CN104825620B - 一种抗真菌天然活性物质的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种抗真菌天然活性物质的制备方法，属于天然植物制剂技术领域。其特征在于包括以下步骤：1）粉碎混合；2）提取；3）闪蒸浓缩；4）乙醚萃取部位的制备；5）乙酸乙酯萃取部位的制备；6）将步骤4）的乙醚提取物干粉和步骤5）中的乙酸乙酯提取物干粉混合，得到抗真菌天然活性物质。上述一种抗真菌天然活性物质的制备方法，其萃取液分别真空浓缩后得到乙醚萃取物和乙酸乙酯萃取物，这两个萃取部位具有较强的抗植物病原真菌和人体浅表真菌感染的作用，可用作植物源杀菌剂，用于防治真菌感染和人体皮肤真菌感染。

Description

一种抗真菌天然活性物质的制备方法

技术领域

本发明属于天然植物制剂技术领域，具体为一种抗真菌天然活性物质的制备方法。

背景技术

真菌感染可分为浅表真菌感染和深部真菌感染两类，浅表感染是由癣菌侵犯皮肤、毛发、指（趾）甲等体表部位造成的，发病率高，具有一定的危害性。深部真菌感染是由念珠菌和隐球菌侵犯内脏器官及深部组织造成的，发病率低，危害性大。目前常用于防止真菌感染的药物与其他其他化学农药一样，具有毒性及副作用较大，难以降解、容易产生耐药性等缺点，对生态环境和人类健康存在极大的威胁。

植物是生物活性化合物的天然宝库，其产生的次生代谢产物有40万种之多,其中的大多数化学物质如萜烯类、生物碱、类黄酮、甾体、酚类、挥发油和多糖等均具有较强的杀虫或抗菌活性。因此，植物被认为是化学合成杀菌剂替代品最好的开发资源。

小冠薰 Basilicum polystachyon (L.) Moench为唇形科（Labiatae）小冠熏属（Basilicum）植物， 广泛分布于东半球热带地区，包括亚洲、非洲和澳大利亚。该属植物大约有6-7 个种，中国有1个种，见于广东海南及台湾。小冠薰为一年生或多年生草本植物，为一稀少的唇形科植物。文献报道，唇形科植物中常含有萜类、香豆素类、挥发油等成分, 具有广谱抗菌、抗病毒、抗炎镇痛、增强免疫等多种药理作用。

孪花蟛蜞菊Wedelia biflora (Linn.) DC.为菊科(Compositae) 蟛蜞菊属(Wedelia)植物，全世界约60余种，我国有5种。蟛蜞菊属植物全世界多为民间药用，具有保肝利胆、抗病毒、抗炎等功效。对本属植物化学成分的研究显示，本属植物主要含有二萜、倍半萜、黄酮类、挥发油、有机酸类化合物等。

勒党花椒Zanthoxylum avicennae 为芸香科花椒属植物，主要分布于北纬约25°以南地区，生长于低海拔平地、坡地或谷地。我国分布在海南、福建、广东、台湾、广西、云南等南方地区。在海南三亚，勒党花椒资源分布丰富。文献报道芸香科花椒属植物中主要含有挥发油、黄酮、生物碱、香豆素、酰胺等成分，临床上用花椒乙醚提取物或花椒挥发油进行消炎止痛，取得良好的疗效。另据文献报道，花椒属植物对4种深部真菌和11种皮肤癣菌都有一定的抑菌和杀菌作用。 另外发现花椒挥发油可抑制H22肝癌细胞增殖并激发细胞凋亡，推测其具有一定的抗肿瘤作用。

