CN104844664B - 一种黄绿蜜环菌子实体核苷类组分的前处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种黄绿蜜环菌子实体核苷类组分的前处理方法，该方法包括以下步骤：⑴提取：黄绿蜜环菌子实体粉碎后加入分析纯水进行提取，经过滤、减压干燥至膏状，获得黄绿蜜环菌子实体水提物；⑵醇沉：黄绿蜜环菌子实体水提物中加入水进行溶解，然后进行醇沉、过滤、减压干燥得棕黄色浸膏；⑶树脂柱色谱富集：棕黄色浸膏中加入乙醇溶液溶解，并经树脂柱分离，分别以水溶液、乙醇溶液进行梯度洗脱，各洗脱物经减压干燥后分别得到20%乙醇溶液洗脱物、50%乙醇溶液洗脱物、75%乙醇溶液洗脱物及95%乙醇溶液洗脱物，即得核苷类目标组分。本发明工艺简单、易规模化实施、重复性、质量稳定可控。
Description
技术领域
本发明涉及药物化学及生物医药技术领域，尤其涉及一种黄绿蜜环菌子实体核苷类组分的前处理方法。
背景技术
黄绿蜜环菌，俗称黄蘑菇，是高山草地珍稀野生真菌的代表。黄绿蜜环菌子实体中含丰富的蛋白质、氨基酸、维生素、矿物质、挥发油及多糖等营养成分，特别是“硒”的含量很高，是极佳的高原珍品之一。研究表明黄绿蜜环菌子实体具有较好的抗氧化和抗肿瘤活性。目前，从黄绿蜜环菌子实体中分离鉴定出的化学成分主要有核苷类及甾醇类，其中核苷类化合物有望成为该原料的指标性化学成分，也是其主要抗氧化活性成分之一。
目前，已报道从黄绿蜜环菌中分离出抗氧化活性组分（李世峰，陈桂琛，毕玉蓉.两种野生食用菌抗氧化及抗肿瘤活性研究，中国食用菌. 2004, 24(3): 58-63），研究报道采用多次溶剂分配法得到具有良好的抗氧化活性的醇溶性组分及水溶性多糖组分，其中溶剂分配次数为4~12次，过程较繁琐、不适于规模化生产。而有关黄绿蜜环菌子实体核苷类组分的前处理方法的研究未见文献报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种工艺简单、易规模化实施、重复性、质量稳定可控的黄绿蜜环菌子实体核苷类组分的前处理方法。
为解决上述问题，本发明所述的一种黄绿蜜环菌子实体核苷类组分的前处理方法，包括以下步骤：
⑴提取：黄绿蜜环菌子实体粉碎后，按1kg：4~8L 的料液比加入分析纯水，在60℃~95℃下提取1~3 h后过滤，重复1~3次，合并得到滤液A；该滤液A经减压干燥至膏状，获得黄绿蜜环菌子实体水提物；
⑵醇沉：所述黄绿蜜环菌子实体水提物中加入其质量的2~5倍的水进行溶解，然后加入所述黄绿蜜环菌子实体水提物质量的5~10倍的体积分数为60%~95%的乙醇溶液醇沉，过滤，重复1~3次，合并得到滤液B；该滤液B经减压干燥得棕黄色浸膏；
⑶树脂柱色谱富集：所述棕黄色浸膏中加入其质量的2~5倍的体积分数为5~20%的乙醇溶液溶解，并经树脂柱进行分离后，分别以水溶液、体积分数为的20%乙醇溶液、体积分数为50%的乙醇溶液、体积分数为75%的乙醇溶液、体积分数为95%的乙醇溶液按2~5倍的柱体积进行梯度洗脱，各洗脱物经减压干燥后分别得到20%乙醇溶液洗脱物、50%乙醇溶液洗脱物、75%乙醇溶液洗脱物及95%乙醇溶液洗脱物，即得核苷类目标组分。
所述步骤⑴和所述步骤⑵及所述步骤⑶中的减压干燥条件是指真空度为0.06~0.09 MPa，温度为50~65 ℃。
所述步骤⑶中的树脂柱是指HP20型树脂柱、HP20SS型树脂柱或MCI型树脂柱中的一种。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明采用水提，可直接将黄绿蜜环菌子实体中脂溶性成分和水溶性成分分开，不但成本廉价，且易规模化实施。
2、本发明采用醇沉处理，可有效去除样品中多糖及蛋白等生物大分子。
3、本发明原料要求不高，一般市场上原材料即可，易于批量备料。
4、本发明树脂柱可以再生循环使用，同时树脂有脱色的功效，且回收率较高。
