膜不饱和脂肪酸被氧化产生大量自由基,损伤神经细胞,Aβ聚集成不溶性纤维,沉淀,生成老年斑,淀粉样斑块部位氧化应激升高。SOD是机体清除自由基的重要酶类,其作用主要是催化生物氧化产生超氧自由基,清除并阻止由氧自由基引发的自由基连锁反应。MDA是自由基对生物细胞膜损伤的主要代谢产物,能使生物膜变性、坏死,使DNA发生突变、交链,同时使SOD活性降低,而造成自由基连锁反应的恶性循环。在研究中发现,当归藤提取物及当归藤总黄酮能明显抑制D-半乳糖所致的痴呆小鼠脑组织MDA含量的增加,能提高痴呆小鼠脑组织的SOD活性,抑制痴呆小鼠脑内β淀粉样蛋白的表达,表明当归藤提取物、当归藤总黄酮对AD小鼠病理变化具有明显的改善作用。
当然,当归藤提取物、当归藤总黄酮对AD大鼠的保护作用可能是一个复杂的机制,其通过抗自由基、抑制β淀粉样蛋白的表达治疗阿尔茨海默病只是其中之一,具体机制还需做进一步研究。虽然目前对其具体作用机制还不完全明了,但当归藤提取物、当归藤总黄酮对AD模型动物脑损伤、神经元退变都具有较好的治疗及保护作用,其对AD等神经元退变疾病的防治提供了另一种启示。
本发明专利临床应用的安全性较高,在治疗阿尔兹海默病的药物治疗中不失为一种好药,其拓宽了治疗阿尔兹海默病的新方法,同时为患者解决了现有技术治疗阿尔兹海默病时出现的不良反应。
因此,申请人提供当归藤、当归藤提取物、当归藤总黄酮能够用于治疗阿尔兹海默病药物方面的新用途。
本发明还公开了当归藤提取物在制备治疗阿尔兹海默病药物的应用,所述当归藤提取物的制备包括以下步骤:
当归藤粉碎,加入浓度为60-80%乙醇50-70℃水浴提取2-3次,每次乙醇用量为药材总重量8-12倍,每次提取时间为40-60min,合并提取液,浓缩,过滤,浓缩,干燥,得当归藤提取物。
本发明公开的当归藤总黄酮在制备治疗阿尔兹海默病药物的应用,所述当归藤总黄酮通过以下步骤制备:
当归藤粉碎,加入浓度为50-80%乙醇微波提取2-3次,每次乙醇用量为药材总重量8-15倍,每次提取时间为10-20min,合并提取液,浓缩,过滤,滤液过弱酸性阳离子交换树脂吸附后,用浓度为60-80%乙醇洗脱,洗脱液浓缩、真空干燥,得当归藤总黄酮。
本发明公开的当归藤总黄酮在制备治疗阿尔兹海默病药物的应用,所述当归藤总黄酮还可以通过以下步骤制备:
当归藤粉碎,加入浓度为60%乙醇,用780W微波提取2-3次,每次乙醇用量为药材总重量12倍,每次提取时间为15min,合并提取液,减压浓缩,加硅藻土过滤,滤液过ADS17树脂吸附,用70%乙醇洗脱,洗脱液浓缩、真空干燥,得当归藤总黄酮。
本发明提供的当归藤、当归藤提取物、当归藤总黄酮用于治疗阿尔兹海默病药物方面的新用途具有以下优点:
1、当归藤、当归藤提取物、当归藤总黄酮从紫金牛科花酸藤子属当归藤中而得,安全无毒,可长期服用。
2、动物实验结果显示:在小鼠避暗实验中,服用本发明的小鼠与模型组小鼠比,避暗潜伏期明显延长,逃避潜伏期明显缩短;Morris水迷宫实验中,服用本发明的小鼠逃避潜伏期明显缩短,停留原平台象限时间和穿越原平台次数均多于模型组;与模型组小鼠比较,使用本发明的小鼠脑组织内Aβ淀粉样蛋白、MDA的含量均显著降低,SOD活性显著增加,表明当归藤提取物及当归藤总黄酮均有效抑制了痴呆模型小鼠Aβ淀粉样蛋白、MDA的表达,增加了SOD活性,对脑神经损伤有保护作用,痴呆小鼠的学习、记忆力明显改善,提示本发明对于临床治疗阿尔兹海默病等老年性疾病药物的开发研究及临床治疗具有肯定性参考意义。
具体实施方式