目前外用的杀菌剂大多是适合于喷雾的剂型，其中以乳油和可湿性粉剂为主，当然还有悬浮剂。由于乳油中含有有机溶剂，不但对人畜有毒，会污染环境，且易燃、因此在贮运和使用中均不安全，国外已禁止在蔬菜和果树上使用。粉剂虽然可以直接喷撒使用，但由于不用水，易漂移造成污染环境，有效利用率低，药效期也比较短。近年来出现的水基性新剂型如水溶剂、微乳剂、乳剂、悬浮剂等。而且微乳剂和乳剂正逐步取代乳油。用水取代了有机溶剂，这样制剂中就不含固体填料，减轻了对环境的污染。悬浮剂以水为基质，无粉尘危害，操作安全，正逐步取代可湿性粉剂。微乳剂、乳剂和悬浮剂等杀菌剂新剂型对环境造成的污染小，且对人畜安全，是行之有效的绿色环保剂型。

真菌感染引起的疾病称为真菌病，发病率最高的念珠菌病和皮肤癣菌病由人体正常菌群的真菌引起。真菌感染性皮肤病常见的就是手足体癣，一般传染性较强。如果真菌感染有渗液，可能并发细菌感染。临床上将致病真菌分为浅部真菌和深部真菌。真菌性肠炎即属于深部真菌病。浅部真菌仅侵犯皮肤、毛发和指（趾）甲，而深部真菌能侵犯人体皮肤、黏膜、深部组织和内脏，甚至引起全身播散性感染。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于设计提供一种抗真菌天然活性物质的制备方法的技术方案，其萃取液分别真空浓缩后得到乙醚萃取物和乙酸乙酯萃取物，这两个萃取部位具有较强的抗植物病原真菌和人体浅表真菌感染的作用，可用作植物源杀菌剂，用于防治真菌感染和人体皮肤真菌感染。

所述的一种抗真菌天然活性物质的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）粉碎混合：分别将小冠熏、勒党花椒、孪花蟛蜞菊的干燥物粉碎成粗粉，通过20-40目筛，然后按照重量比1-4:1-4:0.2-2混合均匀；

2）提取：将按照比例混合后的小冠熏、勒党花椒、孪花蟛蜞菊粗粉置于破碎提取器的容器内，按照混合物粗粉1kg则95％含水乙醇的用量为6-10升的比例加入含水乙醇进行室温组织破碎提取2-3次，每次提取时间为1-5分钟；

3）闪蒸浓缩：将提取液抽滤，弃去滤渣，得到的提取液在60-80℃以下采用真空薄膜浓缩装置进行闪蒸浓缩至原体积的1/5-1/8；

4）乙醚萃取部位的制备：将浓缩液分散到水中，水的用量为浓缩液体积的1/2-1/4，然后用乙醚萃取2-5次，乙醚每次用量为浓缩液体积的1-2倍量，静止分层后，分去乙醚层，合并乙醚萃取液，在旋转蒸发仪中，常压蒸馏浓缩，蒸出乙醚，得到乙醚浓缩液；继续将浓缩液进行真空干燥成干粉，用研钵研细后得到乙醚提取物干粉，乙醚提取物收率达到8.5％-14.6％；

5）乙酸乙酯萃取部位的制备：将乙醚萃取后，分出的水层浓缩液，改用乙酸乙酯萃取，用乙酸乙酯萃取2-5次，乙酸乙酯每次用量为浓缩液体积的1-2倍量，静止分层后，分去乙酸乙酯层，合并乙酸乙酯萃取液，在闪蒸浓缩装置中，50-70℃以下真空减压浓缩，蒸出乙酸乙酯，得到乙酸乙酯浓缩液；继续将浓缩液进行真空干燥成干粉，用研钵研细后得到乙酸乙酯提取物干粉，乙酸乙酯提取物收率达到11.7.6％-16.9％；

