CN104840421A - 一种长循环胆固醇复合脂质体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明目的在于提供一种长循环胆固醇复合脂质体及其制备方法。本发明所述的长循环胆固醇复合脂质体是由胆固醇复合脂质体形成脂质和长循环功能分子组成的脂双层结构，其表面具有硅酸盐网络结构，疏水内部富含胆固醇。硅酸盐网络结构使其稳定性优于普通脂质体，胆固醇使其具备较好的生物相容性。此外，长循环功能分子的存在可使其血液循环时间显著提高。本发明所述的长循环胆固醇复合脂质体可作为临床治疗剂和医学显影剂的载体，其制备方法简单，成本较低，适合于广泛的推广应用。

Description

一种长循环胆固醇复合脂质体及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种长循环胆固醇复合脂质体及其制备方法。

技术背景

脂质体是一种制备简单，无毒性，无免疫原性反应，可生物降解的药物载体。脂质体在体内能进行药物缓释，易于实现靶向，从而提高疗效。长循环脂质体通常是指表面通常修饰有大分子量的聚乙二醇线性长链结构的脂质体。与普通脂质体相比长循环脂质体在血液中的循环时间显著延长，可延长药物半衰期增强药物疗效。然而在实际应用中脂质体依然存在着诸多缺陷。例如磷脂分子易于氧化水解会使脂质体结构被破坏；进入体内后，脂质体会与一些血液成分，例如白蛋白、调理素、抗体等物质相互作用，可能发生破裂，导致包封药物快速渗漏，不能到达靶向组织。因此，研制出稳定的脂质体是其作为药物载体走向实用的前提，具有十分重要的意义。

复合质体是最近开发的一种新型的有机一无机纳米杂化体，其来源于有机硅氧烷，通过结合溶胶一凝胶和自组装过程制备，在水介质中能形成硅酸盐网络覆盖表面的囊泡(Chemistry Letters，1999，7，661-662)。复合质体具有一个球形脂质双层膜结构，有一个内部的水相，形成结构如同磷脂或合成脂类形成的脂质体(Angewandte ChemieInternationalEdition，1992，31，709-726)，而区别在于其表面还覆盖有硅酸盐网络结构。复合质体由于表面硅酸盐层的存在，有望克服传统脂质体稳定性上的不足。然而之前报道的硅质体其疏水尾部结构为人体外源性物质，不能被代谢利用(Nature Protocols，2006，1，1227-1234)。胆固醇是人体不可缺少的营养物质，是细胞膜的重要组成成分之一，无毒，可被人体代谢利用。

基于以上考虑，本发明人设计一类长循环胆固醇复合脂质体，该类长循环硅质体是由胆固醇复合脂质体形成脂质和长循环功能分子组成的脂质双层囊泡结构。其表面具有硅酸盐网络结构，疏水内部富含胆固醇。硅酸盐网络结构使其稳定性优于普通脂质体，胆固醇使其具备较好的生物相容性。此外，长循环功能分子的存在可使其血液循环时间显著提高。本发明所述的长循环胆固醇复合脂质体可作为临床治疗剂和医学显影剂的载体，其制备方法简单，成本较低，适合于广泛的推广应用。

发明内容

本发明的目的是提供一类由胆固醇复合脂质和长循环功能分子组成的长循环胆固醇复合脂质体。

本发明的另一目的是提供上述长循环胆固醇复合脂质体的制备方法。

本发明所述的长循环胆固醇复合脂质体，其特征在于所述的胆固醇复合脂质体形成脂质可以具有如下结构：

本发明所述的长循环胆固醇复合脂质体，其特征在于所述的胆固醇复合脂质体形成脂质可以具有如下结构：

其中R¹选自C6～C18烷基；R²选自C6～C18烷基；R³选自-CO(CH₂)₂CONH(CH₂)₃Si(X)₃、-CO(CH₂)₃CONH(CH₂)₃Si(X)₃或-CONH(CH₂)₃Si(X)₃，其中X选自乙氧基或甲氧基；a为2或3。