下面通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是,本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。除非另有说明,本发明中的乙醇量的百分数是体积百分数,v/v表示溶液的体积比。
实施例1:当归藤提取物的制备
取10kg当归藤粉碎,加入浓度为80%的乙醇水浴提取3次,每次的乙醇用量分别为药材总重量的12倍、10倍、8倍,水浴温度为70℃,每次提取时间分别为60min、50min、40min,合并提取液,浓缩,过滤,干燥,得当归藤提取物。
以芦丁作对照品,测当归藤总黄酮得率为0.35%。
实施例2:当归藤总黄酮的制备
取10kg当归藤粉碎,加入浓度为80%的乙醇,用780W微波提取2-3次,每次乙醇用量为药材总重量的12倍,每次提取时间为15min,合并提取液,减压浓缩,加硅藻土过滤,滤液过ADS17树脂吸附,用70%乙醇洗脱,洗脱液浓缩、真空干燥,得当归藤总黄酮。
以芦丁作对照品,测当归藤总黄酮得率为0.49%。
实施例3:当归藤总黄酮的制备
取10kg当归藤粉碎,加入浓度为60%的乙醇微波提取3次,每次乙醇用量分别为药材总重量的15倍、10倍、8倍,每次提取时间分别为20min、15min、10min,合并提取液,浓缩,过滤,滤液过ADS17树脂吸附,用浓度为80%的乙醇洗脱,洗脱液浓缩、真空干燥,得当归藤总黄酮。
以芦丁作对照品,测当归藤总黄酮得率为0.66%。
实施例4:当归藤总黄酮的制备
取10kg当归藤粉碎,加入浓度为50%的乙醇微波提取2次,每次乙醇用量为药材总重量的8倍,每次提取时间为10min,合并提取液,浓缩,过滤,滤液过ADS17树脂吸附,用浓度为50%的乙醇洗脱,洗脱液浓缩、真空干燥,得当归藤总黄酮。
以芦丁作对照品,测当归藤总黄酮得率为0.45%。
实施例5:当归藤提取物的制备
取10kg当归藤粉碎,加入浓度为60%的乙醇水浴提取2次,每次的乙醇用量为药材总重量的8倍,水浴温度为50℃,每次提取时间为40min,合并提取液,浓缩,过滤,干燥,得当归藤提取物。
以芦丁作对照品,测当归藤总黄酮得率为0.32%。
药效实验:对AD小鼠记忆能力的影响
1实验材料
动物
SPF级昆明小鼠,2月龄,雌雄各半,25~30g,由广西梧州制药(集团)股份有限公司动物实验中心提供。
仪器
YLS-17B避暗穿梭测试仪(济南益延科技发展有限公司);
Morris水迷宫XR-XM和Super Maze动物行为学视频分析软件(上海欣软信息科技有限公司)。
试剂
D-半乳糖(上海恒信化学试剂有限公司),小鼠总β淀粉样蛋白(Aβ)Elisa试剂盒(上海博耀生物科技有限公司),超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒,由南京建成生物工程研究所提供。
2实验方法
2.1模型建立及给药
60只小鼠随机分为对照组、模型组、阳性组、实施例1组、实施例2组和实施例3组,每组10只,雌雄各半。除对照组外,其他各组均每天颈背部皮下注射2%D-半乳糖生理盐水溶液140mg/kg,对照组每天颈背部皮下注射等量的生理盐水,连续注射6周。造模2周后,开始灌胃给药,实施例1-3组剂量为150mg/kg(以制备所得的干粉计,临用前用质量浓度为0.2%羧甲基纤维素钠配制成浓度为10mg/ml),阳性组给予维生素E 50mg/kg/d灌胃,对照组与模型组每天灌服等量生理盐水,连续用药4周。
2.2避暗实验