6）将步骤4）的乙醚提取物干粉和步骤5）中的乙酸乙酯提取物干粉按照重量比1:1-3混合，得到抗真菌天然活性物质。

所述的一种抗真菌天然活性物质的制备方法，其特征在于步骤1）中：小冠熏粗粉、勒党花椒粗粉、孪花蟛蜞菊粗粉的重量比为1-3:1-3:0.5-1.5。

所述的一种抗真菌天然活性物质的制备方法，其特征在于步骤1）中：小冠熏粗粉、勒党花椒粗粉、孪花蟛蜞菊粗粉的重量比为1.5-2.5:1.5-2.5:0.8-1.2。

所述的一种抗真菌天然活性物质的制备方法，其特征在于步骤1）中：小冠熏粗粉、勒党花椒粗粉、孪花蟛蜞菊粗粉的重量比为2:2:1。

所述的一种抗真菌天然活性物质的制备方法，其特征在于步骤2）中：按照混合物粗粉1kg则95％含水乙醇的用量为7-9升的比例加入含水乙醇进行室温组织破碎提取。

所述的一种抗真菌天然活性物质的制备方法，其特征在于步骤3）中：真空浓缩温度为65-75℃，浓缩液浓缩至原体积的1/6-1/7。

所述的一种抗真菌天然活性物质的制备方法，其特征在于步骤4）中：水的用量为浓缩液体积的1/3，乙醚每次用量为浓缩液体积的1.5倍量。

所述的一种抗真菌天然活性物质的制备方法，其特征在于步骤5）中：乙酸乙酯每次用量为浓缩液体积的1.5倍量，真空减压浓缩的温度为55-65℃。

上述一种抗真菌天然活性物质的制备方法，具有以下有益效果：

1）本发明对小冠熏、勒党花椒、孪花蟛蜞菊采用组织破碎提取，其工作原理是将被提取的药材与提取溶剂放入提取容器内，利用高速旋转的特殊刀具将药材破碎剪切至细微颗粒，同时通过实现高速粉碎、剪切、搅拌、振动、混合、渗透、浸渍的结合作用，使药材的植物内部有效成分快速转移至溶剂中并达到溶出平衡，通过过滤实现提取目的。该破碎提取方法实现了粉碎和提取过程的合二为一，粉碎的同时也完成了提取；且整个系统处在一个高速动态的环境之中，在数秒内快速完成提取过程，破碎提取一次仅需几分钟，同时提取过程是室温操作，无需加热，避免了不耐热成分，特别是挥发性成分破坏的可能性，极大地保留了原有的有效成分；通过实验表明，该组织破碎提取方法具有提取快速完全、高效节能，操作简便、维护和清洗方便、有利环保、工作效率较高等优点。采用该方法提取，能将以上天然植物中的大部分有效成分，尤其是挥发油成分提取完全， 提高了抑菌成分的提取率。采用该组织破碎提取方法提取能将小冠熏、勒党花椒、孪花蟛蜞菊中的大部分抑菌成分提取完全；

2）本发明中对小冠熏、勒党花椒、孪花蟛蜞菊采用真空薄膜浓缩装置进行闪蒸浓缩，其基本原理是在减压真空状态下，使待浓缩的液体以细流依次连续进入薄膜蒸发管中，在薄膜蒸发管中受热后形成薄膜，使部分溶剂气化，气化后的蒸汽和浓缩液进入气液分离器分离，达到浓缩目的。使用该浓缩装置浓缩，待浓缩液受热温度较低，被浓缩液体在蒸发管中瞬间受热，溶剂快速蒸发并与浓缩液分离，各自进入回收系统完成浓缩过程，因此受热时间极短，回收的浓缩液温度不超过50℃，有效保护了浓缩液中的热敏性成分不被破坏，溶剂的回收率高等优点。该闪蒸浓缩装置容量大，不受被浓缩液体积大小的限制，可连续循环浓缩，直到浓缩至所需体积。该方法浓缩速度快、受热时间短、效率高，操作简单、使用方便、节能环保，同时最大限度地保留了提取物中的有效成分不被破坏。

3）本发明将小冠熏、勒党花椒、孪花蟛蜞菊植物作为植物源杀菌剂及抗真菌感染的资源，资源丰富，来源广泛易得，从中提取抗真菌活性物质，获得了具有很好抗真菌活性的乙醚萃取物和乙酸乙酯萃取物。所获得的两个部位的萃取物抗真菌（植物病原真菌和人体表皮真菌感染）活性强，防治效果明显，可用作植物源杀菌剂，防治植物病原真菌感染及人体皮肤真菌感染。