5、本发明工艺简单，采用树脂柱可获得四个核苷类组分，该四个核苷类组分经抗氧化活性测试实验，发现均具有抗氧化活性，可作为有效成分按常规方法与药学上可接受的任何载体制成各类药用制剂，或按常规方法与食品科学上可接受的任何载体制成各类保健类食品。
本实验利用已建立的体外细胞抗氧化药物筛选模型评估各核苷类组分的相对抗氧化能力，以已知天然抗氧化剂特丁基对苯二酚（TBHQ）作为对照，通过检测试验组与对照组细胞中荧光素酶的活性，计算出相同剂量条件下黄绿蜜环子实体前处理核苷类组分抗氧化能力与TBHQ 的抗氧化能力的倍数关系，检测结果直观、易判断。体外细胞抗氧化药物筛选模型参照公开号为102899351A的中国发明专利“一种抗氧化剂或化学预防剂筛选细胞系及其构建和应用”。
将经过筛选的对数生长期Hek293-ARE细胞经胰酶消化、计数后接种于96孔细胞培养板中，每孔细胞数约为2×104个，在 37℃，5%的CO2培养箱中培养24 h。为避免边缘效应，周围孔加入PBS；每孔等量补充培养基。然后加入黄绿蜜环菌子实体前处理核苷类目标组分，每孔加入相应浓度样品，使得各样品终浓度为20~50mg/mL，每个浓度设3个重复；加阳性对照药物特丁基对苯二酚（TBHQ），阳性对照终浓度同样为20~50mg/mL，同时设空白对照，阳性对照与空白对照都设置5个重复。将加入了测试样品、对照品以及空白对照的细胞培养板放置在37℃，5% CO2培养箱，继续培养24h，使用Steady-Glo®荧光素酶检测试剂盒检测各培养孔细胞中荧光素酶的活性。计算黄绿蜜环菌子实体各试验组分相对抗氧化活性（抗氧化活性是特丁基对苯二酚活性的倍数）：相对抗氧化活性(%)=(测试组光强值-空白对照光强值)/(阳性对照光强值-空白对照光强值)×100%。各实施例得到的黄绿蜜前处理核苷类组分的相对抗氧化活性检测数据如图1所示。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1为本发明所得黄绿蜜环菌子实体前处理核苷类组分活性测试。
具体实施方式
实施例1 一种黄绿蜜环菌子实体核苷类组分的前处理方法，包括以下步骤：
⑴提取：黄绿蜜环菌子实体粉碎后，按1kg：4 L的料液比加入分析纯水，在95℃下提取3 h后过滤，重复3次，合并得到滤液A；该滤液A经减压干燥至膏状，获得黄绿蜜环菌子实体水提物。
其中：减压干燥条件是指真空度为0.06 MPa，温度为65 ℃。
⑵醇沉：黄绿蜜环菌子实体水提物中加入其质量的2倍的水进行溶解，然后加入黄绿蜜环菌子实体水提物质量的10倍的体积分数为60%的乙醇溶液醇沉，过滤，重复3次，合并得到滤液B；该滤液B经减压干燥得86.2 g棕黄色浸膏。
其中：减压干燥条件是指真空度为0.06 MPa，温度为65 ℃。
⑶树脂柱色谱富集：棕黄色浸膏中加入其质量的5倍的体积分数为5%的乙醇溶液溶解，并经HP20型树脂柱进行分离后，分别以水溶液、体积分数为的20%乙醇溶液、体积分数为50%的乙醇溶液、体积分数为75%的乙醇溶液、体积分数为95%的乙醇溶液按2倍的柱体积进行梯度洗脱，各洗脱物经减压干燥后分别得到4.3 g 的20%乙醇溶液洗脱物、9.8 g 的50%乙醇溶液洗脱物、3.6 g 的75%乙醇溶液洗脱物及2.9 g 的95%乙醇溶液洗脱物，即得核苷类目标组分。
其中：减压干燥条件是指真空度为0.06 MPa，温度为65 ℃。
所得黄绿蜜环菌子实体核苷类组分经二维制备色谱进一步分离纯化及NMR碳谱、氢谱分析，依次判定主要含有尿嘧啶核苷、鸟嘌呤核苷、次黄苷及腺苷及其他核苷类化合物。
实施例2 一种黄绿蜜环菌子实体核苷类组分的前处理方法，包括以下步骤：
⑴提取：黄绿蜜环菌子实体粉碎后，按0.5kg：4 L的料液比加入分析纯水，在60℃下提取1 h后过滤，重复2次，合并得到滤液A；该滤液A经减压干燥至膏状，获得黄绿蜜环菌子实体水提物。
其中：减压干燥条件是指真空度为0.09 MPa，温度为50 ℃。
⑵醇沉：黄绿蜜环菌子实体水提物中加入其质量的5倍的水进行溶解，然后加入黄绿蜜环菌子实体水提物质量的5倍的体积分数为90%的乙醇溶液醇沉，过滤，重复2次，合并得到滤液B；该滤液B经减压干燥得35.2 g棕黄色浸膏。