本发明所述的长循环胆固醇复合脂质体，其特征在于所述的胆固醇复合脂质体形成脂质可以具有如下结构：

其中R¹选自C6～C18烷基；R²选自C6～C18烷基；R³选自-CO(CH₂)₂CONH(CH₂)₃Si(X)₃、-CO(CH₂)₃CONH(CH₂)₃Si(X)₃或-CONH(CH₂)₃Si(X)₃，其中X选自乙氧基或甲氧基；a为2或3。

本发明所述的长循环胆固醇复合脂质体，其结构中所包含的长循环功能分子可以是聚乙二醇修饰的磷脂，聚乙二醇修饰的神经节苷酯，聚乙二醇修饰的山梨醇酯，聚乙二醇的各种脂肪酸酯，聚乙二醇-聚乳酸共聚物，聚乙二醇-聚丙交酯共聚物，泊洛沙姆等具有亲水性聚乙二醇结构的两亲分子，也可以是聚乙烯醇修饰的神经节苷酯，聚乙烯醇修饰的山梨醇酯，聚乙烯醇的各种脂肪酸酯，聚乙烯醇-聚乳酸共聚物，聚乙烯醇-聚丙交酯共聚物等具有亲水性聚乙烯醇结构的两亲分子。

本发明所述的长循环功能分子，其特征在于所含有的聚乙二醇或聚乙烯醇的分子量范围为2000-10000。

本发明所述的长循环胆固醇复合脂质体可由乙醇注入法或薄膜水化法制备。

本发明所述的制备长循环胆固醇复合脂质体所采用的乙醇注入法，其过程包括以下步骤：1.将一定摩尔百分比的胆固醇复合脂质体形成脂质和长循环功能分子溶于酸性乙醇中。2.在水浴搅拌下将上述酸性乙醇溶液注入水化介质中经过水浴超声和探头超声即可形成空白长循环胆固醇复合脂质体。

本发明所述的制备长循环胆固醇复合脂质体所采用的薄膜水化法，其过程包括以下步骤：1.将一定摩尔百分比的胆固醇复合脂质体形成脂质和长循环功能分子溶于酸性乙醇中，真空除去有机溶剂并干燥过夜。2.脂质薄膜在水化介质中45℃条件下水浴30分钟，后再经过水浴超声和探头超声即可形成空白长循环胆固醇复合脂质体。

本发明所述的胆固醇复合脂质体形成脂质和长循环功能分子的摩尔百分比，其特征在于胆固醇复合脂质体形成脂质的摩尔百分比可以是95％-99％，长循环功能分子的摩尔百分比可以是5％-1％。

本发明的优势在于长循环胆固醇复合脂质体其表面具有硅酸盐网络结构和亲水性大分子结构。硅酸盐网络结构使其稳定性优于普通脂质体，长循环功能分子使其生物相容性和血液循环时间显著提高。此外，所述的长循环复合脂质体制备方法简单，成本低，可满足产业化的要求。

图1是具体实施例1中使用薄膜水化法所制备的长循环胆固醇复合脂质体的透射电镜图；图2是具体实施例3对应的长循环胆固醇复合脂质体的稳定性实验，图2中(1)长循环胆固醇复合脂质体在不同倍数表面活性剂TX-100存在时的粒径变化，图2中(2)表示传统脂质DSPC制备的脂质体在不同倍数表面活性剂TX-100存在时的粒径变化。图3是长循环胆固醇复合脂质体与人静脉内皮细胞孵育后细胞的活力测定结果。图4代表注射长循环胆固醇复合脂质体后，大鼠血液硅含量和时间的关系图。表一是血液中硅含量的药动学参数。

下面将详细地描述参照本发明的实例，以下实例仅用来说明本发明，而不是限制本发明的范围。

在接下来的实例中，具有以下结构的胆固醇复合脂质体形成脂质(CSS)被选为代表：

长循环功能分子以二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG-2000)为代表。

实施例1薄膜水化法制备长循环胆固醇复合脂质体(CSS：DSPE-PEG-2000的摩尔比为95∶5)

(1)材料和用量：(5.5ml硅质体用量)