4）经过抑菌试验表明，乙醚萃取物对8种植物病原真菌的最低抑菌浓度MIC值在0.977-31.25 μg· mL^-1 之间，特别是对玉米大斑病菌和棉花枯萎病菌；乙酸乙酯萃取物对8种植物病原真菌的最低抑菌浓度MIC值在7.813 -125 μg · mL^-1 之间尤其是对番茄灰霉病菌、小麦赤霉病菌和大麦赤霉病菌，说明两个萃取部位对8种植物病原真菌均具有较强的抑制作用，表明乙醚萃取物和乙酸乙酯萃取物是其主要抑菌作用的活性部位，且具有实用安全、无毒的作用，具有很好的开发应用价值，如果添加复配做成一定的剂型，可以开发成新型的植物源杀菌剂，用于防治多种植物病原真菌感染和人体皮肤真菌感染。

本专利申请中涉及的百分含量均为纯物质的重量百分含量。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明作进一步说明，并结合相应试验进一步说明本发明的有益效果。

实施例1

（1）粉碎混合：分别将小冠熏、勒党花椒、孪花蟛蜞菊的干燥物粉碎成粗粉，通过20目筛，然后按照重量比2:2:1混合。（2）提取：将干燥的小冠熏、勒党花椒、孪花蟛蜞菊粗粉置于破碎提取器的容器内，加入折合原料重量比8倍量的95％含水乙醇进行室温组织破碎提取2次，提取时间为3分钟。（3）闪蒸浓缩：将提取液抽滤，弃去滤渣，得到的提取液在70℃以下采用真空薄膜浓缩装置进行闪蒸浓缩至原体积的1/6。（4）乙醚萃取部位的制备：将浓缩液分散到水中，水的用量为浓缩液体积的三分之一。用乙醚萃取3次，每次用量为浓缩液体积的1.5倍量，静止分层后，分去乙醚层，合并乙醚萃取液，在旋转蒸发仪中，常压浓缩蒸馏，蒸出乙醚，得到乙醚浓缩液。继续将浓缩液进行真空干燥成干粉，用研钵研细后得到乙醚提取物干粉，乙醚提取物收率达到10.8％ （5）乙酸乙酯萃取部位的制备：将乙醚萃取后，分出的水层浓缩液，改用乙酸乙酯萃取。用乙酸乙酯萃取3次，每次用量为浓缩液体积的1.5倍量，静止分层后，分去乙酸乙酯层，合并乙酸乙酯萃取液，在闪蒸浓缩装置中，60℃以下真空减压浓缩，蒸出乙酸乙酯，得到乙酸乙酯浓缩液。继续将浓缩液进行真空干燥成干粉，用研钵研细后得到乙酸乙酯提取物干粉，乙酸乙酯提取物收率达到13.8％。（6）将步骤4）的乙醚提取物干粉和步骤5）中的乙酸乙酯提取物干粉按照重量比1:1混合，得到抗真菌天然活性物质。

实施例2

（1）粉碎混合：分别将小冠熏、勒党花椒、孪花蟛蜞菊的干燥物粉碎成粗粉，通过20目筛，然后按照重量比2:2:1混合。（2）提取：将干燥的小冠熏、勒党花椒、孪花蟛蜞菊粗粉置于破碎提取器的容器内，加入折合原料重量比6 倍量的95％含水乙醇进行室温组织破碎提取 3次，提取时间为2分钟。（3）闪蒸浓缩：将提取液抽滤，弃去滤渣，得到的提取液在70℃以下采用真空薄膜浓缩装置进行闪蒸浓缩至原体积的1/6 。（4）乙醚萃取部位的制备：将浓缩液分散到水中，水的用量为浓缩液体积的三分之一。用乙醚萃取4次，每次用量为浓缩液体积的1 倍量，静止分层后，分去乙醚层，合并乙醚萃取液，在旋转蒸发仪中，常压浓缩蒸馏，蒸出乙醚，得到乙醚浓缩液。继续将浓缩液进行真空干燥成干粉，用研钵研细后得到乙醚提取物干粉，乙醚提取物收率达到11.5％（5）乙酸乙酯萃取部位的制备：将乙醚萃取后，分出的水层浓缩液，改用乙酸乙酯萃取。用乙酸乙酯萃取4次，每次用量为浓缩液体积的1 倍量，静止分层后，分去乙酸乙酯层，合并乙酸乙酯萃取液，在闪蒸浓缩装置中，60℃以下真空减压浓缩，蒸出乙酸乙酯，得到乙酸乙酯浓缩液。继续将浓缩液进行真空干燥成干粉，用研钵研细后得到乙酸乙酯提取物干粉，乙酸乙酯提取物收率达到14.2％。（6）将步骤4）的乙醚提取物干粉和步骤5）中的乙酸乙酯提取物干粉按照重量比1:2混合，得到抗真菌天然活性物质。