其中：减压干燥条件是指真空度为0.09 MPa，温度为50 ℃。
⑶树脂柱色谱富集：棕黄色浸膏中加入其质量的2倍的体积分数为20%的乙醇溶液溶解，并经HP20SS型树脂柱进行分离后，分别以水溶液、体积分数为的20%乙醇溶液、体积分数为50%的乙醇溶液、体积分数为75%的乙醇溶液、体积分数为95%的乙醇溶液按5倍的柱体积进行梯度洗脱，各洗脱物经减压干燥后分别得到1.8 g 的20%乙醇溶液洗脱物、4.3 g的50%乙醇溶液洗脱物、1.6 g 的75%乙醇溶液洗脱物及1.3 g的 95%乙醇溶液洗脱物，即得核苷类目标组分。
其中：减压干燥条件是指真空度为0.09 MPa，温度为50 ℃。
所得黄绿蜜环菌子实体核苷类组分经二维制备色谱进一步分离纯化及NMR碳谱、氢谱分析，依次判定主要含有尿嘧啶核苷、鸟嘌呤核苷、次黄苷及腺苷及其他核苷类化合物。
实施例3 一种黄绿蜜环菌子实体核苷类组分的前处理方法，包括以下步骤：
⑴提取：黄绿蜜环菌子实体粉碎后，按2kg：12 L的料液比加入分析纯水，在80℃下提取2 h后过滤，重复1次，合并得到滤液A；该滤液A经减压干燥至膏状，获得黄绿蜜环菌子实体水提物。
其中：减压干燥条件是指真空度为0.08 MPa，温度为55 ℃。
⑵醇沉：黄绿蜜环菌子实体水提物中加入其质量的3倍的水进行溶解，然后加入黄绿蜜环菌子实体水提物质量的8倍的体积分数为75%的乙醇溶液醇沉，过滤，重复1次，合并得到滤液B；该滤液B经减压干燥得128.0 g棕黄色浸膏。
其中：减压干燥条件是指真空度为0.08 MPa，温度为55 ℃。
⑶树脂柱色谱富集：棕黄色浸膏中加入其质量的3倍的体积分数为15%的乙醇溶液溶解，并经MCI型树脂柱进行分离后，分别以水溶液、体积分数为的20%乙醇溶液、体积分数为50%的乙醇溶液、体积分数为75%的乙醇溶液、体积分数为95%的乙醇溶液按4倍的柱体积进行梯度洗脱，各洗脱物经减压干燥后分别得到6.8 g的 20%乙醇溶液洗脱物、16.2 g 的50%乙醇溶液洗脱物、5.7 g的 75%乙醇溶液洗脱物及4.7 g 的95%乙醇溶液洗脱物，即得核苷类目标组分。
其中：减压干燥条件是指真空度为0.08 MPa，温度为55 ℃。
所得黄绿蜜环菌子实体核苷类组分经二维制备色谱进一步分离纯化及NMR碳谱、氢谱分析，依次判定主要含有尿嘧啶核苷、鸟嘌呤核苷、次黄苷及腺苷及其他核苷类化合物。
Claims (1)
1.一种黄绿蜜环菌子实体核苷类组分的前处理方法，包括以下步骤：
⑴提取：黄绿蜜环菌子实体粉碎后，按1kg：4~8L 的料液比加入分析纯水，在60℃~95℃下提取1~3 h后过滤，重复1~3次，合并得到滤液A；该滤液A经减压干燥至膏状，获得黄绿蜜环菌子实体水提物；所述减压干燥条件是指真空度为0.06~0.09 MPa，温度为50~65 ℃；
⑵醇沉：所述黄绿蜜环菌子实体水提物中加入其质量的2~5倍的水进行溶解，然后加入所述黄绿蜜环菌子实体水提物质量的5~10倍的体积分数为60%~95%的乙醇溶液醇沉，过滤，重复1~3次，合并得到滤液B；该滤液B经减压干燥得棕黄色浸膏；所述减压干燥条件是指真空度为0.06~0.09 MPa，温度为50~65 ℃；
⑶树脂柱色谱富集：所述棕黄色浸膏中加入其质量的2~5倍的体积分数为5~20%的乙醇溶液溶解，并经树脂柱进行分离后，分别以水溶液、体积分数为的20%乙醇溶液、体积分数为50%的乙醇溶液、体积分数为75%的乙醇溶液、体积分数为95%的乙醇溶液按2~5倍的柱体积进行梯度洗脱，各洗脱物经减压干燥后分别得到20%乙醇溶液洗脱物、50%乙醇溶液洗脱物、75%乙醇溶液洗脱物及95%乙醇溶液洗脱物，即得核苷类目标组分；所述减压干燥条件是指真空度为0.06~0.09 MPa，温度为50~65 ℃；所述树脂柱是指HP20型树脂柱、HP20SS型树脂柱或MCI型树脂柱中的一种；所得黄绿蜜环菌子实体核苷类组分主要含有尿嘧啶核苷、鸟嘌呤核苷、次黄苷及腺苷。
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