正式实验前对各组小鼠进行训练,将小鼠头背着洞口放入明室,先适应环境3min,然后给暗室铜栅通36V电流,小鼠进入暗室后受到电击即逃到明室,铜栅持续通电5min,此为训练过程。24h后进行小鼠的记忆测验,记录小鼠第一次进入暗室的时间(避暗潜伏期),若小鼠5min内仍未进入暗室,其潜伏期计作300s。
2.3Morris水迷宫实验
隐蔽平台试验:避暗实验结束后,进行Morris水迷宫实验。水迷宫为直径100cm,高50cm的圆形水池,水池内壁被漆为黑色,池内水深25cm,水温保持在(22±2)℃,房间内光照恒定,无光线直射在水池内。池壁上以4个等距离点将水池分为4个象限,任选其中1个象限,正中放置1个圆形黑色安全平台,直径为12cm,高24cm,位于水面下1cm。迷宫上方安置连接显示系统的摄像机,同步记录大鼠运动轨迹。采用Morris水迷宫视频分析系统进行信息处理。实验历时5d,每天上下午各1次,入池位置为平台所邻2个象限的池壁中点。将小鼠面向池壁分别从入水点放入水中,记录其在100s内寻找到平台的时间(逃避潜伏期)。如果小鼠在100s未找到平台,则由实验者用手牵引其至平台上,停留10s,逃避潜伏期记成100s。每天以两次潜伏期算术均值作为这一天的成绩进行统计分析。
探索试验:撤除平台,任选1个入水点将小鼠放入水中,使小鼠在无平台情况下寻找记忆中平台,记录其100s内的游泳轨迹,计算其在原平台象限游泳时间和穿越原平台次数。
2.4脑组织Aβ、SOD、MDA含量测定
探索实验结束后次日,脱颈椎处死动物,在冰台上快速取出小脑组织并置于冰生理盐水中漂洗,除去血迹,滤纸拭干,精确称重后,将小脑组织迅速浸入9倍量冷生理盐水中,用匀浆器在冰浴中充分碾磨,制成10%脑组织匀浆,以3000rpm离心10min,取上清液待用。按试剂盒说明书方法测定Aβ、SOD、MDA含量。
3.统计方法
所有结果用SPSS.13统计软件进行统计学处理,计量资料用均数加减标准差表示,组间比较采用t检验。
4.实验结果
4.1各组小鼠避暗实验结果比较见表1。
表1.各组小鼠避暗潜伏期的比较
注:与对照组比较,**P<0.01;与模型组比较,#P<0.05,##P<0.01。
从表1可见,与对照组小鼠相比,模型组小鼠的避暗潜伏期明显缩短(P<0.01),表明模型组小鼠出现了记忆障碍;而实施例1-3组及VE治疗组小鼠与模型组小鼠比,避暗潜伏期明显延长(P<0.01或P<0.05),表明当归藤提取物及当归藤总黄酮均可明显改善痴呆模型小鼠的记忆障碍。
4.2各组小鼠隐蔽平台试验结果比较见表2。
表2.各组小鼠逃避潜伏期的比较
注:与对照组比较,**P<0.01;与模型组比较,#P<0.05,##P<0.01。
从表2可见,隐蔽平台试验从第1天起,模型组小鼠的逃避潜伏期明显长于正常组;阳性组和实施例1-3组痴呆小鼠逃避潜伏期明显缩短,表明当归藤提取物及当归藤总黄酮均可明显改善痴呆小鼠的学习记忆能力。
4.3各组小鼠探索试验结果比较,见表3。
表3.各组小鼠探索试验结果比较
注:与对照组比较,**P<0.01;与模型组比较,#P<0.05,##P<0.01。
表3结果显示,撤除平台后,观察小鼠的空间探索能力,发现模型组小鼠基本围绕池壁游泳,其运动轨迹呈随机分布于各象限之中;而实施例1-3组和阳性组小鼠的停留原平台象限时间和穿越原平台次数均多于模型组,表明当归藤提取物及当归藤总黄酮均能增强痴呆小鼠的记忆能力。
4.4各组小鼠脑组织Aβ淀粉样蛋白、MDA含量和SOD活力比较
表4.各组小鼠脑组织Aβ淀粉样蛋白、MDA含量和SOD活力比较
注:与对照组比较,**P<0.01;与模型组比较,#P<0.05,##P<0.01。