实施例3

（1）粉碎混合：分别将小冠熏、勒党花椒、孪花蟛蜞菊的干燥物粉碎成粗粉，通过20目筛，然后按照重量比2:2:1混合。（2）提取：将干燥的小冠熏、勒党花椒、孪花蟛蜞菊粗粉置于破碎提取器的容器内，加入折合原料重量比 10倍量的95％含水乙醇进行室温组织破碎提取2 次，提取时间为3分钟。（3）闪蒸浓缩：将提取液抽滤，弃去滤渣，得到的提取液在70℃以下采用真空薄膜浓缩装置进行闪蒸浓缩至原体积的1/7。（4）乙醚萃取部位的制备：将浓缩液分散到水中，水的用量为浓缩液体积的三分之一。用乙醚萃取5次，每次用量为浓缩液体积的1 倍量，静止分层后，分去乙醚层，合并乙醚萃取液，在旋转蒸发仪中，常压浓缩蒸馏，蒸出乙醚，得到乙醚浓缩液。继续将浓缩液进行真空干燥成干粉，用研钵研细后得到乙醚提取物干粉，乙醚提取物收率达到13.2％（5）乙酸乙酯萃取部位的制备：将乙醚萃取后，分出的水层浓缩液，改用乙酸乙酯萃取。用乙酸乙酯萃取3次，每次用量为浓缩液体积的1倍量，静止分层后，分去乙酸乙酯层，合并乙酸乙酯萃取液，在闪蒸浓缩装置中，60℃以下真空减压浓缩，蒸出乙酸乙酯，得到乙酸乙酯浓缩液。继续将浓缩液进行真空干燥成干粉，用研钵研细后得到乙酸乙酯提取物干粉，乙酸乙酯提取物收率达到14.2％。（6）将步骤4）的乙醚提取物干粉和步骤5）中的乙酸乙酯提取物干粉按照重量比1:3混合，得到抗真菌天然活性物质。

实施例4

（1）粉碎混合：分别将小冠熏、勒党花椒、孪花蟛蜞菊的干燥物粉碎成粗粉，通过20目筛，然后按照重量比2:2:1混合。（2）提取：将干燥的小冠熏、勒党花椒、孪花蟛蜞菊粗粉置于破碎提取器的容器内，加入折合原料重量比7倍量的95％含水乙醇进行室温组织破碎提取 3次，提取时间为4分钟。（3）闪蒸浓缩：将提取液抽滤，弃去滤渣，得到的提取液在70℃以下采用真空薄膜浓缩装置进行闪蒸浓缩至原体积的 1/8。（4）乙醚萃取部位的制备：将浓缩液分散到水中，水的用量为浓缩液体积的三分之一。用乙醚萃取3次，每次用量为浓缩液体积的 2倍量，静止分层后，分去乙醚层，合并乙醚萃取液，在旋转蒸发仪中，常压浓缩蒸馏，蒸出乙醚，得到乙醚浓缩液。继续将浓缩液进行真空干燥成干粉，用研钵研细后得到乙醚提取物干粉，乙醚提取物收率达到 14.1％（5）乙酸乙酯萃取部位的制备：将乙醚萃取后，分出的水层浓缩液，改用乙酸乙酯萃取。用乙酸乙酯萃取4次，每次用量为浓缩液体积的 2倍量，静止分层后，分去乙酸乙酯层，合并乙酸乙酯萃取液，在闪蒸浓缩装置中，60℃以下真空减压浓缩，蒸出乙酸乙酯，得到乙酸乙酯浓缩液。继续将浓缩液进行真空干燥成干粉，用研钵研细后得到乙酸乙酯提取物干粉，乙酸乙酯提取物收率达到 16.5％。（6）将步骤4）的乙醚提取物干粉和步骤5）中的乙酸乙酯提取物干粉按照重量比1:1.5混合，得到抗真菌天然活性物质。

以下结合相应的试验对本发明作进一步说明。

试验1：抗植物病原真菌活性测定。

将配好的PDA(马铃薯 300 g、葡萄糖 20 g、琼脂 15-20 g、蒸馏水 1000 mL)湿法灭菌后，在超净台上将凝固的PDA加热融化，趁热将700 μL 的PDA导入2 mL的离心管中，倾斜放置，制作成斜面，冷却，凝固后形成斜面培养基，备用。采用二倍稀释法将样品用DMSO做溶剂配置成不同浓度梯度。

将配置好的样品用移液枪移入试管中的PDA表面上，每次进样量为40 μL，并立刻摇匀，使其均匀接触PDA表面。阴性对照组只在PDA表面加DMSO，空白组在PDA表面不加样品。

采用斜面试管法测定抗菌活性，根据最低抑菌浓度MIC值判断抑菌能力。将乙醚萃取物和乙酸乙酯萃取物分别用95%乙醇稀释至将不同样品用DMSO做溶剂配置成250、125、62.5、31.25、15.625、7.813、3.906、1.953、0.977、0.488 μg·mL^-110个浓度梯度的样品稀释液，最高浓度为250 μg·mL^-1，最低浓度为0.488 μg·mL^-1，先用最高浓度和最低浓度进行初筛，再逐一分别进行细筛。

将配置好的样品等剂量放入试管中的PDA表面上，摇匀，阴性对照组只在PDA表面加DMSO，空白组在PDA表面不加样品。将8种植物病原真菌在培养皿中培养、打孔，再将打好孔的真菌分别放入上述配好样品溶液的试管中，在培养箱中培养48 h后，根据是否长菌来继续调节样品的浓度。据观察，空白组和阴性对照组的每个浓度梯度的真菌均生长良好。以不长菌的样品最低浓度做为最低抑菌浓度MIC。

以斜面试管法测定样品的抗菌活性。乙醚萃取部位和乙酸乙酯萃取部位对8种植物病原真菌的最低抑菌浓度的MIC值见表1。MIC值越小，抑菌活性越好。

表1表明：乙醚萃取物对8种植物病原真菌的最低抑菌浓度MIC值在0.977-31.25 μg · mL^-1 之间，特别是对玉米大斑病菌和棉花枯萎病菌；乙酸乙酯萃取物对8种植物病原真菌的最低抑菌浓度MIC值在7.813 -125 μg · mL^-1 之间尤其是对番茄灰霉病菌、小麦赤霉病菌和大麦赤霉病菌，说明两个萃取部位对8种植物病原真菌均具有较强的抑制作用。两萃取部位按照重量比1:1混合后的混合物对8种植物病原真菌的抑制作用更加显著，说明乙醚萃取部位和乙酸乙酯萃取部位混合具有协同和增效的效果，对真菌的抑菌作用更加显著；两部位按照重量比1:2、1:3或1:1.5混合后也能达到本发明所述的有益效果。

试验2：抗人体表皮感染测定试验。

选择患有常年患有脚气和皮肤癣的人群，人数为20人，每天涂抹本发明的制剂2次，每次涂抹2 min，坚持涂抹两个月，试验效果见见表2-3。

表2 实施例1-4对脚气的试验结果

实施例	试验人数	痊愈	有效	无效	总有效率(%)
						实施例1	20	12	7	1	95
实施例2	20	13	6	1	95
						实施例3	20	14	6	0	100
实施例4	20	13	5	2	90

表3 实施例1-4对皮肤癣的试验结果

实施例	试验人数	痊愈	有效	无效	总有效率(%)
						实施例1	20	4	15	1	95
实施例2	20	5	14	1	95
						实施例3	20	4	14	2	90
实施例4	20	3	16	1	90

表2和表3表明：实施例1-4对患有脚气和皮肤癣的人群，用药2个月后治疗效果明显，总有效率超过90%。

Claims (8)

1.一种抗真菌天然活性物质的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）粉碎混合：分别将小冠熏、勒党花椒、孪花蟛蜞菊的干燥物粉碎成粗粉，通过20-40目筛，然后按照重量比1-4:1-4:0.2-2混合均匀；

2）提取：将干燥的小冠熏、勒党花椒、孪花蟛蜞菊粗粉置于破碎提取器的容器内，按照混合物粗粉1kg则95％含水乙醇的用量为6-10升的比例加入含水乙醇进行室温组织破碎提取2-3次，每次提取时间为1-5分钟；

3）闪蒸浓缩：将提取液抽滤，弃去滤渣，得到的提取液在60-80℃采用真空薄膜浓缩装置进行闪蒸浓缩至原体积的1/5-1/8；

4）乙醚萃取部位的制备：将浓缩液分散到水中，水的用量为浓缩液体积的1/2-1/4，然后用乙醚萃取2-5次，乙醚每次用量为浓缩液体积的1-2倍量，静止分层后，分去乙醚层，合并乙醚萃取液，在旋转蒸发仪中，常压浓缩蒸馏，蒸出乙醚，得到乙醚浓缩液；继续将浓缩液进行真空干燥成干粉，用研钵研细后得到乙醚提取物干粉；

5）乙酸乙酯萃取部位的制备：将乙醚萃取后，分出的水层浓缩液，改用乙酸乙酯萃取，用乙酸乙酯萃取2-5次，乙酸乙酯每次用量为浓缩液体积的1-2倍量，静止分层后，分去乙酸乙酯层，合并乙酸乙酯萃取液，在闪蒸浓缩装置中，50-70℃真空减压浓缩，蒸出乙酸乙酯，得到乙酸乙酯浓缩液；继续将浓缩液进行真空干燥成干粉，用研钵研细后得到乙酸乙酯提取物干粉；

6）将步骤4）的乙醚提取物干粉和步骤5）中的乙酸乙酯提取物干粉按照重量比1:1-3混合，得到抗真菌天然活性物质。

2.如权利要求1所述的一种抗真菌天然活性物质的制备方法，其特征在于步骤1）中：小冠熏粗粉、勒党花椒粗粉、孪花蟛蜞菊粗粉的重量比为1-3:1-3:0.5-1.5。

3.如权利要求1所述的一种抗真菌天然活性物质的制备方法，其特征在于步骤1）中：小冠熏粗粉、勒党花椒粗粉、孪花蟛蜞菊粗粉的重量比为1.5-2.5:1.5-2.5:0.8-1.2。

4.如权利要求1所述的一种抗真菌天然活性物质的制备方法，其特征在于步骤1）中：小冠熏粗粉、勒党花椒粗粉、孪花蟛蜞菊粗粉的重量比为2:2:1。

5.如权利要求1所述的一种抗真菌天然活性物质的制备方法，其特征在于步骤2）中：按照混合物粗粉1kg则95％含水乙醇的用量为7-9升的比例加入含水乙醇进行室温组织破碎提取。

6.如权利要求1所述的一种抗真菌天然活性物质的制备方法，其特征在于步骤3）中：真空浓缩温度为65-75℃，浓缩液浓缩至原体积的1/6-1/7。

7.如权利要求1所述的一种抗真菌天然活性物质的制备方法，其特征在于步骤4）中：水的用量为浓缩液体积的1/3，乙醚每次用量为浓缩液体积的1.5倍量。

8.如权利要求1所述的一种抗真菌天然活性物质的制备方法，其特征在于步骤5）中：乙酸乙酯每次用量为浓缩液体积的1.5倍量，真空减压浓缩的温度为55-65℃。