CSS：4.5mg，DSPE-PEG-2000∶1mg

(2)制备方法：

根据上面所述，称量各种脂质，胆固醇复合脂质体形成脂质CSS首先在酸性乙醇溶液中水解。在40℃下孵育30分钟后，将含有DSPE-PEG-2000的氯仿溶液加入到在酸性溶液中水解的脂质中并均匀混合。然后将溶剂用旋转蒸发仪去除，在瓶壁上形成薄膜，在真空下进一步干燥过夜。之后，将5.5毫升的超纯水加入到小瓶中，在45℃的水浴中孵育30分钟。将混合物涡旋20分钟，随后用探头超声5-10分钟，直到得到清澈透明的溶液。

实施例2长循环胆固醇复合脂质体的形态

通过透射电子显微镜(TEM)和扫描电子显微镜(SEM)观察长循环胆固醇复合脂质体的形态结构。扫描电子显微镜(SEM)的型号是日立S-3400N，操作电压15kV。透射电子显微镜(TEM)的仪器型号是H-7650，其加速电压为100kV。TEM样品的制备是通过注射颗粒悬浮液(300微摩尔/毫升)到300目的铜网中。孵育10分钟后，样品干后，在室温下用新鲜制备和无菌过滤的4％(W/V)醋酸铀水溶液负染5分钟。然后将铜网用蒸馏水洗涤两次，用仪器观察之前在空气中干燥。其结果如图1所示。微观分析清楚地证实了球形囊泡的形成。

实施例3长循环胆固醇复合脂质体的稳定性

长循环胆固醇复合脂质体的形态稳定性是通过表面活性剂的溶解实验进行评价的。简单地说，将Triton X-100加入到实施例1中所制备的长循环胆固醇复合脂质体悬液中；用DLS测定囊泡的水合直径。结果如图2所示，当近5倍当量的非离子表面活性剂Triton X-100加入到由二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)制备的常规脂质体中，囊泡的水合直径急剧降低，表明囊泡被破坏(曲线b所示)。与此相反，在添加30倍当量的TX-100后DLS分析显示实施例1中制备的复合脂质体大小几乎没有变化(曲线a所示)。这表明，长循环胆固醇复合脂质体具有很高的稳定性。

实施例4长循环胆固醇复合脂质体的生物相容性

在37℃下5％CO₂环境中将人脐静脉内皮细胞以1×10⁴个细胞/孔的密度接种在96孔板中。没有细胞的孔作为空白对照。培养24小时后，将培养基更换为含有不同浓度胆固醇复合脂质体的新鲜培养基。每种浓度加入到三个孔中作为平行对照，无纳米颗粒的孔作为阴性对照。48小时后，20毫升的MTT溶液中加入到每个孔中，并孵育4小时。然后，除去培养基，加入150微升的DMSO溶液。用酶标仪(Multidkan MK3，Thermo)记录在560nm处各孔的吸光度。如图3所示，实例1所制备的长循环胆固醇复合脂质体显示出对人脐静脉内皮细胞很低的细胞毒性。当其浓度达1毫克/毫升时人脐静脉内皮细胞的存活率保持在90％以上。这表明此类长循环胆固醇复合脂质体具有较高的生物相容性。

实施例5长循环胆固醇复合脂质体的半衰期

取雄性Wistar大鼠3只，尾静脉注射生理盐水，5min后，心脏取血，置于肝素处理过的离心管中-20℃冰冻保存，备用。取雄性Wistar大鼠3只，实施颈静脉插管手术，禁食、自由饮水12小时后，尾静脉长循环胆固醇复合脂质体分散液(浓度：20mg/mL，注射剂量：0.5mL/只)。分别于给药后0.01、0.5、1、2、4、8、12、24、36、48h取血，每个时间点采集的血液样本体积为0.3ml，置于肝素处理过的离心管中，-20℃冰冻保存，备用。每采血点血液样品(300μL)，先与1mL高氯酸混合加热至液体全部干燥。然后再与1mL浓硝酸混合，在70℃下加热1h后定容至5mL作为待测液。样品中硅元素含量经电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测定(图4中a代表普通胆固醇硅质体的血液浓度时间曲线；b代表长循环胆固醇复合脂质体的血液浓度时间曲线)。非房室模型动力学参数如血液中硅浓度最大值(Cmax)、血液中硅浓度下降一半所需的时间即半衰期(T_1/2)、硅元素在体内停留的时间即平均驻留时间(MRT)和时间曲线下的面积(AUCtot)等主要参数的分析所用的软件为KineticaTM(表1)。另外用不掺杂长循环功能分子的胆固醇复合脂质体作为对比研究。研究结果表明掺杂有长循环功能分子的胆固醇复合脂质体在大鼠体内有较长的循环时间。

表1

Claims (10)

1.一种长循环胆固醇复合脂质体，其特征在于其组成分为胆固醇复合脂质体形成脂质和长循环功能分子。

2.权利要求1所述的长循环胆固醇复合脂质体，其特征在于所述的胆固醇复合脂质体形成脂质可以具有如下结构：

3.权利要求1所述的长循环胆固醇复合脂质体，其特征在于所述的胆固醇复合脂质体形成脂质可以具有如下结构：

其中R¹选自C₆～C₁₈烷基；R2选自C₆～C₁₈烷基；R³选自-CO(CH₂)₂CONH(CH₂)₃Si(X)₃、-CO(CH₂)₃CONH(CH₂)₃Si(X)₃或-CONH(CH₂)₃Si(X)₃，其中X选自乙氧基或甲氧基；a为2或3。

4.权利要求1所述的长循环胆固醇复合脂质体，其特征在于所述的胆固醇复合脂质体形成脂质可以具有如下结构：

其中R¹选自C₆～C₁₈烷基；R2选自C₆～C₁₈烷基；R³选自-CO(CH₂)₂CONH(CH₂)₃Si(X)₃、-CO(CH₂)₃CONH(CH₂)₃Si(X)₃或-CONH(CH₂)₃Si(X)₃，其中X选自乙氧基或甲氧基；a为2或3。

5.权利要求1所述的长循环胆固醇复合脂质体，其结构中所包含的长循环功能分子可以是聚乙二醇修饰的磷脂，聚乙二醇修饰的神经节苷酯，聚乙二醇修饰的山梨醇酯，聚乙二醇的各种脂肪酸酯，聚乙二醇-聚乳酸共聚物，聚乙二醇-聚丙交酯共聚物，泊洛沙姆等具有亲水性聚乙二醇结构的两亲分子，也可以是聚乙烯醇修饰的神经节苷酯，聚乙烯醇修饰的山梨醇酯，聚乙烯醇的各种脂肪酸酯，聚乙烯醇-聚乳酸共聚物，聚乙烯醇-聚丙交酯共聚物等具有亲水性聚乙烯醇结构的两亲分子。

6.权利要求1或5所述的长循环功能分子，其特征在于所含有的聚乙二醇或聚乙烯醇的分子量范围为2000-10000。

7.权利要求1所述的长循环胆固醇复合脂质体可由乙醇注入法或薄膜水化法制备。

8.权利要求7所述的制备长循环胆固醇复合脂质体所采用的乙醇注入法，其过程包括以下步骤：1.将一定摩尔百分比的胆固醇复合脂质体形成脂质和长循环功能分子溶于酸性乙醇中。2.在水浴搅拌下将上述酸性乙醇溶液注入水化介质中经过水浴超声和探头超声即可形成空白长循环胆固醇复合脂质体。

9.权利要求7所述的制备长循环胆固醇复合脂质体所采用的薄膜水化法，其过程包括以下步骤：1.将一定摩尔百分比的胆固醇复合脂质体形成脂质和长循环功能分子溶于酸性乙醇中，真空除去有机溶剂并干燥过夜。2.脂质薄膜在水化介质中45℃条件下水浴30分钟，后再经过水浴超声和探头超声即可形成空白长循环复合脂质体。

10.权利要求8或9所述的胆固醇复合脂质体形成脂质和长循环功能分子的摩尔百分比，其特征在于胆固醇复合脂质体形成脂质的摩尔百分比可以是95％-99％，长循环功能分子的摩尔百分比可以是5％-1％。