从表4可见,与对照组比较,模型组小鼠脑组织中Aβ淀粉样蛋白、MDA的含量显著增加(P<0.01),SOD活性显著降低(P<0.01);与模型组小鼠比较,实施例1-3组及阳性组小鼠脑组织内Aβ淀粉样蛋白、MDA的含量均显著降低(P<0.05或P<0.01),SOD活性显著增加(P<0.05或P<0.01),表明当归藤提取物及当归藤总黄酮均有效抑制了痴呆模型小鼠Aβ淀粉样蛋白、MDA的表达,增加了SOD活性,对脑神经损伤有保护作用。
5.讨论
本实验以D-半乳糖给小鼠颈背皮下注射制备痴呆小鼠模型,利用避暗、Morris水迷宫等行为学实验观察D-半乳糖对小鼠记忆能力的影响,结果发现模型组小鼠的学习、记忆能力明显减退,且脑组织MDA含量明显增加、SOD活性明显降低,β淀粉样蛋白形成增加。而给予当归藤提取物及当归藤总黄酮治疗后的痴呆小鼠,学习、记忆力明显改善,脑组织氧自由基的清除率提升,β淀粉样蛋白生成减少,提示本发明对AD小鼠神经损伤具有保护作用,对于临床治疗阿尔兹海默病等老年性疾病药物的开发研究及临床治疗都具有肯定性参考意义。
总体实验效果显示,本发明可有效治疗阿尔兹海默病,治疗效果最优为当归藤总黄酮,当归藤提取物次之,但两者均显示出显著的治疗效果。
虽然,上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验,对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (5)
1.当归藤提取物在制备治疗阿尔兹海默病药物方面的用途,其特征在于,所述当归藤提取物通过以下步骤制备而得:当归藤粉碎,加入浓度为60-80%乙醇50-70℃水浴提取2-3次,每次乙醇用量为药材总重量8-12倍,每次提取时间为40-60min,合并提取液,浓缩,过滤,浓缩,干燥,得当归藤提取物。
2.当归藤总黄酮在制备治疗阿尔兹海默病药物方面的用途,其特征在于,所述当归藤总黄酮通过以下步骤制备而得:当归藤粉碎,加入浓度为50-80%乙醇微波提取2-3次,每次乙醇用量为药材总重量8-15倍,每次提取时间为10-20min,合并提取液,浓缩,过滤,滤液过弱酸性阳离子交换树脂吸附后,用浓度为60-80%乙醇洗脱,洗脱液浓缩、真空干燥,得当归藤总黄酮。
3.当归藤总黄酮在制备治疗阿尔兹海默病药物方面的用途,特征在于所述当归藤总黄酮通过以下步骤制备而得:当归藤粉碎,加入浓度为60%乙醇,用780W微波提取2-3次,每次乙醇用量为药材总重量12倍,每次提取时间为15min,合并提取液,减压浓缩,加硅藻土过滤,滤液过ADS17树脂吸附,用70%乙醇洗脱,洗脱液浓缩、真空干燥,得当归藤总黄酮。
4.当归藤提取物与医药学上可接受的载体配合成组合物在制备治疗阿尔兹海默病药物方面的用途,其特征在于,所述当归藤提取物通过以下步骤制备而得:当归藤粉碎,加入浓度为60-80%乙醇50-70℃水浴提取2-3次,每次乙醇用量为药材总重量8-12倍,每次提取时间为40-60min,合并提取液,浓缩,过滤,浓缩,干燥,得当归藤提取物。
5.当归藤总黄酮与医药学上可接受的载体配合成组合物在制备治疗阿尔兹海默病药物方面的用途,其特征在于,所述当归藤总黄酮通过以下步骤制备而得:当归藤粉碎,加入浓度为50-80%乙醇微波提取2-3次,每次乙醇用量为药材总重量8-15倍,每次提取时间为10-20min,合并提取液,浓缩,过滤,滤液过弱酸性阳离子交换树脂吸附后,用浓度为60-80%乙醇洗脱,洗脱液浓缩、真空干燥,得当归藤总黄酮。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |